黃燦燦　鄧昌俊　陳培林　王紹引　曾紅亮　張怡

摘 要 采用響應面法對金柑果皮精油超聲波輔助提取提取工藝條件進行優(yōu)化，并對金柑果皮精油的抑菌和抗氧化活性進行評價。結果表明，金柑果皮精油超聲波輔助提取的最佳工藝條件為：液料比27 ∶ 1 mL/g、超聲時間1.25 h、超聲波功率300 W。在此條件下，金柑果皮精油得率為2.24%，與理論預測值基本一致。金柑果皮精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、黑曲霉、酵母菌均有一定抑制作用，最小抑菌濃度分別為1.0%、0.5%、0.5%、0.5%、0.1%?？寡趸钚越Y果表明，金柑果皮精油對食用油脂的貨架期有一定的延緩作用，具有一定的清除羥自由基、DPPH自由基的能力和總抗氧化能力。

關鍵詞 金柑；果皮精油；超聲波；抑菌活性；抗氧化活性

中圖分類號 TQ644.14；S666.2 文獻標識碼 A

Abstract The ultrasonic extraction technology of kumquat peel essential oil was optimized by a response surface methodology， and its antibacterial， antioxidant activity was further investigated. The optimal extraction conditions were as follows： liquid-material ratio of 27 ∶ 1 mL/g， ultrasonic time of 1.25 h， ultrasonic power of 300 W. Under the conditions， the yield of kumquat peel oil was 2.24%， which was consistent with the predicted value. Kumquat peel essential oil displayed effective antibacterial activity for Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Salmonella， Aspergillus niger and Saccharomycetes， and the minimal inhibitory concentrations was 1.0%， 0.5%， 0.5%， 0.5%， 0.1%， respectively. Based on the investigation of the antioxidant activity for kumquat peel essential oil， it indicated the kumquat peel essential oil could delay the shelf life of edible oil and had a certain ability to remove hydroxyl radicals， DPPH free radicals and total antioxidant capacity.

Key words Kumquat peel； essential oil； ultrasonic extraction； antibacterial activity； antioxidant activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.026

金柑[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]，又名金桔，屬于蕓香科柑橘屬，原產(chǎn)于中國，是中國特產(chǎn)果樹之一，有1 600多年栽培歷史[1]。金柑營養(yǎng)豐富，富含多糖、檸檬苦素、多酚和精油等活性物質。金柑多糖具有降血脂[1]、抑菌[2]、抗氧化[2]等功效。金柑果皮近表皮組織中會產(chǎn)生大量油胞，油胞內(nèi)含有大量的金黃色色素和芳香油等，其油質溫和，質量為柑橘類精油之最[3]。柑橘果皮加工的重要途徑之一便是精油的提取，柑橘皮渣或質次的柑橘整果經(jīng)過適當?shù)奈锢?、化學處理，可得到具有很高使用價值的柑橘精油[4-5]。

柑橘類精油是天然植物精油中重要的一類，其氣味清新令人愉悅，廣泛地使用在食品、醫(yī)藥、日化產(chǎn)品等行業(yè)[5]。柑橘精油中含有多種低分子的抗菌物質和抗氧化成分，作為果蔬類天然保鮮劑，能有效地抑菌防腐[6]。傅維擎等[7]報道金柑果皮精油功能團鑒定結果表明，金柑果皮精油含有醇類、醛酮類、不飽和脂肪酸，不含酚類、羧酸衍生物。章斌等[8]利用水蒸氣蒸餾法提取檸檬果皮精油，結果表明，其有較好的抗氧化性，并對6種微生物有抑制作用。吳均等[9]測定甜橙精油有較強的抗氧化性和抑菌作用。王紹引等[10]報道金柑果皮精油對桔小實蠅雌蟲均有顯著的引誘活性。精油的提取大多以水蒸氣提取法為主，如姜敏[4]利用水蒸氣提取柑橘果皮精油，其萃取時間長、效率低。超聲波強化溶劑萃取法萃取精油，即在傳統(tǒng)有機溶劑萃取精油的基礎上，加入超聲波處理，利用超聲波空化、振動、粉碎等綜合效應破壞細胞壁，加速化學成分溶出，節(jié)約了能源，縮短了提取時間[6]。但有關超聲波強化溶劑萃取法萃取金柑果皮精油的研究尚未見報道[9-13]。

因此，筆者在考察料液比、超聲時間和超聲功率等因素對金柑果皮精油得率影響的基礎上，采用響應面法對金柑果皮精油超聲波輔助提取工藝條件進行優(yōu)化，并對所得金柑果皮精油的抑菌和抗氧化活性進行評價。該研究為金柑果皮精油的綜合開發(fā)利用提供了一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 金柑皮，由尤溪縣農(nóng)業(yè)局提供；菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、沙門氏菌（Salmonella），均由福建農(nóng)林大學甘蔗研究所實驗室提供。抑制羥自由基試劑盒、抗超氧陰離子試劑盒和總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒，均購自南京建成生物研究所。

1.1.2 主要儀器 KQ2200DE型三頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-5299型旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；H-1850R臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Phs-3C型精密pH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 果皮精油提取工藝優(yōu)化 （1）金柑果皮精油提取工藝。金柑果皮→粉碎→過篩→稱重→加入萃取劑→超聲波輔助浸提→料液分離（抽濾）→混合濾液→旋轉蒸發(fā)→加乙醇溶解→放入-15 ℃冰箱冷凍24 h→離心去除脂狀物質→過濾→濾液進行真空濃縮。金柑果皮精油得率計算公式如下：金柑果皮精油得率=果皮精油質量/果皮粉末質量×100%。

（2）單因素試驗。取10 g金柑果皮，以金柑果皮精油得率為指標，研究液料比（mL/g），超聲時間（h），超聲波功率（W）對金柑果皮精油得率的影響。分別選取液料比10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1、30 ∶ 1、35 ∶ 1 mL/g，超聲時間0.5、1、1.5、2、2.5 h，超聲波功率60、120、180、240、300、360 W進行單因素試驗。

（3）響應面優(yōu)化試驗。在單因素實驗基礎上，以精油提取率（Y）為目標函數(shù)，應用Box-Behnken Design的中心組合實驗設計，各因子編碼水平見表1。表1中A=（X1-25）/5；B=（X2-1）/0.5；C=（X3-270）/30。

（4）驗證試驗。根據(jù)響應面預測的最佳提取工藝條件，確定金柑果皮精油得率，以驗證響應面預測的準確性。

1.2.2 果皮精油抑菌試驗 （1）菌種活化和菌懸液的制備。參照曾紅亮等[14]研究方法。

（2）果皮精油抑菌圈測定。參照曾紅亮等[14]研究方法。

（3）果皮精油最小抑菌濃度測定。最小抑菌質量濃度（MIC）采用逐步稀釋法進行測定。具體操作步驟為：將制備好的金柑果皮精油按比例加入30 ℃左右的液體培養(yǎng)基中，最終培養(yǎng)基含有精油的濃度百分比分別為2.0%、1.5%、1%、0.5%、0.1%、0。取10 mL混合物注入試管，以不添加金柑果皮精油的培養(yǎng)基作空白對照。將適宜濃度菌種接種在試管的液體培養(yǎng)基中，細菌37 ℃、18 h，真菌28 ℃、36 h培養(yǎng)，進行觀察?？梢种萍毦霈F(xiàn)明顯增長的最低精油濃度即為MIC。

1.2.3 果皮精油抗氧化試驗 （1）果皮精油在油脂體系中抗氧化活性。分別在具塞磨口瓶中，加入預處理好的熬制豬油和橄欖油各100 g和不同量的金柑果皮精油，攪拌均勻后，置于70 ℃的烘箱中保存，每隔24 h攪拌l次并交換它們在烘箱里的位置，每隔2天取樣測定其過氧化值（POV）。以POV值的大小衡量精油的抗氧化活性。每個樣品重復3次，取平均值。POV的測定按照GB/T 5538-2005方法進行。

（2）果皮精油總抗氧化能力（T-AOC）。參照吳均等[9]實驗方法，以Vc作為陽性對照。總抗氧化能力=[（OD樣品-OD對照）/0.01]÷30×N×n。

（3）果皮精油羥自由基測定。參照章斌等[8]實驗方法，以Vc作為陽性對照。抑制羥自由基能力=[（OD對照-OD測定）/（OD標準-OD空白）]×樣品標準濃度÷（待測樣品蛋白濃度×取樣量）。

（4）金柑果皮精油DPPH測定。參照章斌等[8]實驗方法，以Vc作為陽性對照。DPPH自由基清除率=[1-（A樣品-A空白）]/A對照×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert 8.06軟件對精油提取數(shù)據(jù)進行處理，并對模型進行顯著性分析；采用DPS 9.05對抑菌效果數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素水平的確定

2.1.1 液料比對金柑果皮精油得率的影響 由圖1可知，在液料比為10 ∶ 1～25 ∶ 1 mL/g時，金柑果皮精油得率隨著液料比的增大而顯著提高，這可能是由于金柑果皮和萃取劑之間充分接觸使精油加速從果皮細胞中溶出[11]。繼續(xù)增大液料比至30 ∶ 1，得率趨于平穩(wěn)未有明顯變化；當液料比為25 ∶ 1時，得率最大。因此，液料比選取為25 ∶ 1 mL/g較為合適。

2.1.2 超聲時間對金柑果皮精油得率的影響 由圖2可知，當?shù)脮r間小于1 h時，隨著時間的增加，金柑果皮精油的得率在不斷增大，超聲時間大于1 h時，得率已基本趨于穩(wěn)定。這可能是因為隨著超聲時間的增加，超聲波充分作用于金柑果皮細胞壁使其破裂從而使精油釋放到萃取劑中。超聲時間越長，金柑果皮細胞壁在超聲波空化作用下被破壞程度越大[2]。當超聲波處理到一定時間后，金柑果皮細胞壁破裂程度不再增加，所以得率隨著時間的增加趨于平穩(wěn)。因此，超聲時間選擇為1 h為宜。

2.1.3 超聲功率對金柑果皮精油得率的影響 由圖3可知，在試驗選取的超聲波功率區(qū)間內(nèi)，隨著超聲功率的增大，得率在顯著增大。隨著超聲波功率的增加，超聲波的空化作用和機械剪切作用增強，分子擴散速度增加，有利于精油的得率[11]。因此，超聲波功率選擇為300 W。

2.2 響應面分析

2.2.1 分析因素的選取及分析方案 根據(jù)單因素試驗結果，以液料比（mL/g）、超聲時間（h）、超聲功率（W）為決策變量，以精油得率（%）為目標函數(shù)，應用Design Expert 8.06軟件響應面回歸試驗設計，試驗設計與結果見表2。

2.2.2 模型的建立與顯著性分析 回歸模型的方差分析、各項的方差分析和參數(shù)估計及顯著性分析的結果分別見表3。利用Design Expert 8.06軟件對上述結果進行分析，得金柑果皮精油得率對液料比（A）、超聲波得時間（B）、超聲波得功率（C）的二次多項回歸方程為：Y=1.98+0.25×A+0.12×B+0.10×C+0.059×A×B-0.10×A×C+0.059×B×C-0.22×A2-0.054×B2-0.029×C2。

從方差分析結果可知，實驗所選用模型p值為<0.000 1，表明該回歸模型達極顯著水平；在一次項中，A、B和C對精油得率的影響達到極顯著；在交互項中，AC對精油的得率影響達到極顯著水平，AB和BC對精油的得率影響達到顯著水平；在二次項中，A2對精油得率達到極顯著水平，B2對精油得率達到顯著水平；失擬項不顯著，并且該模型的相關系數(shù)R2=0.975 8，變異系數(shù)CV=3.98%，說明響應值的變化97.58%來源于所選變量，該值接近于100%，這表明模型可以較好地解釋實際試驗中金柑果皮精油得率的變化。因此，該回歸模型能較好地描述各因素（液料比、超聲波功率、超聲時間）與金柑果皮精油得率之間的實際關系，可用于最佳超聲波得金柑果皮精油工藝參數(shù)的確定。

2.2.3 響應面圖和等高線圖分析 綜合圖4～6可知，液料比和超聲時間交互作用、液料比和超聲波功率交互作用、超聲時間和超聲波功率交互作用對金柑果皮精油得率影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面較陡，這與方差分析結果一致。在液料比和超聲波時間、液料比和超聲波功率交互作用中，當其他因素條件固定時，精油的得率起初隨著液料比的增大而增大，當液料比超過一定值時，精油得率隨著液料比增大而下降。這可能主要是一定范圍內(nèi)液料比的增加會相應地增大溶劑與原料的接觸面積，同時增大固液壓差，致使擴散速度得到提高；但是當液料比過大時，精油在溶劑中的溶解量增加，降低了精油的得率[15]。在超聲時間和超聲波功率相互作用中，其他因素條件固定時，精油得率隨著超時間的增加而增大，當超聲時間超過一定值時，精油得率上升趨勢變緩；這可能是由于在一定時間內(nèi)超聲波處理提高了精油分子運動頻率和速度，且由于超聲波的機械剪切作用和空化效應破壞了精準果皮細胞壁加速了精油分子從細胞中溶出，但超聲時間超過一定值時，超聲波可能會破壞精油分子結構，降低得率[16]。

2.2.4 金柑果皮精油提取工藝的確定 由回歸方程可知，超聲波強化溶劑萃取金柑果皮精油的最優(yōu)條件為：液料比27.4 ∶ 1 mL/g，超聲時間1.25 h，提取功率300 W。該條件下超聲波強化溶劑萃取金柑果皮精油的理論得率為2.22%。結合回歸模型，并根據(jù)實際操作條件調(diào)整選用液料比27 ∶ 1 mL/g、超聲時間1.25 h、提取功率300 W，重復試驗3次，得金柑果皮精油的平均得率為（2.24±0.02）%，與理論預測值基本一致，說明回歸模型可靠。

2.3 金柑果皮精油抑菌作用

植物精油中含有醇類、醛類、酸類、酚類、丙酮類、萜烯類物質，這些物質可以影響細胞膜滲透性，導致細胞膜的通透性發(fā)生改變，細胞內(nèi)容物外泄，甚至維持細胞生命的大分子或遺傳物質外泄，最終導致細胞死亡[17]。精油抑菌圈實驗結果的判定標準為：抑菌圈直徑>15 mm為最敏感，10～15 mm 為中度感，7～9 mm時為低度敏感，無抑菌圈者為不敏感[8]。由表4和圖7可知，金柑果皮精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母的抑菌抑菌圈直徑均>15 mm，均屬最敏感：對黑曲霉、沙門氏菌的抑菌圈處于10～15 mm 之間，屬于中度敏感；且抑制作用強弱順序依次為：大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>啤酒酵母>沙門氏菌>黑曲霉。綜上所述：金柑果皮精油具有廣譜抗菌性，有廣闊的應用前景。

由表5可知，隨著精油濃度的降低，其對受試菌的抑制作用逐漸減弱。其中金柑果皮精油對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為1.0%，對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.5%，對沙門氏菌的最小抑菌濃度為0.5%，對黑曲霉的最小抑菌濃度為0.5%，對啤酒酵母的最小抑菌濃度為0.1%。植物精油的MIC越小，其抑菌活性越強。綜合上述實驗結果，金柑果皮精油對啤酒酵母的抑制性最好。劉笑宇[18]研究結果表明，肉桂精油對酵母菌的較好，其MIC小于其他受試微生物，這與本實驗結果相一致。

2.4 抗氧化試驗

2.4.1 金柑果皮精油添加量對油脂抗氧化效果的影響 由圖8～9可以看出，4組豬油樣品和橄欖油樣品的POV值均隨著時間的增加而變大，但添加了金柑果皮精油的橄欖油和豬油的POV值與空白相比均有下降，添加量越大，相同氧化時間油脂的POV值就越小，表明金柑果皮精油對2種油脂具有抗氧化延長儲藏期的效果，且添加量越大效果越明顯。金柑果皮精油對豬油和橄欖油均具有良好抗氧化作用，可能是由于金柑精油中富含醛類物質和萜烯類化合物[6]，其含有雙鍵結構，在貯存過程中先于油脂被氧化從而減緩了油脂的氧化過程。金柑果皮精油對橄欖油的抗氧化作用好于豬油。由圖9可知，隨著時間的推移精油添加量越高，其對橄欖油的抗氧化效果越好。

2.4.2 金柑果皮精油體外抗氧化的研究 由圖10可知，金柑果皮精油具有較高的抗氧化性；金柑果皮精油對DPPH自由基清除率能達到82.5%，明顯高于Vc對DPPH自由基的清除率；抑制羥自由基能力達到42.71 U/mL，略低于Vc對羥自由基的抑制能力；總抗氧化能力達到9.00 U/mL，明顯低于Vc的總抗氧化能力。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，被廣泛用于評價抗氧化物的體外抗氧化能力。植物精油中α-蒎烯、萜品烯、百里酚等組分可阻斷氧化反應的自由基鏈，使自由基形成穩(wěn)定狀態(tài)從而具有清除DPPH自由基的能力。傅維擎等[7]對金柑果皮精油功能團鑒定結果表明，金柑果皮精油含有醇類、醛酮類、不飽和脂肪酸，不含酚類、羧酸衍生物。其中α-蒎烯相對含量為4.31%，月桂烯相對含量為6.88%，β-蒎烯相對含量為3.6%，D-檸檬烯相對含量為72.9%。金柑果皮精油中α-蒎烯、檸檬烯等活性成分與自由基進行反應，使自由基形成穩(wěn)定狀態(tài)的成分。由于精油中含有多種活性成分，其清除DPPH自由基能力應該是各組分清除活性的加和作用結果；其自由基清除能力顯著高于Vc，可能是由于各活性成分起到了協(xié)同作用[17]。綜上所述，金柑果皮精油對DPPH自由基具有良好的清除作用，有一定的抑制羥自由基和總抗氧化能力。

3 討論

超聲波輔助提取精油具有簡單高效等優(yōu)點，王娟等[16]利用超聲波輔助提取茶樹花精油，結果顯示其他因素固定時，茶樹花精油的得率隨著超聲時間增加而增大，但達到一定值后，提取率隨著超聲時間的增加而略有降低；這與本實驗結果相一致。李佳橋等[19]利用響應面優(yōu)化超聲波輔助提取原花青素，結果顯示，液料比和超聲波功率對原花青素提取率影響較為顯著，超聲時間次之；這與本實驗結果相吻合。

章斌等[8]研究檸檬果皮精油對幾種微生物的抑制強弱順序為：大腸桿菌>枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>黑曲霉>根霉>釀酒酵母；Wang等[20]研究表明Crassifolia金桔果皮精油對微生物的抑制強弱順序為：大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌。對比以上二者研究，本實驗中金柑果皮精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用與以上二者的研究相一致，但MIC值略高于以上兩者。

Nouri等[21]研究表明伊朗金柑果皮精油對DPPH自由基有一定的清除能力。章斌等[8]證實檸檬果皮精油對豬油和花生油的貯藏期有一定的延緩作用，對羥自由基的清除能力最強，對DPPH自由基的清除能力次之。張蕾[11]研究也表明遂川金柑果皮精油對羥自由基清除能力最強，對DPPH自由基的清除能力弱于Vc。本實驗中金柑果皮精油對豬油的抗氧化能力、羥自由基的清除能力與上述研究結果相符；但對DPPH自由基的清除能力和以上三者實驗有一定程度的差別，究其原因可能是由于金柑品種或提取方法不同造成的精油成分差異所致，更深層次的原因有待進一步實驗探明。

本實驗以石油醚為萃取劑，以金柑果皮精油得率為指標，探究了液料比、超聲時間、超聲波功率對金柑果皮精油得率的影響，結果表明最優(yōu)提取工藝條件為：液料比27 ∶ 1 mL/g，超聲時間1.25 h，超聲波功率300 W，以此條件下，金柑果皮精油得率達（2.24±0.02）%。金柑果皮精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌性較高；對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、黑曲霉、釀酒酵母菌的最小抑菌濃度分別為1.0%、0.5%、0.5%、0.5%、0.1%?？寡趸钚詫嶒灲Y果表明，金柑精油在食用油脂中具有良好的抗氧化活性，對DPPH清除率能達到82.5%，抑制羥自由基能力達到42.71 U/mL，總抗氧化能力達到9.00 U/mL。

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