李怡 武春媛 李瑋 李勤奮

摘 要 從生產(chǎn)毒死蜱農(nóng)藥廠采集的活性污泥中分離篩選得到2株降解效率較高的毒死蜱降解菌，命名為D1、D3，根據(jù)表型特征、生理生化特性和16 S rRNA基因序列相似性分析，將其鑒定為蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）和副球菌屬（Paracoccus sp.）細菌。2株菌以最佳配比（1 ∶ 1.25）混合施用時，與單菌相比，毒死蜱降解效率可提高12%～26%；以混合菌株為研究對象，發(fā)現(xiàn)其對毒死蜱最適降解溫度為30 ℃，最適降解pH值為7.0，最適NaCl濃度為0.5%；混合菌株施入土壤后，可保持較高的定殖能力和降解效率。

關鍵詞 毒死蜱；降解菌株的分離鑒定；混合降解；降解特性

中圖分類號 S154.3 文獻標識碼 A

Isolation，Identification of Two Chlorpyrifos-degrading Strains and

Their Mixed Biodegradation Characteristics of Chlorpyrifos

LI Yi1，2， WU Chunyuan1，2， LI Wei1，2， LI Qinfen1，2 *

1 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

2 Danzhou Scientific Observing and Experimental Station of Agro-Environment， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract Two chlorpyrifos-degrading bacterium strains， D1 and D3， were isolated from the activated sludge of an insecticide factory. Based on the phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences， strain D1 was identified as Ochrobactrum sp.， strain D3 was identified preliminarily as Paracoccus sp.. When the mixed ratio of D1 ∶ D3 was 1 ∶ 1.25， the degradation rate of chlorpyrifos was improved by 12%-26%， significantly superior to that of single strain. The optimal temperature， initial pH and salt concentration of the medium for chlorpyrifos degradation by mixed D1 and D3 were 30 ℃， pH 7.0 and 0.5% NaCl， respectively. The high colonizing ability and chlorpyrifos-degrading rate of mixed D1 and D3 was maintained after the application of the bacterial solution into soil.

Key words Chlorpyrifos； isolation and identification of degrading-strain； mixed biodegradation； biodegradation characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.022

毒死蜱（chlorpyrifos），化學名稱為O，O-二乙基-O-（3，5，6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯，是美國陶氏益農(nóng)化學公司于1965年研發(fā)的一種高效、廣譜的硫代磷酸酯類殺蟲劑[1]。

隨著中國徹底停止甲胺磷、對硫磷、甲基對硫磷、久效磷等5種高毒有機磷農(nóng)藥的生產(chǎn)、流通和使用，毒死蜱作為替代高毒有機磷類農(nóng)藥的主要有機農(nóng)藥品種，在中國應用日益廣泛[2]。雖然毒死蜱屬于中毒農(nóng)藥，但對于多數(shù)水生生物、蜜蜂仍屬于高毒性物質(zhì)[3-4]；加之其作為一種異源有毒物質(zhì)，有較高的土壤吸附性及水體中較長的半衰期，會以食物鏈及地下水形式傳遞，對人體造成危害。近年來，殘留毒死蜱對動物造成的傷害及其降解等問題已經(jīng)引起人們的重視[5-7]。

土壤微生物的降解代謝作用是毒死蜱消失的最主要因素。國內(nèi)外已經(jīng)分離到很多能降解毒死蜱的細菌和真菌，如Rhodopseudomonas sp. 07-26，Bacillus cereus sp. HY-2與HY-4，Stenotrophomonas sp.，Hafnia sp.，Trichoderma sp.等[8-12]，并對降解毒死蜱的微生物代謝途徑有了一定的了解。但菌株在大田土壤修復中普遍由于無法復制實驗室培養(yǎng)環(huán)境，難以長時間保持數(shù)量優(yōu)勢，嚴重影響其發(fā)揮降解作用；對于土壤中難降解的有機污染物，因不同微生物的代謝方式可以互補，如采用定殖能力較高的混合菌株，將會提高降解效率[13]?；谏鲜鲈?，本研究試圖從活性污泥中分離鑒定降解效率較高、定殖能力較強的毒死蜱降解菌株，為毒死蜱污染土壤的治理提供新的資源和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

E. coli DH5α：本實驗室保存。

基礎鹽培養(yǎng)基（MSM，g/L）：NH4NO3 1.0、KH2PO4 0.5、K2HPO4 1.5、NaCl 1.0、MgSO4·7H2O 0.2，pH7.0。固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂。

LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10、去離子水1 000 mL。固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂。

毒死蜱原藥（95%）購自山東華陽農(nóng)藥化工集團有限公司。二氯甲烷（AR），甲醇（AR）購自上?；瘜W試劑廠。各種試劑標準品購自百靈威公司。

1.2 方法

1.2.1 毒死蜱降解菌株的分離與篩選 富集污泥取自海南某農(nóng)藥廠廢水處理池。在100 mL含50 mg/L毒死蜱的MSM培養(yǎng)基中加入5 g污泥，振蕩均勻，將富集液置于搖床，30 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。吸取5 mL富集液轉接至新鮮的含100 mg/L毒死蜱的MSM培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)，連續(xù)傳代。將第4代富集液做梯度稀釋，稀釋液分別涂布在LB固體平板和加入100 mg/L毒死蜱的基礎鹽培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)3～6 d，待平板出現(xiàn)單菌落后，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落在相應的培養(yǎng)基平板上劃線純化，直至單菌落形態(tài)一致且細胞染色在顯微鏡下觀察形態(tài)一致。

1.2.2 菌株形態(tài)及生理生化鑒定、菌株16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育地位的確定 降解菌株菌落形態(tài)、生理生化特征的確定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]和《Bergeys Manual of Determinative Bacteriology》[15]進行。

菌體總DNA采用改良的CTAB法提取[16-17]。菌株16S rRNA基因的PCR擴增以細菌的基因組DNA為模板，采用通用引物。正向引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為5′-TACCTTGTTACGACTT-3′[18]。

擴增體系（25 μL）如下：10×Buffer 2.5 μL，Mg2+（25 mmol）2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol each）2.5 μL，正向引物（1 mmol）0.5 μL，反向引物（1 mmol）0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，滅菌雙蒸水至25 μL。

PCR擴增反應程序為：95 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，72 ℃ 10 min，30 cycles；10 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物通過1%，GoldView染色的瓊脂糖電泳后，紫外分析儀檢測。用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收基因片段，TA克隆后進行測序（由華大基因完成）。根據(jù)16S rRNA基因的測序結果，在http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/在線查詢分析[19]，下載同源性較高的序列用MEGA version 5.0軟件通過鄰接法[20]構建降解菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹[21]。

1.2.3 菌株降解效果的測定 將待測菌株在50 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)生長期后期，培養(yǎng)液于離心機中5 000 r/min離心10 min，菌泥用基礎鹽培養(yǎng)基洗滌2次，調(diào)節(jié)OD600 nm為5.0作為接種液，以2%的接種量將菌懸液接種于含100 mg/L毒死蜱的MSM液體培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min培養(yǎng)72 h，每8 h取樣1次，驗證菌株對毒死蜱的降解效果，每個梯度設不加菌空白對照，并做3個重復。

采用紫外掃描法快速定性檢測樣品中毒死蜱濃度，精確定量檢測樣品中毒死蜱濃度采用GC-MS法。按1 ∶ 1比例在培養(yǎng)液中加入二氯甲烷，劇烈振蕩90 s，室溫下靜置5 min，這時水相和有機相充分分離，將水相吸出丟棄，加入無水硫酸鈉至有機相，除去有機相中少量水分。用UV-2450PC型分光光度計在200～350 nm波長范圍內(nèi)進行掃描（毒死蜱特征吸收峰約為290 nm處）。吸取1 mL振蕩分離后二氯甲烷提取液于室溫下?lián)]發(fā)干，加入1 mL色譜純正己烷溶解，稀釋，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后，利用GC-MS檢測。Agilent7890A+5975C，流速1.2 mL/min，分流比40 ∶ 1，進樣口溫度280 ℃，檢測器溫度290 ℃，柱溫150 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至250 ℃后保持20 min。根據(jù)標準曲線計算樣品中毒死蜱的含量，得出毒死蜱的降解率。所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行方差分析。

1.2.4 菌株最佳混合比例確定 2菌株均調(diào)OD600 nm值為2.0，以1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1.5、1 ∶ 1.25、1 ∶ 1、1 ∶ 0.75、1 ∶ 0.5、1 ∶ 0.25體積比混合，5%接種量，初始毒死蜱濃度為100 mg/L，30 ℃，160 r/min培養(yǎng)72 h，驗證菌株對毒死蜱的降解效果，每個梯度設不加菌空白對照，并做3個重復。

1.2.5 混合菌株對毒死蜱的降解特性研究 培養(yǎng)溫度對混合菌株降解毒死蜱的影響：將混合菌株以體積比1 ∶ 1.25，5%接種量，接種到100 mL基礎鹽培養(yǎng)基中，加入毒死蜱使終濃度為100 mg/L，分別置于不同的培養(yǎng)溫度下（20、25、30、35、40、45 ℃）培養(yǎng)72 h，分別測定各樣品殘留毒死蜱濃度，計算降解率，每個梯度設不加菌空白對照，并做3個重復。

培養(yǎng)基pH值對混合菌株降解毒死蜱的影響：將混合菌株以體積比1 ∶ 1.25，5%接種量，接種到100 mL基礎鹽培養(yǎng)基中，加入毒死蜱使終濃度為100 mg/L，置于不同pH值（5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0）的培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)72 h，分別測定各樣品殘留毒死蜱濃度，計算降解率，每個梯度設不加菌空白對照，并做3個重復。

培養(yǎng)基NaCl濃度對混合菌株降解毒死蜱的影響：將混合菌株以體積比1 ∶ 1.25，5%接種量，接種到100 mL液體LB培養(yǎng)基中，加入毒死蜱使其終濃度為100 mg/L，培養(yǎng)基中NaCl濃度分別為0、0.5%、1%、1.5%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、8.0%、10.0%，置于30 ℃，pH7.0條件下培養(yǎng)72 h，每個梯度設不加菌空白對照，并做3個重復。

初始毒死蜱濃度對混合菌株降解毒死蜱的影響：將混合菌株以體積比1 ∶ 1.25，5%接種量，接種到100 mL基礎鹽培養(yǎng)基中，加入不同量毒死蜱，使其終濃度分別為50、75、100、150、200、300 mg/L，30 ℃培養(yǎng)72 h，分別測定各樣品殘留毒死蜱濃度，每個梯度設不加菌空白對照，并做3個重復。

1.2.6 混合菌液在土壤中對毒死蜱的降解試驗

取海口市從未施用過毒死蜱的菜田表層土壤（pH6.12），分設2組，A組121 ℃滅菌2 h，B組不滅菌。將所有土樣過2 mm篩，取一定量的毒死蜱溶于丙酮，將其均勻拌入裝有1 000 g土壤的塑料盆中，A、B組各設2個處理：（1）每盆土壤中毒死蜱終濃度為10 mg/L；（2）每盆土壤中毒死蜱終濃度為50 mg/L。制備新鮮的混合菌株菌液，5 000 r/min離心5 min后，收集菌體，用無菌去離子水洗滌3次后再用無菌水懸浮，調(diào)節(jié)菌體濃度約為1.0×109 cfu/mL。以10%接種量接入到上述土壤中，于30 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理設不接種降解菌的土壤作為對照，并做3個重復。期間所有土壤的持水量保持在60%，培養(yǎng)10 d后，通過GC-MS測定土壤中的毒死蜱殘留量。

2 結果與分析

2.1 毒死蜱降解菌株的分離與篩選

經(jīng)紫外掃描及GC-MS測定，發(fā)現(xiàn)富集液中91%的毒死蜱已被降解。將富集液梯度稀釋培養(yǎng)，得到2株可降解毒死蜱的細菌，命名為D1與D3。2株菌均能在初始濃度為100 mg/L毒死蜱的基礎鹽培養(yǎng)基中生長并降解毒死蜱，72 h降解率約為77%與63%。

2.2 菌株形態(tài)及生理生化鑒定、菌株16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育地位的確定

菌株D1菌落在LB平板上呈乳白色、光滑、圓潤、不透明、有光澤，2 d后菌落直徑約1 mm；在透射電子顯微鏡下觀察，該菌呈短桿狀，每菌有極生或周生鞭毛。

該菌為革蘭氏陰性菌，好氧，可利用D-葡萄糖、果糖、L-阿拉伯糖、肌醇為碳源生長，過氧化氫酶、細胞色素酶反應為陽性，吲哚產(chǎn)生、葡萄糖酸化、明膠液化反應為陰性。

菌株D1的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1，結果表明菌株D1與蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）有較高的同源性，與Ochrobactrum tritici SCII24T（AJ242584）親源關系最近，16S rDNA基因相似性為99.63%；并且在基因系統(tǒng)發(fā)育樹上菌株D1和Ochrobactrum cytisi ESC1T（AY776289）、Ochrobactrum anthropi ATCC 49188T（CP000758）、Ochrobactrum lupini LUP21T（AY457038）聚類在一個亞分支上。結合其生理生化特性及16S rRNA序列分析結果，將菌株D1鑒定為蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）。

菌株D3菌落在LB平板上呈淺黃色的圓潤凸起，2 d后菌落直徑約2 mm，在透射電子顯微鏡下觀察，該菌呈球形或短桿狀，無鞭毛。

該菌為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧，可利用D-葡萄糖、阿拉伯糖、D-甘露醇、D-山梨醇為碳源生長，過氧化氫酶、細胞色素酶、葡萄糖酸化反應為陽性，吲哚產(chǎn)生、明膠液化反應為陰性。

菌株D3的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2，結果表明菌株D3與副球菌屬（Paracoccus sp.）有較高的同源性，與Paracoccus huijuniae FLN-7T （EU725799）親源關系最近，16S rDNA基因相似性為98.82%；并且在基因系統(tǒng)發(fā)育樹上菌株D3和Paracoccus aminovorans JCM 7685T（D32240）、Paracoccus siganidrum M26T（JX398976）、Paracoccus alcaliphilus JCM 7364T（D32238）聚類在一個亞分支上。結合其生理生化特性及16S rRNA序列分析結果，將菌株D3鑒定為副球菌屬（Paracoccus sp.）。

2.3 菌株最佳混合比例確定

將2菌株按不同比例混合進行降解試驗，降解率的變化見圖3。結果表明菌株D1和D3的混合體積比變化對毒死蜱降解影響較大。隨著D1所占比例增加，混合菌株對毒死蜱的降解率升高；當2菌株的體積比為1 ∶ 1.25時，毒死蜱的降解率達到89%以上；但是隨著體積比繼續(xù)增加，降解率開始降低。因此2菌株接種體積比確定為1 ∶ 1.25。

2.4 混合菌株以毒死蜱為唯一碳源的生長和降解試驗

將菌株D1、D3按1 ∶ 1.25接種到含100 mg/L毒死蜱為唯一碳源的基礎鹽培養(yǎng)基，進行毒死蜱降解試驗。通過對30 ℃，160 r/min培養(yǎng)72 h的培養(yǎng)液進行紫外掃描及GC-MS分析，結果見圖4。菌株混合液在72 h內(nèi)對毒死蜱的降解率達到89%以上，比單菌降解效率分別提高約12%和26%。同時，在毒死蜱的降解過程中，2株菌培養(yǎng)液的OD600 nm也隨著毒死蜱的降解而增加，表明菌株D1、D3在降解毒死蜱的同時，能夠利用毒死蜱作為唯一碳源生長。

2.5 混合菌株對毒死蜱的降解特性研究

2.5.1 培養(yǎng)溫度對混合菌株降解毒死蜱的影響

如圖5所示，菌株D1與D3混合液在20～40 ℃皆能降解毒死蜱，在25～35 ℃降解情況較好，降解率皆能達到61%以上，在20～25 ℃或35～40 ℃降解效率急劇下降，但降解率仍為20%以上；菌株混合液對毒死蜱最適降解溫度為30 ℃，降解率約為89%。

2.5.2 培養(yǎng)基pH值對混合菌株降解毒死蜱的影響

如圖6所示，菌株D1與D3混合液在pH=6～8范圍內(nèi)皆能較快降解毒死蜱，在pH=7～8降解情況較好，pH值在5以下或9以上降解效率急劇下降，降解率僅為22%左右。菌株混合液對毒死蜱最適降解pH值為7.0，降解率約為87%。

2.5.3 培養(yǎng)基NaCl濃度對混合菌株降解毒死蜱的影響 如圖7所示，混合菌株在NaCl濃度為0～8%時皆能降解毒死蜱，在NaCl濃度為0.5%～1.5%時降解情況較好，在NaCl濃度為3%以上時，因混合菌株生長受到嚴重抑制，降解率下降，在NaCl濃度為8%以上時，混合菌株幾乎不生長，降解也幾乎停止。混合菌株對毒死蜱降解最適培養(yǎng)基NaCl濃度為0.5%，在此濃度下，降解率約為83%。

2.5.4 初始毒死蜱濃度對混合菌株降解毒死蜱的影響

如圖8所示，當初始毒死蜱濃度為150 mg/L或以下時，混合菌株對毒死蜱的降解率都為80%以上，初始濃度對混合菌株的降解影響不大；但當初始毒死蜱濃度在300 mg/L或以上時，混合菌株幾乎不降解毒死蜱，說明太高濃度的毒死蜱可能對菌體生長產(chǎn)生毒性，從而嚴重影響混合菌株降解毒死蜱。

2.6 混合菌液在土壤中對毒死蜱的降解試驗

如圖9所示，與各自對照相比，在滅菌土壤（A組）中，混合菌液對2個濃度的毒死蜱均保持較高的降解率，培養(yǎng)10 d后，初始毒死蜱濃度為10 mg/L的處理（A1）和50 mg/L的處理（A2）降解率分別為（84.3±4.09）%和（76.9±5.23）%；在未滅菌土壤（B組）中，初始毒死蜱濃度為10 mg/L的處理（B1）和50 mg/L的處理（B2）降解率分別為（71.7±2.39）%和（59.2±3.31）%，降解效率低于滅菌土壤的處理。該結果表明由于土壤中存在其他微生物，混合菌株對毒死蜱的降解作用明顯受到影響；且初始毒死蜱濃度越高，混合菌株受影響越大。在滅菌和未滅菌土壤中，混合菌株對毒死蜱的降解差異顯著，但降解率都保持在較高水平，達到59%以上。

3 討論

毒死蜱對于多數(shù)水生生物、蜜蜂屬于高毒性物質(zhì)，加之其在土壤中殘留時間較長，將會以食物鏈形式對人體造成危害；大量研究表明，微生物代謝是土壤中毒死蜱降解的最主要因素。目前國內(nèi)外已經(jīng)報道了很多毒死蜱降解菌，在分類上大部分屬于真菌中的木霉菌屬及細菌中的假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、哈夫尼菌屬、氣單胞菌屬[8-12，22]。本研究分離篩選到2株可降解毒死蜱，并能以毒死蜱為唯一碳源生長的細菌D1、D3，通過生物學特性和16S rRNA基因序列相似性分析，將其鑒定為蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）和副球菌屬（Paracoccus sp.），且2株降解菌均對毒死蜱具有較高的降解效率，72 h內(nèi)對100 mg/L毒死蜱的降解率約為77%與63%；雖低于Stenotrophomonas sp.YC-1[10]，但顯著高于已報道的大部分毒死蜱降解細菌。

毒死蜱在土壤中的降解受酸堿度影響。單因素試驗表明，毒死蜱在酸性土壤中降解較慢[23]；熱帶土壤多為酸性土壤，因此，降解菌在酸性土壤中的定殖能力直接影響其在大部分熱帶土壤中的降解效率。對于土壤中難降解的有機污染物，因不同微生物的代謝方式可以互補，如采用定殖能力較強的混合菌株，將會提高其降解效果。本研究篩選得到的2株降解菌D1、D3以一定比例（1 ∶ 1.25）混合施用，與單菌相比，對毒死蜱降解能力顯著提高；在無外加營養(yǎng)元素或者較高濃度毒死蜱脅迫條件下，混合菌株均能保持較強的降解能力。本研究酸性土壤試驗結果表明，雖因混合菌株等非土著微生物的降解效率易受土著微生物的影響而有所下降，導致在滅菌和未滅菌土壤中，混合菌株對毒死蜱的降解差異顯著，但無論在滅菌或未滅菌土壤中，混合菌株都保持著較高的降解效率，具有較好的定殖能力。本研究得到的混合菌株具有應用開發(fā)潛力，在實際應用過程中，可進一步通過提高接種劑量，調(diào)整土壤pH值等措施，提高混合菌株的定殖能力及對毒死蜱的降解效率，研發(fā)出可實際應用的降解菌劑。很多降解菌株因為其在自然條件下定殖能力較低，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上還沒有得到有效應用，本試驗結果為降解菌在土壤中定殖能力的提高提供了新的研究思路。

本研究分離鑒定了2株具有較高降解效率的毒死蜱降解菌，并發(fā)現(xiàn)2株菌以最佳配比混合施用時，與單菌相比，毒死蜱降解效率可顯著提高；進一步研究了培養(yǎng)溫度、pH、NaCl濃度、初始毒死蜱濃度對混合菌株降解毒死蜱的影響，及混合菌液在土壤中對不同濃度毒死蜱的降解效率，可為毒死蜱污染熱帶土壤的治理提供資源與理論基礎。

參考文獻

[1] 馮發(fā)運， 朱 宏， 李俊領， 等. 一株小飛蓬內(nèi)生毒死蜱降解菌的分離鑒定及其降解特性初探[J]. 農(nóng)藥學學報， 2015， 17（1）： 89-96.

[2] 劉 婷. 模擬酸雨對毒死蜱降解規(guī)律的影響研究[D]. 長春： 吉林大學， 2012.

[3] López-Mancisidor P， Carbonell G， Fernández C， et al. Ecological impact of repeated applications of chlorpyrifos onzooplankton community in mesocosms under Mediterranean conditions[J].Ecotoxicology， 2008， 17（8）： 811-825.

[4] 季 靜， 肖 斌， 李 楊， 等. 兩種不同劑型毒死蜱對四種環(huán)境生物的毒性評價[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報， 2010， 29（9）： 1 681-1 686.

[5] Yucel U， Ylim M， Gozek K， et al. Chlorpyrifos degradation in Turkish soil[J]. J Environ Sci and Health， 1999， 34（1）： 75-95.

[6] Liu B， McConnell L L， Torrents A.Hydrolysis of chlorpyrifos in natural waters of the Chesapeake Bay[J]. Chemosphere， 2001， 44（6）： 1 315-1 323

[7] Gibson J E， Peterson R D， Shurdut B A. Human exposure and risk from indoor use of chlorpyrifos[J]. Environmental Health Perspectives， 1998， 106（6）： 303-306.

[8] 李興華， 羅香文， 張德詠， 等. 紅假單胞菌PSB 07-26 對白菜和土壤中毒死蜱的生物降解[J]. 安全與環(huán)境學報， 2014， 14（1）： 219-221.

[9] 段海明， 王開運， 喬 康， 等. 兩株毒死蜱降解細菌的分離鑒定及其降解特性[J]. 環(huán)境科學學報， 2009， 29（4）： 723-731.

[10] Chao Yang， Na Liu， XinminGuo， et al. Cloning of mpd gene froma chlorpyrifos-degrading bacteriumand use of this strain in bioremediation of contaminated soil[J]. FEMS Microbiology Letters， 2006， 265： 118-125.

[11] 陶玉貴， 王其進， 谷 浩， 等. 哈夫尼菌降解毒死蜱條件的優(yōu)化及動力學模型建立[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報， 2011， 30（3）： 449-454.

[12] 張廣志， 張新建， 李紅梅， 等. 土壤中木霉的分離及其對毒死蜱降解特性研究[J]. 生物技術通報， 2016， 32（6）： 205-210.

[13] Gilbert E S， Walker A W， Keasling J D. A constructed microbial consortium for biodegradation of the organophosphorus insecticide parathion[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2003， 61（1）： 77-81.

[14] 東秀珠， 蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京： 科學出版社， 2001.

[15] Buchanan R E， Gibbons N E. Bergeys manual of determinative bacteriology， 8th edition[M]. USA： The Williams & Wilkins Company， 1986.

[16] 郭新梅， 康冀川， 張 杰. CTAB法在金黃色葡萄球菌DNA提取中的應用[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學報， 2005， 24（6）： 558-560.

[17] Sambrook J， Russell D W. Molecular cloning： a laboratory manual， 3rd edition[M]. NY： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001.

[18] Lane D J. 16S/23S rRNA sequencing. In： Stackebrandt E， Goodfellow M， editors. Nucleic acid techniques in bacterial systematics[M]. Chichester： Wiley， 1991： 115-175.

[19] Chun J Lee J H， Jung Y， Kim M， et al. EzTaxon： a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2007， 57： 2 259-2 261.

[20] Saitou N， Nei M. The neighbor-joining method： a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution， 1987， 4： 406-425.

[21] Kamura K， Peterson D， Peterson N， et al. MEGA5： molecular evolutionary genetics analysis using Maximum Likelihood， evolutionary Distance， and Maximum Parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution， 2011， doi： 10.1093/molbev/msr121.

[22] 金 鑫， 冉雪琴， 王嘉福. 2株氣單胞菌屬毒死蜱降解菌的分離與鑒定[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報， 2011， 24（6）： 2 238-2 242.

[23] 劉騰飛， 鄧金花， 周峰杰， 等. 毒死蜱在土壤中的降解及分析研究進展[J]. 中國農(nóng)學通報， 2014， 30（9）： 26-34.