董晨 魏永贊 王弋 鄭雪文 李偉才

摘 要 生長素反應(yīng)因子（Auxin Response Factors，ARFs）是調(diào)節(jié)生長素表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)基因，ARF基因在植物中大多由多基因家族組成?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法對(duì)荔枝ARF基因進(jìn)行鑒定，并分析其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、保守基序、系統(tǒng)進(jìn)化以及基因的表達(dá)模式。在荔枝中鑒定出21個(gè)ARF基因，其編碼的蛋白質(zhì)含有53～1 117個(gè)氨基酸，分子量約為6.112～123.872 ku，等電點(diǎn)為4.21～9.45。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示21個(gè)ARF均定位于細(xì)胞核。LcARFs基因家族具有相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)，即包含1個(gè)保守的B3 DNA結(jié)構(gòu)域、ARF結(jié)構(gòu)域和Aux/IAA結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析表明荔枝ARF蛋白分為5個(gè)亞家族。21個(gè)荔枝ARF基因在花穗發(fā)育過程中有明顯不同的表達(dá)規(guī)律。該結(jié)果為進(jìn)一步深入研究荔枝ARF基因家族的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 荔枝；生長素反應(yīng)因子；基因家族；生物信息分析；表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Transcriptome-wide Identification and Expression Profiling of the Auxin Response Factor（ARF）Gene Family in Litchi chinensis Sonn.

DONG Chen， WEI Yongzan， WANG Yi， ZHENG Xuewen， LI Weicai*

Institute of South Subtropical Corp Research， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory

of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract Auxin Response Factors（ARFs）are the transcription factors that regulate the expression of auxin responsive genes. The ARF genes are composed by a large multigene family in plants. The study was based on the data of litchi transcriptome data， the basic physical and chemical characters， subcellular location， protein conserved domain， evolutionary relationship and expression patterns of litchi ARF genes family were analyzed by the bioinformatics methods. Twenty-one ARF genes were identified in litchi. The predicted litchi ARF gene family members encode proteins ranged from 53 to 1 117 amino acid residues （aa）in length， and relative molecular weight varied from 6.112 to 123.872 ku， isoelectric point（pI）in the range of 4.21 to 9.45.In addition， subcellular localization analysis showed that all of the LcARF proteins were located in the nucleus. Sequence analysis based on the sequence of litchi ARF indicates that it contains 3 relatively conservative domains（B3 domain， Auxin-resp domain and Aux-IAA domain）. Phylogenetic analysis revealed that LcARF gene family was divided into five groups（group I～group V）. The expression patterns of ARF gene were different in different developmental stages. The results laid a foundation for further study of the function of the litchi ARF gene family.

Key words Litchi chinensis Sonn.； ARF； gene family； bioinformation analysis； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.018

生長素在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，例如側(cè)根形成、頂端優(yōu)勢(shì)、向性反應(yīng)、植物葉芽和果實(shí)發(fā)育[1]。生長素反應(yīng)因子（Auxin response factor， ARF）是生長素信號(hào)通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子，通過直接與生長素反應(yīng)元件（AuxRE，TGTCTC）直接結(jié)合來調(diào)節(jié)生長素反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。通常ARF 蛋白包含3個(gè)獨(dú)特的保守結(jié)構(gòu)域：保守的N-末端的B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（B3 domain），可變中間結(jié)構(gòu)域?yàn)榧せ罱Y(jié)構(gòu)域（AD）或抑制結(jié)構(gòu)域（RD），C-末端是二聚作用結(jié)構(gòu)域CTD[2]。N-末端的B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以特異性地靶向生長素反應(yīng)基因的啟動(dòng)子中的AuxRE元件，可變中間結(jié)構(gòu)域基于其氨基酸殘基的組成，決定ARF是發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用還是抑制作用，C-末端結(jié)構(gòu)域參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，介導(dǎo)ARFs之間的同二聚化及ARF和Aux/IAA之間的蛋白的異二聚化。ARF基因家族參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育以及植物對(duì)多重信號(hào)的反應(yīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在葉片的衰老、維管組織形成、子葉發(fā)育、花發(fā)育及果實(shí)成熟等植物生長發(fā)育過程中具有重要作用。自從第1個(gè)ARF（AtARF1）基因從擬南芥中克隆以來，近年來越來越多的ARF基因在多種不同的植物中被預(yù)測(cè)或鑒定出來，包括擬南芥[3]、水稻[4]、玉米[5]、谷子[6]、大豆[7]、番茄[8]、黃瓜[9]、菜心[10]、香蕉[11]、葡萄[12]、甜橙[13]、苜蓿[14]、毛果楊[15]、巨桉[16]等。但目前關(guān)于荔枝ARF研究鮮見報(bào)道，劉興地等[17]成功克隆了1個(gè)與無核荔枝胚珠敗育相關(guān)的生長素反應(yīng)因子基因（ARF），而在轉(zhuǎn)錄組層面分析荔枝ARF基因家族則未見報(bào)道。

本研究基于課題組妃子笑荔枝不同花穗發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)ARF基因家族進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，分析烯效唑處理花穗和對(duì)照花穗21個(gè)LcARF在花穗發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)規(guī)律，為日后進(jìn)一步研究荔枝ARF基因功能提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

妃子笑荔枝種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所荔枝龍眼示范果園，選擇樹齡及長勢(shì)相近的妃子笑6株，在花穗長18 cm時(shí)用50 μg/mL的5%烯效唑處理花穗，CK不做任何處理，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別在初花期、盛花期、謝花期采集對(duì)照和處理的妃子笑花穗，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)來源、基因鑒定與分析 荔枝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由本課題組測(cè)序獲得（數(shù)據(jù)未發(fā)表），在對(duì)照和烯效唑處理不同花穗發(fā)育時(shí)期共拼接組裝了48 844個(gè)unigenes。模式植物擬南芥、水稻的ARF基因序列下載于植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn）和Phytozome11基因組數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html），將其作為探針序列，利用本地Blast軟件在荔枝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中進(jìn)行blast搜索比對(duì)。同時(shí)，利用關(guān)鍵詞“auxin response factor”和“ARF”進(jìn)行直接檢索。去除重復(fù)序列后，利用SMART對(duì)序列保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定，并刪除不含ARF基因家族特征結(jié)構(gòu)域的基因。

1.2.2 基本理化性質(zhì)及保守結(jié)構(gòu)域分析 利用在線軟件ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析預(yù)測(cè)荔枝ARF的蛋白序列的分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)和疏水性等基本的理化性質(zhì)。利用在線軟件Plant-mPLoc Server（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）分析荔枝ARF蛋白亞細(xì)胞定位。

利用MEME4.0（http：//meme.nbcr.net/meme/）分析荔枝ARF家族蛋白的保守基序， 基序的大數(shù)目設(shè)置為20， 基序長度設(shè)為6～200個(gè)氨基酸。運(yùn)用在線軟件SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)得到的保守基序進(jìn)行功能注釋，并且參照擬南芥和水稻的命名模式進(jìn)行命名。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析 利用多重序列比對(duì)軟件Clustal X 1.83對(duì)荔枝、擬南芥和水稻的所有ARF蛋白序列進(jìn)行序列比對(duì)計(jì)算，比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步通過 MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹生成采用鄰接法（neighbor joining，NJ），參數(shù)設(shè)置： 使用neighbor-joining法則的P-距離（P-distance）模型構(gòu)建， 選擇了成對(duì)刪除（pairwise deletion）空位（gap）的選項(xiàng)，Bootstrap method取值1 000。

1.2.4 基因家族在花穗調(diào)控下的表達(dá)特征分析

利用荔枝轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析ARF基因的表達(dá)特征。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)包含妃子笑荔枝烯效唑處理和對(duì)照花穗發(fā)育過程中的3個(gè)時(shí)期（初花期，盛花期，謝花期）的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。以FPKM值表示轉(zhuǎn)錄本豐度，通過對(duì)數(shù)據(jù)均一化處理，利用Heml工具做熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝ARF基因家族的鑒定

通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的本地blast比對(duì)檢索和關(guān)鍵詞搜素，共獲得40條ARF序列，通過SMART對(duì)保守結(jié)構(gòu)域的篩選最終得到21條荔枝ARF蛋白序列。為了方便研究，按照轉(zhuǎn)錄組中的基因ID大小前后順序統(tǒng)一為荔枝ARF編號(hào)（LcARF1～21），見表1。可以看出從轉(zhuǎn)錄組分離的到的21個(gè)ARF基因大小從162 bp（LcARF21）～3 354 bp（LcARF1），對(duì)應(yīng)所編碼的氨基酸數(shù)分布在53～1 117 aa。預(yù)測(cè)的理論分子量大小范圍在6.112～123.871 ku之間；等電點(diǎn)大小范圍在4.21～9.45之間，其中15個(gè)LcARF等電點(diǎn)小于7，顯酸性，6個(gè)LcARF等電點(diǎn)大于7，顯堿性，LcARF蛋白平均等電點(diǎn)小于7，表明ARF為弱酸性，在酸性的亞細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮作用。不穩(wěn)定指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)LcARF蛋白（7， 19，21）不穩(wěn)定指數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位分析表明所有的LcARF蛋白均定位于細(xì)胞核。以上結(jié)果分析ARF蛋白的基本理化特性可見LcARF蛋白無論從氨基酸序列的長度還是蛋白的特性變化都有很大的差異，表明ARF基因家族蛋白具有不同特性。

利用SMART軟件對(duì)LcARF基因家族B3 domain、Auxin-resp domain、AUX-IAA domain進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LcARF基因家族中LcARF1/2/10/14/15/16/17/20同時(shí)含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，占基因家族總數(shù)的38.1%；LcARF3/4/5/6/11/12/18含有B3 domain、Auxin-resp domain 2個(gè)結(jié)構(gòu)域，占基因家族總數(shù)的33.3%；而LcARF7/9/10僅含有B3 domain，LcARF19僅含有AUX-IAA domain（圖1）。荔枝ARF基因家族不同保守結(jié)構(gòu)域的位置信息見表1。

2.2 LcARF蛋白的保守基序分析

通過在線軟件MEME分析LcARF蛋白中的保守基序，結(jié)果如圖2、3所示。LcARF基因家族中預(yù)測(cè)含有20個(gè)保守基序，ARF基因家族成員之間所包含的保守基序數(shù)目及種類存在一定的差異。除了AtARF23、LcARF7/8/19/21不含保守Motif 1外，其他均含有motif 1。相比Motif 1，Motif 2在LcARF基因家族中有8個(gè)成員不含該基序，Motif 3在LcARF基因家族中有5個(gè)成員不含該基序。Motif 4 出現(xiàn)15次，motif 5 17次；motif 6 16次；motif 7 17次；motif 8 16次；motif 9 11次；motif 10 12次；motif 11 14次；motif 12 9次；motif 13 15次；motif 14 12次；motif 15 1次；motif 16 1次；motif 17 10次；motif 18 4次；motif 19 8次；motif 20 4次。結(jié)果表明出現(xiàn)頻率較高的motif為ARF結(jié)構(gòu)域中非常重要的保守基序。對(duì)于出現(xiàn)頻率較低的motif保守基序，通過Smart在線分析關(guān)于其功能的相關(guān)信息目前未知，有待日后進(jìn)一步深入研究。

2.3 ARF蛋白的進(jìn)化關(guān)系分析

為了進(jìn)一步了解荔枝ARF基因家族各成員之間的進(jìn)化關(guān)系以及生物學(xué)功能的相關(guān)性，對(duì)鑒定的21個(gè)荔枝ARF基因家族成員及模式植物擬南芥、水稻ARF基因家族成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明：21個(gè)荔枝ARF可以劃分為5個(gè)亞家族，其中GroupⅠ含有LcARF基因家族成員6個(gè)，占基因家族總數(shù)的28.57%；GroupⅡ含有LcARF基因家族成員10個(gè)，占基因家族總數(shù)的47.62%；GroupⅢ～Ⅴ分別含有1、2、2個(gè)。進(jìn)化關(guān)系較進(jìn)的LcARF在氨基酸長度和蛋白結(jié)構(gòu)組成相似，如LcARF2和LcARF10。荔枝ARF和擬南芥ARF在進(jìn)化上親緣較關(guān)系較近，和水稻關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 荔枝ARF基因家族的表達(dá)分析

利用妃子笑荔枝（對(duì)照和烯效唑處理花穗發(fā)育的不同時(shí)期）的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（數(shù)據(jù)未發(fā)表），找到候選的21個(gè)ARF基因?qū)?yīng)轉(zhuǎn)錄本的RPKM值，通過對(duì)RPKM值取對(duì)數(shù)值轉(zhuǎn)換，利用Heml熱圖軟件作熱圖（圖5）。結(jié)果顯示，在對(duì)照和處理花穗中至少在花期的某1個(gè)檢測(cè)到21個(gè)LcARF基因的表達(dá)，但表達(dá)豐度不同；其中LcARF2和LcARF10在對(duì)照及處理花穗不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量均較強(qiáng)，而LcARF6、LcARF7、LcARF13、LcARF19和LcARF21表達(dá)量較低。進(jìn)化關(guān)系較近的例如LcARF2和LcARF10以及LcARF19和LcARF21表達(dá)量也相似，表明這些基因間具有相似的生物學(xué)功能。在花穗發(fā)育的不同階段，LcARF基因在對(duì)照和處理中大部分表達(dá)量下調(diào)，其中對(duì)照LcARF有9個(gè)基因下調(diào)（LcARF1/2/3/4/9/10/13/14/20），烯效唑處理有14個(gè)基因下調(diào)（LcARF1/2/3/4/7/8/9/10/11/14/15/16/18/20），對(duì)照下調(diào)的基因在烯效唑處理后表達(dá)量也下調(diào)。對(duì)照和處理中LcARF17表達(dá)特征為升-降的趨勢(shì)，在第2個(gè)階段盛花期表達(dá)量較高，推測(cè)在盛花期發(fā)揮重要作用?；ㄋ氚l(fā)育的3個(gè)不同時(shí)期大多數(shù)LcARFs表達(dá)趨勢(shì)為逐漸下調(diào)，與前人研究荔枝花期內(nèi)源激素IAA含量逐漸下降一致。其中LcARF2和LcARF10表達(dá)量較高，推測(cè)其在生長素合成途徑中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。

3 討論

荔枝是起源于我國南方的亞熱帶名貴水果，我國荔枝栽培歷史悠久，種質(zhì)資源極其豐富，栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位。‘妃子笑具有花穗長、花量大、花期長的特點(diǎn)，導(dǎo)致因花穗發(fā)育和開放消耗大量營養(yǎng)而導(dǎo)致坐果率低甚至不結(jié)實(shí)的問題。荔枝花穗發(fā)育與內(nèi)源激素關(guān)系密切，生長素作為最早發(fā)現(xiàn)的植物激素，其生理作用廣泛，影響細(xì)胞的分裂、伸長和分化。

近年來，隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多物種全基因組測(cè)序完成。目前ARF轉(zhuǎn)錄因子已在多個(gè)物種的基因組水平上得以鑒定，ARF基因家族成員在不同的物種中存在很大的差異。其中，大豆中ARF基因家族成員最多， 為51個(gè)[7]；香蕉[11]、毛果楊[15]、玉米[5]、菜心[10]、水稻[4]、蒺藜苜蓿[14]、擬南芥[3]、番茄[8]、葡萄[18]、甜橙[13]、黃瓜[9]和巨桉[16]基因家族成員分別為47、39、31、31、25、24、23、21、19、19、18和17個(gè)。本研究基于荔枝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共鑒定了21個(gè)ARF基因。通過分析荔枝ARF基因家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，荔枝ARF基因家族包含典型的保守結(jié)構(gòu)域B3 domain、Auxin-resp domain、AUX-IAA domain，這與擬南芥[3]、水稻[4]、玉米[5]、香蕉[11]等ARF基因家族關(guān)于蛋白保守結(jié)構(gòu)域的研究結(jié)果相似。通過對(duì)荔枝ARF基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，LcARF基因家族的21個(gè)家族成員劃分為5個(gè)不同的亞家族，進(jìn)化分組與前人對(duì)ARF家族分組的研究結(jié)果一致[3，19]。同一亞家族中，不同ARF蛋白成員間在氨基酸序列的大小相似、蛋白結(jié)構(gòu)相近、表達(dá)趨勢(shì)也相似；說明進(jìn)化關(guān)系較進(jìn)的具有相似的生物學(xué)功能。

本研究基于妃子笑荔枝花穗不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫鑒定分析了LcARF基因家族，并對(duì)其蛋白的基本理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、保守基序、系統(tǒng)進(jìn)化，以及轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)特征進(jìn)行了全面的分析，為進(jìn)一步研究荔枝ARF的生物學(xué)功能奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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