趙偉　宋歌

摘要：?jiǎn)卧隼钏固鼐鷮儆诘湫偷母锾m氏陽(yáng)性致病菌，是一種嚴(yán)重的人畜共患食源性致病菌。由于生物被膜的形成使得對(duì)單增李斯特菌的防治變得更加困難。本試驗(yàn)首先將單增李斯特菌加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板恒溫培養(yǎng)48 h進(jìn)行生物被膜培養(yǎng)，然后分別加入終濃度為10 μg/ml、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL的光甘草定孵育后，于6 h后提取單增李斯特菌eDNA并測(cè)定其含量變化情況。同時(shí)利用結(jié)晶紫染色法觀察不同濃度的光甘草定作用2 h、4 h、6 h和8 h后單增李斯特菌生物被膜形成的影響情況。結(jié)果顯示光甘草定對(duì)單增李斯特菌eDNA和生物被膜形成均有一定的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察光甘草定濃度下單增李斯特菌生物被膜的形成情況，為甘草抗菌能力的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用以及單增李斯特菌的防治提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)卧隼钏固鼐?；生物被膜；光甘草?/p>

中圖分類(lèi)號(hào)：S 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2096-3637（2017）06-0004-03

單增李斯特菌是一種人畜共患食源性病原菌，它主要以食物為傳染媒介，廣泛存在于自然界及各種食品中，且在4°C環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，可引起人、畜感染發(fā)病，死亡率高。食用了被單增李斯特菌污染的食物后可以引起李斯特菌病，李斯特菌中毒嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染。近年來(lái)，李斯特菌病在世界范圍內(nèi)都有發(fā)生，且發(fā)病具上升趨勢(shì)，引起國(guó)內(nèi)外廣泛重視。因此，單核細(xì)胞增生性李斯特菌不僅對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要影響，而且對(duì)人們的健康帶來(lái)危害。

1 李斯特菌生物被膜

李斯特菌作為1種食源性疾病病原菌，因其分布廣泛、致病率致死率較高而惡名遠(yuǎn)揚(yáng)外，還因其會(huì)在食品、瓜果蔬菜等接觸表面吸附聚集分泌生物被膜，而對(duì)人類(lèi)的清除防疫措施帶來(lái)了很大的麻煩。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)態(tài)條件下，單增李斯特菌的生物被膜三維球形網(wǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)，對(duì)理化因子、抗生素、殺菌劑等具有極強(qiáng)的抵抗力[1]。

許多研究證實(shí)了李斯特菌可以形成生物被膜，李燕杰等比較研究了銀染法、結(jié)晶紫染色法、掃描電鏡法3種不同方法定性觀察李斯特菌生物被膜的效果。研究表明，3種方法均可定性觀察李斯特菌生物被膜。在另一項(xiàng)研究中，李燕杰等采用微孔平板和結(jié)晶紫染色法觀察不同培養(yǎng)條件下單增李斯特菌生物被膜的形成與生長(zhǎng)。研究表明，李斯特菌在35°C，中性略偏堿性條件下，TSB培養(yǎng)6～8 h可形成穩(wěn)定的生物被膜。單增李斯特菌的生物被膜主要分為胞外基質(zhì)和菌體，而胞外基質(zhì)又是由胞外DNA胞外蛋白和胞外多糖等組成[2]。單增李斯特菌生物被膜的形成受到胞外DNA胞外多糖、鞭毛糖蛋白、胞外結(jié)合蛋白和群感應(yīng)系統(tǒng)等的影響[3]。鞭毛在生物被膜的形成中起著關(guān)鍵的作用，介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)使浮游單增李斯特菌的游動(dòng)、非活性物體表面的附著、單增李斯特菌的個(gè)體從載體表面的擴(kuò)散、與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用。鞭毛蛋白中的5種基因FlaR（鞭毛調(diào)節(jié)因子）、PrfA（正調(diào)控因子）、DegU（降解酶調(diào)節(jié)因子）、MogR（運(yùn)動(dòng)基因調(diào)節(jié)因子）和GmaR（糖基轉(zhuǎn)移酶和運(yùn)動(dòng)抑制子）。

有研究表明，胞外DNA與單增李斯特菌的最初粘附和早期形成有關(guān)[4]，主要是與胞外多糖結(jié)合后對(duì)生物被膜的形成造成影響單增李斯特菌染色后可觀察到細(xì)胞周?chē)嬖谥旅艿陌舛嗵?，目前?duì)于胞外多糖和胞外結(jié)合蛋白對(duì)于單增李斯特菌的生物被膜的影響的研究不是很清楚，但是有研究發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌胞外蛋白在單增李斯特菌最初聚集到介質(zhì)表面起重要作用[5] 細(xì)菌群中細(xì)菌通過(guò)信息交流來(lái)感覺(jué)、整合、處理環(huán)境的現(xiàn)象稱(chēng)為群體感應(yīng)。單增李斯特菌存在兩個(gè)群體感應(yīng)體系。為寡肽介導(dǎo)的 Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)和自誘導(dǎo)2（AI-2）LuxS群體感應(yīng)系統(tǒng)，Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)可直接正調(diào)控生物膜的形成，也可通過(guò)調(diào)控耐藥、毒力因子間接調(diào)控生物被膜的形成[6]。正因單增李斯特菌的致病率高、危害性大、易產(chǎn)生耐藥性、易在物體表面形成生物被膜，而對(duì)人類(lèi)的生產(chǎn)生活帶來(lái)危害，為人類(lèi)的對(duì)李斯特菌病預(yù)防和清理帶來(lái)危害。

2 研究的目的和意義

由于李斯特菌在自然界中廣泛存在，并可以形成生物被膜，使得李斯特菌對(duì)外界環(huán)境的抵抗力大大增強(qiáng)，且80%李斯特菌病的發(fā)生又是由生物被膜引起的。生物被膜引起的細(xì)菌多重耐藥性給臨床治療帶來(lái)了巨大的困難。而光甘草定（Glabridin）是中藥甘草的主要成分，是從藥用植物甘草根、莖中提取的一種具有高甜度、低熱量、安全無(wú)毒的有效活性成分，具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用，在各種疾病的臨床治療上取得確切療效。本研究通過(guò)觀察光甘草定在不同濃度下，對(duì)單增李斯特菌生物被膜的形成情況，以初步探討光甘草定對(duì)單增李斯特菌生物被膜的抗菌活性，為甘草抗菌能力的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用以及李斯特菌病的防控提供理論依據(jù)。

3 材料與方法

3.1 材料

3.1.1材料來(lái)源

光甘草定為洛陽(yáng)藍(lán)冰貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。單增李斯特菌21634購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

3.1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱（青島龍杰儀器公司）、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、高壓滅菌鍋（購(gòu)于上海三申）、溫箱（購(gòu)于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、冰箱（購(gòu)于揚(yáng)子集團(tuán)）、超凈工作臺(tái)（購(gòu)于蘇州爭(zhēng)化設(shè)備公司）、電子天平（購(gòu)于北京賽多利斯天平有限公司）、THZ-92C氣浴恒溫振蕩器 數(shù)碼鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9070 MBE上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、分光光度計(jì)、平皿若干、1.5mL EP管、10 μL槍頭若干、200 μL槍頭、1 mL槍頭、1.5 mL EP管架、細(xì)菌培養(yǎng)瓶若干、大小瓶塞若干、酒精燈、電磁爐、剪刀、鑷子、接種環(huán)、錐形瓶若干、量筒、250 mL試劑瓶若干、100mL試劑瓶若干、一次性手套，醫(yī)用膠帶、脫脂棉、封口薄膜等。

3.2 主要試劑的配制

（1） LB液體培養(yǎng)基：NaCl 1.0 g、蛋白胨 1.0 g和酵母提取物0.5 g充分溶解于蒸餾水100 mL，120°C高壓滅菌30 min，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）10 mg/mL光甘草定溶液：0.03 g光甘草定充分溶解于3 mL PBS中。

（3）結(jié)晶紫溶液：稱(chēng)取0.04 g結(jié)晶紫溶解10 mL蒸餾水。

（4）0.5M EDTA：稱(chēng)取186.1g EDTA-Na2·2H2O，置于燒杯中，加入800 mL蒸餾水，用NaOH調(diào)pH至8.0，然后用蒸餾水定容到1L，滅菌后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3實(shí)驗(yàn)方法

3.3.1 細(xì)菌復(fù)蘇

把超凈工作臺(tái)的紫外燈打開(kāi)，將試管、LB液體培養(yǎng)基放入工作臺(tái)，消毒滅菌20～30 min，然后點(diǎn)燃酒精燈，在酒精燈旁完成實(shí)驗(yàn)，消毒灼燒空試管口，消毒培養(yǎng)液瓶口、到入1/3左右。從-80°C冰箱取出單增李斯特菌，接種環(huán)灼燒放涼后沾菌，加入試管。用過(guò)的接菌環(huán)、試管蓋上紙蓋子封口，用報(bào)紙包好，放入THZ-92C氣浴恒溫震蕩器過(guò)夜（37°C 12 h），整理超凈工作臺(tái)。

3.3.2 菌液轉(zhuǎn)接與生物被膜培養(yǎng)

將復(fù)蘇好的細(xì)菌從恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱內(nèi)取出，觀察小試管內(nèi)的細(xì)菌的情況，細(xì)菌的形態(tài)，色澤，透明度等，在凈化操作臺(tái)中，取錐形瓶加入3 mL菌液。再加入27 mL新鮮LB液體培養(yǎng)液，用200 μL移液器加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，用保鮮膜纏繞，確保96孔板上下兩個(gè)半殼之間的空隙被密封，在底部放置濕潤(rùn)的毛巾，置于特定的容器內(nèi)，放在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h。

3.3.3 甘草成分對(duì)單增李斯特菌生物被膜eDNA的影響

按上述方法培養(yǎng)生物被膜，用PBS將光甘草定配制成濃度為10 mg/mL。往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入光甘草定使終濃度為10 μg/ml、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，同時(shí)做空白對(duì)照孔，每孔重復(fù)3次，作用6 h后按Rice等介紹的方法提取并檢測(cè)eDNA。

（1）加入0.5M EDTA預(yù)冷1 h；

（2）用700 μL 50 mM TEN緩沖液重懸生物被膜，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，4°C，18000 rpm離心5 min；

（3）將上清轉(zhuǎn)入新的離心管，加入300 μL TE緩沖液，加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25： 24： 1）；

（4）4°C，12000 rpm離心10 min，取上清，用氯仿：異戊醇（24：1）再次萃取；

（5）取水相，加入3倍體積的冷乙醇和1/10體積的醋酸鈉，混勻后-20°C過(guò)夜；

（6）4°C，18000 rpm離心20 min，去上清，用70%冷乙醇洗滌，空氣中風(fēng)干后，加入20 μL TE緩沖液溶解；用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280的吸光度比。

3.3.4 甘草各成分對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成的影響

按上述方法培養(yǎng)單增李斯特菌生物被膜。用PBS將光甘草定配制成濃度為10 mg/mL。往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入光甘草定使終濃度為10 μg/ml、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，同時(shí)做空白對(duì)照孔，每孔重復(fù)3次，分別作用2 h、4 h、6 h和8 h后用PBS洗去浮游菌，洗3次，加入0.04%結(jié)晶紫染色30 min，用自來(lái)水洗去浮色，待膜干后，每孔用200 μL乙醇溶解，于570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，記錄結(jié)果。

4 結(jié)果及分析

4.1 對(duì)單增李斯特菌生物被膜eDNA的影響

eDNA的相對(duì)表達(dá)量就是對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成多少的直接反映。圖1可以看出，光甘草定對(duì)單增李斯特菌生物被膜存在抑制作用，且隨著光甘草定濃度的增加，對(duì)單增李斯特菌生物被膜的抑制作用逐漸增強(qiáng)（圖1）。

4.2 對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成的影響

從圖2可以看出，光甘草定對(duì)單增李斯特菌的生物被膜形成具有抑制作用。隨著光甘草定濃度增大，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)明顯在減小，說(shuō)明光甘草定濃度增大對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成的抑制作用明顯增強(qiáng)。同時(shí)在某一濃度時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，光甘草定對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成的抑制作用也有所增強(qiáng)。

5 討論

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，任何實(shí)驗(yàn)濃度的光甘草定均表現(xiàn)出的是對(duì)單增李斯特菌生物被膜的抑制作用。通過(guò)數(shù)據(jù)的平穩(wěn)降低和曲線的持續(xù)下降，表明光甘草定對(duì)生物被膜有持續(xù)的影響作用，并且還隨著濃度的增加，抑制作用還越來(lái)越強(qiáng)。進(jìn)過(guò)近年的實(shí)驗(yàn)研究成果觀察，抑制的機(jī)理可能是影響可細(xì)菌的生長(zhǎng)。有實(shí)驗(yàn)證明，光甘草定對(duì)酪氨酸酶的活性有一定的影響作用。因此有可能是在細(xì)菌的新陳代謝階段，某一種或者某幾種酶活性受到干擾，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)受阻，因此生物被膜的形成被影響。也有可能是的結(jié)構(gòu)到破壞。導(dǎo)致細(xì)菌無(wú)法完成特定的生理過(guò)程，因此無(wú)法完成正常的生物被膜的構(gòu)建。也有很多實(shí)驗(yàn)證明光甘草定具有一定程度的抗菌和抗癌作用。因此光甘草定可能還有其他的影響生物被膜形成的機(jī)理。

6 結(jié)論

10～200 μg/mL光甘草定隨著濃度的增加對(duì)單增李斯特菌生物被膜的抑制作用增強(qiáng)，且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用增強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)

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