決登偉 桑雪蓮 舒波 劉麗琴 王一承 石勝友

摘 要 通過生物信息學(xué)方法，從玉米基因組中得到1個泛素結(jié)合酶家族基因序列，將其命名為ZmUBC-76。該基因序列開放閱讀框為2 589 bp，編碼的蛋白具有862個氨基酸，其分子量為98.91 ku，理論等電點為8.07。預(yù)測定位于細胞核。熒光定量PCR分析表明，該基因具有組織表達特異性，在根和幼果中的表達量最高，在穗絲中表達最低。非生物脅迫表達分析結(jié)果表明：在鹽脅迫和干旱脅迫下，ZmUBC-76的表達呈逐漸下降趨勢，在處理24 h時達到最低；在低溫脅迫時，ZmUBC-76的表達量未出現(xiàn)顯著變化。上述結(jié)果表明，ZmUBC-76可能參與了植物對鹽和干旱脅迫的響應(yīng)。

關(guān)鍵詞 玉米；泛素結(jié)合酶基因；干旱；低溫；鹽脅迫

中圖分類號 Q78 文獻標識碼 A

Functional Analysis of a Ubiquitin-conjugating

Enzyme Gene ZmUBC-76 in Maize

JUE Dengwei， SANG Xuelian， SHU Bo， LIU Liqin， WANG Yicheng， SHI Shengyou*

South Subtropical Crops Research Institute， CATAS / Key Laboratory of Tropical Fruit Biology，

Ministry of Agriculture， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract In the present study， a ubiquitin-conjugating family gene was identified and designated as ZmUBC-76， in maize genome by using the bioinformatics method. The ORF of ZmUBC-76 is 2 589 bp that encodes 862 amino acid residues with an estimated molecular mass of 98.91 ku and a calculated pI of 8.07. Meanwhile， Plant-mPLoc predicted that the ZmUBC-76 protein was localized in the nucleus. Real-time qPCR assay showed that the highest expression level of ZmUBC-76 occurred in the roots and young seeds， and the lowest of ZmUBC-76 occurred in the silks， which meant ZmUBC-76 appeared to have a tissue-specific expression pattern. The expression levels of ZmUBC-76 under different abiotic stress were also analyzed by real-time qPCR. The results showed that the expression of ZmUBC-76 decreased at the test time by salt and drought stress， and reached the lowest level at 24 h. However， the expression levels of ZmUBC-76 under low temperature stress had no significant change. These results indicated that ZmUBC-76 could be involved in plant response to salt and drought stress.

Key words Maize； ubiquitin-conjugating enzyme gene； drought； low temperature； salt stress

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.021

泛素化廣泛地存在于真核細胞中，從單細胞的酵母到高等生物人類。泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑。蛋白的泛素化主要通過泛素活化酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素-蛋白連接酶（E3）共同介導(dǎo)完成。通過3種酶先后與靶蛋白結(jié)合形成1條多泛素鏈，將底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶所識別和降解，從而實現(xiàn)對多種代謝過程的調(diào)節(jié)[1-2]。其中，泛素結(jié)合酶（E2）是泛素-蛋白酶體途徑的重要組成部分，對泛素化修飾的特異性和精確時空性起關(guān)鍵作用[3]。

目前，在酵母（Saccharomyces cerevisiae）[4]、擬南芥[5]、水稻[6]和香蕉[7]等多種真核生物中都有關(guān)于E2蛋白的報道。對植物泛素結(jié)合酶功能的研究主要集中在DNA修復(fù)、生長發(fā)育和抗逆境脅迫響應(yīng)等方面[8-9]。比如，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)37個E2，這些E2蛋白在擬南芥的生長、發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫中起到重要的作用[5]。其中AtUBC13參與擬南芥的表皮細胞分化及缺鐵應(yīng)激反應(yīng)[10]。AtUBC1和AtUBC2參與到葉的發(fā)育、激活成花抑制基因和UV抗逆反應(yīng)。atubc1-1和atubc2-1的功能喪失雙突變體表現(xiàn)出蓮座葉顯著減少和早開花表型[11]。在水稻的39個E2蛋白中，14個OsUBCs在干旱或者鹽脅迫下出現(xiàn)差異表達，幾乎所有OsUBC基因的表達都受到IAA、6-BA、GA及ABA中至少2種激素的誘導(dǎo)[12]。在前期研究中，筆者從玉米基因組中發(fā)現(xiàn)75個E2家族基因中，其中35個基因在NaCl處理時呈上調(diào)表達，22個基因在PEG6000處理時上調(diào)表達，5個基因在4 ℃處理時上調(diào)表達[13]。同樣，在怪柳、番茄和香蕉等其他作物中也有關(guān)于E2蛋白的類似報道[7， 14-15]。

玉米（Zea Mays L.）是當今世界重要的糧食作物之一，亦是重要的飼料和工業(yè)原料作物，在世界糧食總產(chǎn)量中處于第一位[16]。中國作為世界第二大玉米生產(chǎn)國，近30多年來，玉米生產(chǎn)發(fā)展非常迅速，總產(chǎn)量也呈逐年上升趨勢。世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)庫（FAOSTAT）顯示在2012年，玉米產(chǎn)量超過稻谷產(chǎn)量，成為中國第一大糧食作物[17]。2013年，中國玉米常年種植面積達3 510萬hm2，總產(chǎn)量約2.17億t，占糧食總產(chǎn)量的1/3。但在實際生產(chǎn)中，玉米常常會因受到諸多不利環(huán)境因素的影響而大面積減產(chǎn)，比如干旱、鹽脅迫和低溫等。在本研究中，筆者利用生物信息學(xué)技術(shù)從玉米的基因組發(fā)現(xiàn)一個新E2家族基因，并將其命名為ZmUBC-76。ZmUBC-76含有泛素結(jié)合酶典型的催化結(jié)構(gòu)域及高度保守的半胱氨酸殘基。利用熒光定量PCR方法，筆者進一步對ZmUBC-76在玉米不同組織器官、旱、鹽脅迫及低溫脅迫的表達進行分析。從而分析該基因在植物生長發(fā)育和不同逆境下的作用，為挖掘玉米抗逆基因和豐富E2蛋白在不同作物中的功能研究提供一定的理論和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 玉米（Zea mays，B73）種子保存于南亞熱帶作物研究所。玉米組織器官根（root）、莖（stem）、葉（leaf）、穗（tassel）、幼果（young seed）和穗絲（silk）取自大田種植的玉米自交系B73植株，采樣時期為乳熟期。逆境處理所用材料為B73種子萌發(fā)而來的幼苗，取樣部位為葉片。實驗設(shè)3次重復(fù)，所有取樣剪成2 cm左右的小段，立即放入液氮速凍并轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存、備用。

1.1.2 主要試劑 植物RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物公司（Huayueyang Bio Co.， Ltd， Beijing， China）；反轉(zhuǎn)錄試劑及Realtime PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司（TaKaRa Bio， Inc.， Kusatsu， Japan）；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；其他試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ZmUBC-76序列的獲得及生物信息學(xué)分析

利用酵母和擬南芥UBC蛋白序列在玉米基因組數(shù)據(jù)庫（MaizeGDB，http：//www.maizegdb.org/）和Phytozome（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza/）中進行BLASTP搜索。其ORF、氨基酸長度和染色體定位信息由Phytozome數(shù)據(jù)庫獲得。應(yīng)用在線軟件SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）和Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/cgibin/PlantmPLoc.cgi）分析蛋白的結(jié)構(gòu)域和亞細胞定位，蛋白的等電點和分子量用ExPASy（http：//expasy.org/tools/）進行分析，ZmUBC-76基因的外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)利用Gene Structure Display Server（GSDS）（http：//gsds.cbi.pku.edu. cn/）在線軟件分析。利用MEGA 5軟件進行氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建Neighbor-Joining進化樹，1 000次重復(fù)，其他均為默認設(shè)置。

1.2.2 組織器官表達模式分析 Trizol法提取玉米根、莖、葉、穗、幼果和穗絲的總RNA，經(jīng)DNAaseⅠ消化后反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA后作為模板，具體操作步驟參照說明書。根據(jù)ZmUBC-76基因全長設(shè)計熒光定量引物ZmE2-76F（5′-AGGGCTTACAT

GTCTGGGAC-3′）和ZmE2-76R（5′-TTTCCAGCTC

CATCACTCGT-3′），并以玉米actin基因為內(nèi)參基因，引物為ZmA-F（5′-TCACTACGACTGCCGAGC

GAG-3′）和ZmA-R（5′-GAGCCACCACTGAGGAC AACATTAC-3′）。熒光定量PCR反應(yīng)所用儀器為Roche的LightCycler480，熒光定量PCR酶為TaKaRa公司的SYBR Green Master Mix。反應(yīng)體系為20 mL，其中模板cDNA 40 ng，上、下游引物各250 nmol/L，SYBR Green Master Mix 10 μL，其余用ddH2O補齊。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)后作熔解曲線（95→65 ℃，0.1 ℃·s-1）。利用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。所有樣品進行3次重復(fù)，均設(shè)陰性對照。在分析ZmUBC-76基因的表達時，上調(diào)或者下調(diào)大于2倍時才認為存在差異。所有試驗3次重復(fù)。

1.2.3 ZmUBC-76基因的逆境表達分析 逆境試驗所用材料為B73種子萌發(fā)而來的幼苗。種子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)入1/2 Hoagland培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，生長條件為（28 ± 2） °C，14 h光照，10 h黑暗。3周后，選擇長勢均一的幼苗進行下步試驗。低溫脅迫處理組：將長勢一致、生長健壯的玉米幼苗放在4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取樣時間點為0、1、6、24 h。鹽脅迫處理組：在200 mmol/L NaCl的培養(yǎng)液中培養(yǎng)幼苗，取樣時間點為0、1、6、24 h。干旱脅迫處理組：將長勢均一、生長健壯的3周苗齡玉米幼苗轉(zhuǎn)入含20% PEG6000的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，取樣時間點同樣為0、1、6、24 h。未處理的幼苗作為對照，采樣時間點與處理組一致。取樣部位為葉片。每個時間點4株苗混合采樣，所有試驗3次重復(fù)。熒光定量PCR方法如上。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmUBC-76基因生物信息學(xué)分析

利用酵母和擬南芥UBC蛋白序列在MaizeGDB和Phytozome進行BLASTP搜索，獲得1條泛素結(jié)合酶家族基因序列，其在MaizeGDB及Phytozome數(shù)據(jù)庫中的登錄號分別為ZM04G21350和GRM ZM2G003953，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的玉米E2家族基因的編號，將其命名為ZmUBC-76。該基因序列開放閱讀框為2 589 bp，編碼的蛋白具有862個氨基酸，其分子量為98.91 ku，理論等電點為8.07，位于玉米第4號染色體，位置為Chr4：156，543，382 - 156，548，976。ZmUBC-76基因有13個內(nèi)含子。預(yù)測該蛋白定位于細胞核。ZmUBC-76蛋白有泛素結(jié)合酶活性位點的保守序列及半胱氨酸殘基，含有UBC結(jié)構(gòu)域和1個C端延長的蛋白序列，屬于Class Ⅱ家族E2蛋白（圖 1）。

進一步分析ZmUBC-76蛋白與其他植物UBC蛋白的親緣關(guān)系，對13個酵母、37個擬南芥E2及ZmUBC-76蛋白序列進行多重序列對比，并利用MEGA 5軟件構(gòu)建進化樹。進化分析表明，ZmUBC-76屬于UBC15 group，與擬南芥的AtUBC24、AtUBC25及AtUBC26聚到同一分支，具有較高同源性（圖2）。

2.2 ZmUBC-76在玉米組織器官中的表達模式

為研究該基因的組織器官表達特異性，對玉米根（root）、莖（stem）、葉（leaf）、穗（tassel）、幼果（young seed）和穗絲（silk）6個組織器官進行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，該基因在各組織中均有表達，但在穗絲中的表達量最低，在幼果中的表達量最高，根中的表達量次之，大概都是穗絲中表達量的6倍左右。在莖、葉、穗中的表達呈逐步上升趨勢，分別是穗絲中表達量的2、3、4倍左右，表達強弱依次為幼果>根>穗>葉>莖>穗絲（圖3）。

2.3 ZmUBC-76在不同脅迫處理下的表達模式

從圖4可以看出，4 ℃處理1、6、24 h后，ZmUBC-76的表達量相對于0 h時的變化都小于2倍，可以認為沒有顯著性變化，即在處理時間內(nèi)ZmUBC-76對低溫沒有響應(yīng)。然而在NaCl處理組，ZmUBC-76的表達量在處理1、6、24 h后分別下降為0 h的0.56、0.47和0.25倍，呈逐漸下調(diào)趨勢。同樣的在PEG6000處理組，在檢測時間內(nèi)ZmUBC-76的表達量也是逐步下調(diào)，且趨勢與NaCl處理組相似，處理1、6、24 h后分別下降為0 h的0.53、0.42和0.21倍。

3 討論

植物是固著生長的生物，在其生長過程中經(jīng)常會受到干旱、鹽堿、高溫、低溫等非生物脅迫的影響[18]。這些非生物脅迫會導(dǎo)致植物水分虧缺，產(chǎn)生滲透脅迫，影響植物的生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致植物死亡。在實際生產(chǎn)中，這些不良的生長環(huán)境條件往往會造成農(nóng)作物的大量減產(chǎn)或絕收，如我國有60%的玉米種植面積受到干旱脅迫，每年因旱災(zāi)而減產(chǎn)20%～30%[19]。當然，植物在長期進化過程中也形成了一系列機制以適應(yīng)和抵御各種逆境脅迫。在這其中，泛素-蛋白酶體途徑在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中的作用已得到廣泛認可[2]。泛素結(jié)合酶（E2）是泛素-蛋白酶體途徑的重要組成部分，對泛素化修飾的特異性和精確時空性起關(guān)鍵作用[4]。研究E2在植物響應(yīng)逆境脅迫中的作用具有重要的理論和實際意義。

對基因的組織器官表達模式分析有助于解析其在生物體中功能。在筆者的研究中，ZmUBC-76在各組織器官中均有表達，在穗絲中的表達量最低，在幼果中的表達量最高，根中的表達量次之，大概都是穗絲中表達量的6倍左右。在莖、葉、穗中的表達呈逐步上升趨勢，分別是穗絲中表達量的2、3、4倍左右。同樣在其他作物的組織器官中，E2基因也表現(xiàn)不同表達模式。如在香蕉中MaUBC10/11/33/34/61在所有的組織器官中都表達，在根、莖和葉中表達量最高，MaUBC6/11/34/35/45/61在莖中表達量最高，而MaUBC13/18/29/33/34/36/43/46/48/53/67/70在根中表達量最高[7]。在玉米的75個E2中，ZmUBC-29/31/45/53/60/75在幼果中高表達[13]。在水稻中OsUBC13/32/33/34在葉中表達量最高[12]。該結(jié)果表明，ZmUBC-76在玉米的生長發(fā)育中具有重要的作用，特別是根和幼果的發(fā)育。

目前有不少關(guān)于植物E2參與植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)的報道。如野生水稻的OgUBC1基因參與細胞內(nèi)生物和非生物脅迫響應(yīng)[21]。在鹽和干旱脅迫下，3個水稻E2基因（OsUBC2/5/18）和5個擬南芥E2基因（AtUBC13/17/20/26/31）顯著下調(diào)表達，只有3個水稻E2基因（OsUBC13/15/45）顯著上調(diào)表達[12]。在玉米的75個E2家族基因中，35個基因在NaCl處理時呈上調(diào)表達，22個基因在PEG6000處理時上調(diào)表達，5個基因在4 ℃處理時上調(diào)表達[13]。香蕉的74個E2基因中，有45個和33個基因分別受到干旱脅迫及鹽脅迫處理的誘導(dǎo)表達[7]。王安邦等的研究表明，香蕉的UBCE2在干旱脅迫下表達量最高；對鹽脅迫響應(yīng)不明顯；低溫脅迫時，在溫度為15、10 ℃時MaUCE2的表達量上升不明顯，而溫度降到7 ℃和5 ℃時該基因的表達量迅速上升，在5 ℃時達到最大，為對照的4.08倍[20]。在擬南芥中過表達綠豆（Vigna radiata）的VrUBC1基因，植株在萌發(fā)過程中表現(xiàn)出對ABA和滲透脅迫的高度敏感反應(yīng)，增強了ABA或鹽誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，進而增強了植株對干旱脅迫的耐受性[21]。異源表達馬鈴薯泛素結(jié)合酶GmUBC2也能明顯提高擬南芥的耐鹽性[22]。與這些報道類似，在本研究中，筆者對ZmUBC-76基因在干旱、鹽脅迫和低溫下的表達進行了分析。結(jié)果顯示在鹽脅迫和干旱脅迫下，ZmUBC-76的表達呈逐漸下降趨勢，在處理24 h時達到最低，分別是對照的0.25和0.21倍。在低溫脅迫時，ZmUBC-76的表達量未出現(xiàn)顯著變化。這些結(jié)果表明ZmUBC-76可能在植物響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫時，起到負調(diào)控作用，即與脅迫發(fā)生時細胞內(nèi)異常蛋白的增加呈負相關(guān)。但關(guān)于ZmUBC-76的互作蛋白及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需要進一步的研究。

目前，關(guān)于玉米泛素結(jié)合酶的研究報道還較少，本研究有助于豐富植物E2家族基因的研究，同時也能為玉米抗逆育種提供一些優(yōu)異的基因資源。

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