董榮書　張潔　陳志堅(jiān)　白昌軍　郇恒福　王文強(qiáng)　劉國道

摘 要 為研究不同鉬水平對柱花草根瘤菌生長的影響，將4株柱花草根瘤菌接種于不同鉬濃度的YMA固體和液體培養(yǎng)基上，通過對根瘤菌生長定性和定量分析，確定不同鉬處理對根瘤菌的影響。結(jié)果表明：缺鉬處理對4株根瘤菌的生長均無顯著影響；在鉬處理下，4個菌株對鉬的耐受能力存在差異，菌株P(guān)N13-3的耐鉬能力最強(qiáng)，可以耐受的鉬濃度為3 000 mg/L，LZ3-2和YM11-1次之，RJS9-2最差，可以耐受的鉬濃度為1 500 mg/L；高濃度鉬處理使菌株P(guān)N13-3、YM11-1（≥2 000 mg/L）和LZ3-2（≥2 500 mg/L）的對數(shù)生長期延長，穩(wěn)定生長期縮短，使菌株RJS9-2（≥500 mg/L）遲緩期延長，對數(shù)生長期縮短。

關(guān)鍵詞 根瘤菌；鉬；生長曲線；柱花草

中圖分類號 S541 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The effects of different molybdenum（Mo）levels on the growth of four rhizobial strains isolated from Stylosanthes were investigated using the solid yeast mannitol agar（YMA）and liquid YMA medium. The growth of rhizobial strains was evaluated by qualitative and quantitative analysis under different Mo treatments. The results showed that no significant difference was observed among the four tested rhizobial strains without Mo addition. Rhizobial strains exhibited variations in Mo tolerance. The rhizobial strain PN13-3 showed higher Mo tolerance than the other three strains，as reflected by better growth performance under 3 000 mg/L Mo treatment，whereas the growth of RJS9-2 was significantly inhibited by 1 500 mg/L Mo treatment. Furthermore，PN13-3 and YM11-1 with Mo supply above 2 000 mg/L，and LZ3-2 at a Mo concentration greater than 2 500 mg/L exhibited increased the logarithmic growth phase and decreased the stationary phase，while 500 mg/L Mo treatment increased the lag phase and decreased the logarithmic growth phase of RJS9-2.

Key words Rhizobia； molybdenum； growth curve； Stylosanthes

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.004

根瘤菌-寄主共生體系對環(huán)境因子的適應(yīng)能力由寄主、根瘤菌及共生體對環(huán)境的適應(yīng)能力決定[1]，在選擇根瘤菌菌劑之前充分了解環(huán)境條件及植物、菌株對環(huán)境極端因子的耐受能力是保證接種效果的關(guān)鍵。鉬不僅是作物生長所必須的微量營養(yǎng)元素，還是固氮酶的重要組成成分，參與根瘤的形成與固氮[2-3]。有研究用釩、鎢等元素代替鉬，雖然合成了相應(yīng)的鐵蛋白，但是根瘤固氮酶無活性，但在加入鉬后立即有固氮酶活性，說明鉬在固氮酶中不僅僅起到電子傳遞的作用，鉬還是固氮酶活性中心不可或缺的成分[4]。國內(nèi)外在鉬對根瘤菌影響的研究主要集中于鉬對寄主-根瘤菌共生體系的影響，鉬的含量直接影響豆科植物結(jié)瘤和固氮能力[5]，過高或過低的鉬會導(dǎo)致豆科植物的結(jié)瘤數(shù)下降，有效根瘤數(shù)減少，根瘤固氮能力減弱，從而導(dǎo)致植物的氮含量和產(chǎn)量減少[6-7]；研究表明對植物葉片噴施適量的鉬肥可以顯著提高作物的結(jié)瘤量和產(chǎn)量[8-9]，在生產(chǎn)中對菜豆[10]、大豆[11-12]、蠶豆[13]、綠豆[14]等豆科植物增施一定量的鉬能顯著提高作物的產(chǎn)量。陳俊在鉬對大豆根瘤菌影響的研究中表明：鉬是根瘤菌生長的必需元素，缺鉬時大豆根瘤菌生長緩慢，繁殖擴(kuò)增受到嚴(yán)重抑制，適量供鉬能促進(jìn)大豆根瘤菌的生長繁殖；而且大豆根瘤菌對鉬濃度的適應(yīng)范圍較廣，從10 mg/L到1 000 mg/L根瘤菌都能較好地生長，供鉬過量會抑制根瘤菌的生長，但不同菌株的耐鉬能力不同[15]。國內(nèi)外尚無鉬對柱花草根瘤生長影響的研究，本研究在純培養(yǎng)下通過不同鉬水平的處理研究鉬對4株柱花草根瘤菌生長的影響，確定不同菌株生長的最適鉬濃度，以期為柱花草根瘤菌的培養(yǎng)和柱花草栽培中鉬的施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 參試菌株

參試菌株為保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所牧草研究中心的4株柱花草高效根瘤菌菌株，分別分離自云南保山、云南元謀、四川攀枝花和廣西柳州，菌株RJS9-2 與YM11-1、PN13-3及LZ3-2相比具有較強(qiáng)的耐鹽能力，但耐酸能力較差[16]。菌株詳細(xì)信息如表1。

1.2 方法

1.2.1 不同鉬濃度培養(yǎng)基的配制 以YMA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[17]，以鉬酸銨[（NH4）6Mo7O24·4H2O）]，分析純（含量>99.0%）為鉬源，配置不同鉬濃度的YMA培養(yǎng)基0.5 L，使培養(yǎng)基最終鉬濃度分別為0、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500 mg/L，調(diào)節(jié)pH值為6.8，分裝到50 mL三角瓶中（25 mL/瓶），設(shè)3次重復(fù)，每個鉬濃度增加一瓶100 mL的培養(yǎng)基用于測定OD600值時調(diào)零，用封口膜封口，121 ℃滅菌30 min后備用。在各濃度剩余的液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉（15 g/L），121 ℃滅菌30 min，待溫度降至80 ℃左右倒入培養(yǎng)皿（9 cm）中制備固體培養(yǎng)基，每個濃度3個重復(fù)。

1.2.2 菌種活化、接種及培養(yǎng) 將待測菌株從YMA斜面培養(yǎng)基中挑出，活化于YMA固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。用滅菌的牙簽段（1 cm）挑取菌落分別接種于不同鉬濃度的液體培養(yǎng)基中，在180 r/min，28 ℃搖床上培養(yǎng)，計(jì)時，在8、16、32、64、128 h時取部分菌液通過分光光度計(jì)測定波長為600 nm的吸光值（以相應(yīng)鉬濃度的未接菌培養(yǎng)基調(diào)零）。

用接種環(huán)挑取各菌株分別接入不同鉬濃度固體培養(yǎng)基上，接種前在培養(yǎng)皿底部用記號筆畫出最大的內(nèi)接正方形圖案，用對角線劃分為4個區(qū)域，將4個菌株分別接種到4個區(qū)域的培養(yǎng)基上，接種寬度為1 cm，菌株間不能交叉，將接種后的平板放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至無鉬處理的培養(yǎng)基上4個菌株都長好后觀察各菌株在不同鉬濃度培養(yǎng)基上的生長情況，并通過生長最好記“+++”，一般記“++”，生長差記“+”，不生長記“-”的方式統(tǒng)計(jì)菌株生長狀況（圖1）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)中所有的數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2000、JMP9等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析，以Tukey HSD作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，顯著性水平p<0.01。通過JMP9軟件對根瘤菌生長數(shù)據(jù)進(jìn)行變量代換和回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鉬濃度固體培養(yǎng)基對柱花草根瘤菌生長的影響

固體培養(yǎng)可以直觀定性的反映菌株生長情況，由圖1和表2可知，菌株LZ3-2在鉬濃度0～4 000 mg/L的固體培養(yǎng)基上都有菌落，在濃度超過2 500 mg/L的培養(yǎng)基上生長受到抑制，菌落數(shù)量減少；菌株YM11-1在鉬濃度0～4 000 mg/L的培養(yǎng)基上都能生長，在濃度超過2 000 mg/L的培養(yǎng)基上生長受到抑制，菌落數(shù)量減少；菌株RJS9-2在鉬濃度為0～3 500 mg/L的培養(yǎng)基上都能生長，在濃度超過1 000 mg/L的培養(yǎng)基上生長受到抑制，菌落數(shù)量減少；菌株P(guān)N13-3在鉬濃度0～4 500 mg/L的培養(yǎng)基上都能生長，在濃度超過3 000 mg/L的培養(yǎng)基上生長受到抑制，菌落數(shù)量減少。

2.2 鉬處理對柱花草根瘤菌生長曲線的影響

根瘤菌接種到液體培養(yǎng)基后，生長狀況可以通過在600 nm的吸光值來反映，通過回歸分析可以確定根瘤菌的生長規(guī)律及外界條件對生長的影響。圖2為4個菌株在不同鉬濃度處理下的生長曲線及相應(yīng)的回歸分析。由圖2-A可知，菌株YM11-1在鉬濃度為0～500 mg/L時，菌液OD600值在0～16 h變化不大，在16～32 h急劇上升，在32～64 h緩慢上升，超過64 h后OD600值開始下降；在鉬濃度為1 500～3 000 mg/L時，菌液OD600值在0～16 h變化不大，在16～64 h急劇上升，無平緩增長期，超過64 h后OD600值開始下降；在鉬濃度超過3 500 mg/L時，根瘤菌在培養(yǎng)全過程OD600值變化不大。由菌株在各時期的回歸方程可知，菌株YM11-1在鉬濃度0～2 500 mg/L時，菌株OD600值與培養(yǎng)時間顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)都大于0.80；鉬濃度大于3 000 mg/L時菌株OD600值與培養(yǎng)時間相關(guān)不顯著，且相關(guān)系數(shù)都小于0.70。

由圖2-B可知，菌株P(guān)N13-3在鉬濃度為0～1 500 mg/L時，菌液OD600值在0～16 h變化不大，在16～32 h急劇上升，在32～64 h緩慢上升，超過64 h后OD600值開始下降；在鉬濃度為2 000～3 000 mg/L時，菌液OD600值在0～16 h變化不大，在16～64 h急劇上升，無平緩增長期，超過64 h后OD600值開始下降；在鉬濃度超過3 500 mg/L時，根瘤菌在培養(yǎng)全過程OD600值變化不大。由菌株在各時期的回歸方程可知，菌株P(guān)N13-3在鉬濃度0～3 000 mg/L時，菌株OD600值與培養(yǎng)時間顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)都大于0.80；鉬濃度大于3 500 mg/L時菌株OD600值與培養(yǎng)時間相關(guān)不顯著，且相關(guān)系數(shù)都小于0.50。

由圖2-C可知，菌株LZ3-2在鉬濃度為0～2 000 mg/L時，菌液OD600值在0～16 h變化不大，在16～32 h急劇上升，在32～64 h緩慢上升，超過64 h后OD600值開始下降；在鉬濃度為2 500～3 000 mg/L時，菌液OD600值在0～16 h變化不大，在16～32 h急劇上升，32 h后OD600值仍增加較快，但略慢于16～32 h，超過64 h后OD600值開始下降；在鉬濃度超過3 000 mg/L時，根瘤菌在培養(yǎng)全過程OD600值變化不大。由菌株在各時期的回歸方程可知，菌株LZ3-2在鉬濃度0～2 000 mg/L時，菌株OD600值與培養(yǎng)時間顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)都大于0.93；鉬濃度大于2 000 mg/L時菌株OD600值與培養(yǎng)時間相關(guān)不顯著，且相關(guān)系數(shù)都小于0.60。

由圖2-D可知，菌株RJS9-2在鉬濃度為0～1 500 mg/L時，菌液OD600值在8～32 h急劇上升，在32～64 h緩慢上升，超過64 h后OD600值開始下降；在鉬濃度為2 000 mg/L時，菌液OD600值在0～16 h變化不大，在16～32 h急劇上升，32 h后OD600值無明顯變化，超過64 h后OD600值開始下降；在鉬濃度超過2 000 mg/L時，根瘤菌在培養(yǎng)全過程OD600值變化不大。由菌株在各時期的回歸方程可知，菌株LZ3-2在鉬濃度0～1 500 mg/L時，菌株OD600值與培養(yǎng)時間顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)都大于0.92；鉬濃度大于1 500 mg/L時菌株OD600值與培養(yǎng)時間相關(guān)不顯著，且相關(guān)系數(shù)都小于0.60。

2.3 4個菌株生長最適鉬濃度的確定

根瘤菌穩(wěn)定期是研究該菌株生長及生理的最佳時期，圖3為根據(jù)4株根瘤菌在穩(wěn)定期（64 h）在不同鉬處理的生長狀況。由圖3可知，缺鉬處理對4個根瘤菌菌株的生長無影響，菌株P(guān)N13-3在鉬濃度為0～3 000 mg/L時生長不受影響，鉬濃度超過3 000 mg/L時菌株生長受到嚴(yán)重的抑制，趨于不生長；菌株RJS9-2在鉬濃度為0～500 mg/L時生長不受影響，超過500 mg/L時菌株生長受到一定程度的抑制，當(dāng)鉬濃度達(dá)2 500 mg/L，菌株生長受到嚴(yán)重的抑制，趨于不生長；菌株LZ3-2和YM11-1在鉬濃度為0～1 500 mg/L時生長不受影響，超過1 500 mg/L時菌株生長受到一定程度的抑制，當(dāng)鉬濃度達(dá)3 500 mg/L，菌株生長受到嚴(yán)重的抑制，趨于不生長。

3 討論

根瘤菌抗性試驗(yàn)常通過固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基分別從定性和定量2個方面進(jìn)行確定[16]，固體培養(yǎng)基可以直觀地觀察菌株的生長及污染狀況，液體培養(yǎng)基則可以定量地確定菌液中菌的含量及變化，但液體培養(yǎng)基有污染不易被發(fā)現(xiàn)的缺點(diǎn)，故須通過2種培養(yǎng)基相互驗(yàn)證確定鉬處理對柱花草根瘤菌生長的影響。本研究中4個柱花草根瘤菌在不同鉬水平固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中生長趨勢一致，缺鉬處理對根瘤菌生長無顯著影響，4個菌株對鉬的耐受差異較大，菌株P(guān)N13-3耐鉬能力最強(qiáng)，為3 000 mg/L；菌株LZ3-2、YM11-1耐鉬能力次之，為1 500 mg/L；菌株RJS9-2耐鉬能力最差僅為500 mg/L。陳俊[15]在研究3株大豆根瘤菌耐鉬能力中發(fā)現(xiàn)缺鉬和高濃度鉬處理都會抑制根瘤菌生長，且不同菌株的耐鉬能力存在顯著差異，高濃度鉬抑制根瘤菌生長與本研究結(jié)果一致，但缺鉬處理結(jié)果有較大的差異，研究表明鉬主要參與根瘤菌與寄主共生結(jié)瘤和固氮過程，并不是根瘤菌純培養(yǎng)的必須成分[2]，故缺鉬處理對根瘤菌生長無影響的結(jié)果是合理的，可能是由于菌株類型、培養(yǎng)條件的不同造成的差異。

根瘤菌的生長經(jīng)歷遲緩期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定生長期和衰亡期，生長呈“S”型曲線，外界條件的變化對各時期開始和持續(xù)時間有顯著的影響[18]，從而影響生長對曲線的擬合，故“S”型生長曲線也作為檢測菌株生長是否正常的依據(jù)，在對4各菌株生長曲線的擬合中發(fā)現(xiàn)，生長曲線可以完美的擬合根瘤菌的生長，當(dāng)鉬濃度嚴(yán)重影響根瘤菌生長時，曲線出現(xiàn)相關(guān)不顯著，因此可以將能否顯著的擬合生長曲線來界定根瘤菌的耐鉬能力。結(jié)合不同鉬濃度下固體、液體培養(yǎng)基中4各菌株的耐鉬能力的結(jié)果，可以確定：RJS9-2的最適鉬濃度為1 500 mg/L，LZ3-2的最適鉬濃度為2 000 mg/L，菌株YM11-1的最適生長鉬濃度為2 500 mg/L，PN13-3的最適鉬濃度為3 000 mg/L。

在一定的濃度范圍OD600值雖能顯著的擬合生長曲線，但隨濃度的增加生長曲線不同時期也存在差異，鉬處理對根瘤菌各時期的影響分為2種類型，高濃度鉬處理使菌株RJS9-2遲緩期延長，對數(shù)生長期縮短，使菌株P(guān)N13-3、LZ3-2和YM11-1的對數(shù)生長期延長，穩(wěn)定生長期縮短。從分類上看菌株P(guān)N13-3、LZ3-2和YM11-1親緣關(guān)系較近，都屬于Bradyrhizobium sp.，RJS9-2屬于Bradyrhizobium yuanmingense，與3者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[19]，且菌株RJS9-2雖為慢生根瘤菌，該菌株卻具有慢生根瘤菌不具備的特性，比如耐鹽性較強(qiáng)，是普通慢生根瘤菌耐鹽能力的3倍以上[16]，這些可能是造成生長曲線在鉬的影響下存在差異的主要原因。

參考文獻(xiàn)

[1] Brockwell J， Pilke A， et al. Soil pH is a major determinant of the numbers of naturally occurring Rhizobium meliloti in non-euhivate soils in central Newsouth Wales Australian[J]. OF ExP， Agrie， 1991， 31： 211-220.

[2] Hageman R V， Burris R H. Nitrogenase and nitrogenase reductase associate and dissociate with each catalytic cycle[J]. Proc Nat Acad Sci USA， 1978， 75： 2 699-2 702.

[3] Brkic S， Milakovic Z， Kristek A， et al. Pea yield and its quality depending on inoculation，nitrogen and molybdenum fertilization[J]. Plant Soil Environ， 2004， 50（1）： 39-45.

[4] Masson-Boivin C， Giraud E， Perret X， et al. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes： how many rhizobium recipes？[J]. Trends Microbiol， 2009， 17： 458-466.

[5] Sharma M S， Upadhyay M S， Tomar S S. Water use efficiency of some rainfed crop on a Vertisol as influenced by soil micronutrients and straw mulching[J]. Ind J Soil Sci， 1988， 33： 387-390.

[6] Jongruaysup S， Ohara G W， Dell B， et al. Effects of low molybdenum seed on nodule initiation，development and N2 fixation in black gran（Vigna mungo L.）[J]. Plant Soil， 1993， 156： 345-348.

[7] Chahal V P S， Chahal P P K. Interaction studies between Rhizobium leguminosarum and Meloidogyne incognita on pea （Pisum sativum L.） growth under different concentrations of molybdenum[J]. Dev Plant Soil Sci， 1991， 45： 673-676.

[8] Albuquerque H C， Pegoraro R F， Vieira N M B， et al. Capacidade nodulatória e características agrono^micas de feijoeiros comuns submetidos àadubac， a～ o molíbdica parceladae nitrogenada[J]. Revista Ciência Agrono^ mica， 2012， 43（2）： 214-221.

[9] Vieira S M， Ronzelli Júnior P， Daros E， et al. Nitrogênio，molibdênio e inoculante para a cultura do feijoeiro[J]. Scientia Agraria， 2000， 1（1）： 63-66.

[10] Marislaine Alves de Figueiredo， Damiany Pádua Oliveira， Bruno Lima Soares. Nitrogen and molybdenum fertilization and inoculation of common bean with Rhizobium spp. in two oxisols[J]. Acta Scientiarum Agronomy Maringá， 2016， 38（1）：85-92.

[11] Asei Rechiatu， Ewusi-Mensah Nana， Abaidoo Robert Clement. Response of soybean（Glycine max L.） to rhizobia inoculation and molybdenum application in the Northern Savannah Zones of Ghana[J]. Journal of Plant Sciences， 2015， 3（2）： 64-70.

[12] 劉志明， 王培秋， 筒自強(qiáng)， 等. 大豆推薦施肥技術(shù)[J]. 吉林農(nóng)業(yè)， 2011（4）： 140-141.

[13] 孫建華， 童依平， 劉全友， 等. 鉬肥對農(nóng)牧交錯帶豆科作物增產(chǎn)的重要意義[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2001（4）： 77-79.

[14] Muhammad T， Asghar A， Noor-ul-Aabidin. Effect of molybdenum and seed inoculation on growth， yield and quality of mungbean[J]. Crop & Environment， 2011， 2（2）： 37-40.

[15] 陳 俊. 鉬對大豆、 根瘤菌生長及其共生性狀的影響[D]. 廣州： 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010.

[16] 黃艷霞， 董榮書， 白昌軍， 等. 柱花草根瘤菌的耐酸性與耐鹽性[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2010， 31（6）： 914-919.

[17] 董榮書， 張 潔， 黃艷霞， 等. 熱研2號柱花草高效固氮根瘤菌的篩選[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2013， 34（7）： 1 247-1 251.

[18] Alcamo I E著. 微生物學(xué)[M]. 林稚蘭， 等譯. 北京：科學(xué)出版社， 2002.

[19] 董榮書， 黃艷霞， 劉國道， 等. 柱花草根際土著根瘤菌的豐度及其遺傳多樣性[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2010， 31（6）： 908-913.