孫琪 陳霞 賈澤沖 劉云豪 賴杭桂 陳松筆 朱文麗

摘 要 花粉誘導是獲得無融合生殖的一個重要途徑。本試驗采用輻射花粉對雌花授粉進行木薯無融合生殖活體誘導，獲得了由60Coγ射線輻射花粉誘導的孢子體無融合生殖種質(zhì)。結果表明：60Coγ射線輻射花粉誘導木薯無融合生殖的途徑是有效的，且輻射劑量及品種的選擇對木薯無融合生殖誘導具一定的影響。本次試驗共收獲23株植株，通過對誘導子代的細胞學及共顯性EST-SSR分子標記檢測，顯示其23株誘導子代為雜合二倍體；進一步采用SRAP分子標記對各子代的異質(zhì)雜合性或同質(zhì)雜合性鑒定，發(fā)現(xiàn)2株為SC5遺傳同質(zhì)體。

關鍵詞 木薯；輻射花粉；無融合生殖；倍性鑒定；分子標記

中圖分類號 S533 文獻標識碼 A

Induction and Identification of Apomixis

by Radiation Pollen in Cassava

SUN Qi1， CHEN Xia1， JIA Zechong1， LIU Yunhao1， LAI Hanggui1 *， CHEN Songbi2， ZHU Wenli2

1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract Pollen induction is an important way to obtain apomixis. In this study， the pollen which radiated was used to pollinate with female flowers for inducing cassava apomixis in the living body， and acquired the sporophyte apomixis germplasmthe induced by the pollen that radiated under 60Coγ-ray. The results showed that： The way to induce cassava apomixis by 60Coγ-ray radiation pollen was effective， and the choice of radiation dose and variety had a certain influence on the induction of cassava apomixis. A total of 23 plants were harvested in this study， and the offsprings were detected by cytological and codominant EST-SSR markers， it showed that the 23 offsprings were heterozygous diploid； Furthermore， SRAP molecular markers were used to identify heterozygous heterozygosity or homozygous heterozygosity for each progeny， and two offsprings were found to be genetic homogeneity of SC5.

Key words Manihot esculenta Crantz； radiated pollen； apomixis； ploidy identification； molecular markers

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.001

無融合生殖（Apomixis）是指不經(jīng)過精卵融合即可形成胚從而進行種子繁殖的方式， 是一種可介于有性生殖和無性生殖的特殊的生殖方式[1]。無融合生殖可分為無孢子生殖、孢子體無融合生殖和配子體無融合生殖三種類型，無孢子生殖和孢子體無融合生殖由胚珠細胞或大孢子母細胞有絲分裂形成胚囊，可產(chǎn)生與親代一致的體細胞遺傳同質(zhì)體，即二倍體無性種子；而配子體無融合生殖是指卵細胞未經(jīng)過受精過程而形成胚并發(fā)育為個體的生殖方式，產(chǎn)生的個體多為單倍體，加倍后可獲得穩(wěn)定一致的純合二倍體。因此，不同類型的無融合生殖遺傳特性在固定雜種優(yōu)勢、縮短育種年限、提供單倍體材料、積累優(yōu)良基因等具重要的生產(chǎn)意義和育種價值[1-2]。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是全球三大塊根作物之一，是熱帶及亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟及能源作物。由于木薯為異花授粉，基因型高度雜合，生產(chǎn)上主要通過其種莖進行無性繁殖。木薯的無融合生殖不僅能固定高度雜合的基因型，積累和傳播植物的優(yōu)良基因及簡化雜交制種方法，對于具有高營養(yǎng)的薯類等農(nóng)作物，通過無融合生殖還可切斷病毒的傳播[3]；若通過孤雌生殖創(chuàng)制單倍體或純合二倍體材料，則對木薯遺傳圖譜構建、基因差異表達、QTL性狀定位等分子生物學研究具有重大意義。據(jù)相關研究報道，木薯的無融合生殖可通過種間雜交產(chǎn)生，Nassar和Freitas等相繼發(fā)現(xiàn)了木薯栽培種與野生種雜交后代無融合生殖現(xiàn)象的存在，并證實了木薯的兼性無融合生殖屬性，在胚胎學鑒定中發(fā)現(xiàn)其珠心為多胚結構，并且受環(huán)境高度影響[3-7]。

育種實踐證明，花粉誘導是獲得植物無融合生殖的一個有效途徑，失活或變異花粉授粉后可以提高子房內(nèi)激素水平，使果實膨大，促進種子發(fā)育[8]。李春秋等[9]曾采用風干后的花粉誘導獲得玉米無融合生殖植株。Bekir等[10]應用核桃失活花粉與鮮蘋果花粉對Tokat-1核桃進行混合蒙導授粉，無融合生殖座果率達6.4%。此外，研究者在核桃、蘋果、黃瓜、甜瓜等多種作物上進行了輻射花粉授粉誘導，并獲得了單倍體后代[11-14]。本研究通過60Coγ射線輻射木薯花粉，采用輻射后的花粉與木薯雌花授粉，對授粉后雌花發(fā)育進行觀察，統(tǒng)計比較不同輻射劑量及不同品種處理后稔實率和坐果率的差異，對誘導子代進行細胞學鑒定及分子標記檢測，成功篩選出木薯遺傳同質(zhì)體無融合生殖種質(zhì)。這對木薯生殖發(fā)育特性及無融合生殖育種研究具有重要意義，并可能為進一步誘導木薯卵細胞孤雌生殖途徑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為木薯華南5號（SC5）、華南7號（SC7）、華南10號（SC10） 3個栽培品種，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所提供。于2016年3月種植采用種莖無性繁殖方式種植于海南大學儋州校區(qū)農(nóng)科基地，每品種種植100株，株行距為1.0 m×1.5 m。試驗所用引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 花粉誘導無融合生殖方法 開花前1 d采集木薯供體材料的雄花（SC5、SC7、SC10），裝入防水紙袋，雄花在海南金原新技術有限公司進行60Coγ射線輻射（輻射劑量梯度為500～600、800～900 Gy）處理后，將雄花進行低溫干燥保存。當天上午9 ： 00左右選擇即將開放的雌花進行套袋隔離，于下午13 ： 00～14 ： 00用輻射過的雄花對SC5、SC10剛開放的雌花柱頭進行異品種授粉后套袋隔離，并掛牌標記親本組合、數(shù)量和日期。授粉2～3 d后解除套袋，開花后7～10 d子房膨大且形成幼果時統(tǒng)計稔實率，100 d左右收獲成熟果實并統(tǒng)計其坐果率，收集種子播種于育苗盤中。

1.2.2 花粉誘導子代倍性鑒定 采用美國BD公司FACSCalibur流式細胞儀（Flow Cytometry）對誘導子代植株葉片的DNA含量快速檢測，使用CellQuest Pro軟件進行分析。木薯嫩葉細胞染色體觀察參照張健等[15]木薯葉片染色體制片技術，具體流程為：取材時間為上午8 ： 30～10 ： 00，用0.1%秋水仙素與0.002 mol/L 8-羥基喹啉混合液室溫預處理3 h，經(jīng)固定液（無水酒精 ∶ 氯仿 ∶ 冰醋酸=6 ∶ 3 ∶ 1）固定，用1 mol/L鹽酸60 ℃下解離8 min，再用改良苯酚品紅染色壓片鏡檢，可取得良好的分裂相效果。

1.2.3 EST-SSR分子標記鑒定純合體和雜合體

利用EST-SSR特異性地代表一個基因的“表達序列標簽”，對木薯誘導子代的純合性和雜合性進行鑒定。首先，以親本DNA作為模板，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出呈現(xiàn)共顯性的EST-SSR標記引物，以顯示為2條帶對應1對雜合等位基因。再以子代的DNA作為模板，用篩選好的標記引物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將擴增出的條帶與親本的條帶進行比對，由于SSR為共顯性遺傳，所以擴增出2條帶的視其為雜合，擴增出1條帶的視其為純合[16-17]。具體操作參照韋祖生等[18]木薯EST-SSR標記方法。

1.2.4 SRAP分子標記鑒定異質(zhì)雜合性或同質(zhì)雜合性 利用SRAP對木薯誘導子代和親代的多態(tài)性標記進行比較檢測，可對木薯無融合生殖的異質(zhì)雜合性或同質(zhì)雜合性進行鑒定。具體步驟參照齊蘭等[19]木薯SRAP標記方法稍加改進：①采用改良CTAB法提取葉片基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性及濃度，稀釋到工作液濃度20 ng/μL，保存在-20 ℃冰箱中備用；②用親本DNA對64對SRAP引物進行篩選，篩選出目的引物后依據(jù)SRAP反應體系（共20 μL，含2×PCR mix 10 μL、ddH2O 6 μL、Forward primer 1 μL、Reverse primer 1 μL、DNA模板2 μL）對子代DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測；③取8 μL PCR產(chǎn)物點樣，用1倍TAE緩沖液，在100 V電壓下電泳40 min后，用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MS Excel軟件對數(shù)據(jù)進行處理，使用SPSS 17.0，DPS7.05軟件進行方差分析以及多重比較分析。數(shù)據(jù)顯著性差異分析采用Student-Newman -Keulq法、u測驗和t測驗等進行比較，水平為p =0.05、p=0.01。釆用標記字母的多重比較結果表示方法標出各差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 輻射花粉誘導木薯無融合生殖稔實率和坐果率的統(tǒng)計

2.1.1 不同輻射劑量的花粉誘導對木薯無融合生殖頻率的影響 如表1所示，自然授粉的木薯雌花（CK）稔實率及坐果率極顯著高于輻射誘導的稔實率及坐果率，經(jīng)60Coγ射線輻射后的花粉用以雌花授粉造成稔實率及坐果率大幅降低；而輻射劑量的大小對木薯的稔實率和坐果率也有較大影響，其中500～600 Gy輻射花粉要顯著高于800～900 Gy輻射花粉誘導的稔實率和坐果率，說明較低的輻射劑量更有利于授粉后木薯子房的生長發(fā)育。而隨著輻射劑量的增大，誘導后木薯的稔實率和結實率降低，說明隨著輻射劑量的增加會引起花粉變異加大，而鑒定結果則顯示較高劑量的輻射更有利于無融合生殖的誘導。

2.1.2 不同品種對輻射花粉誘導無融合生殖頻率的影響 表2統(tǒng)計結果所示，用輻射后的木薯花粉對SC5和SC10兩個品種進行授粉，授粉后SC5的稔實率和坐果率顯著高于SC10的稔實率和坐果率。試驗表明，在采用物理方法60Coγ射線處理花粉誘導木薯無融合生殖時，不同基因型的材料不僅對誘導無融合生殖稔實率和坐果率產(chǎn)生影響，且之后篩選出的無融合生殖種質(zhì)來源于SC5品種，因此誘導過程中對品種材料的選擇是必要的。

2.2 花粉誘導子代出苗率統(tǒng)計

本次試驗收集誘導后的木薯種子共83粒，按粒播種于育苗盤正常管理，共有23株出苗，其中SC5有14株，SC10有9株。出苗率為27.7%。圖1 為輻射花粉誘導獲得的木薯無融合生殖子代植株。

2.3 木薯誘導子代的倍性鑒定

對23株木薯輻射花粉誘導的子代種苗的葉片進行流式細胞術及染色體倍性檢測，鑒定結果表明，23株花粉誘導子代均為二倍體，葉片DNA含量與正常二倍體對照相同，體細胞染色體數(shù)2n=2x=36（圖2）。該批子代植株中未發(fā)現(xiàn)單倍體或多倍體。

2.4 EST-SSR標記鑒定子代的純合性

2.4.1 EST-SSR引物篩選 以SC5和SC10作為模板對159對木薯EST-SSR標記引物進行篩選，共篩選出6對引物，對應6對等位基因，因此可以選擇該6對引物來鑒定木薯輻射花粉誘導子代的基因型純合性。表3為篩選的6對EST-SSR引物及其擴增條件。

2.4.2 誘導子代植株的純合性鑒定 利用篩選出的6對條帶清晰的雙條帶EST-SSR引物對23株子代植株的純合性進行鑒定。結果顯示，14株SC5及9株SC10的誘導子代在6對引物中均擴增出相應的雙條帶型，這表明在該6對等位基因位點表現(xiàn)為雜合基因型，可知這23株木薯誘導子代均為雜合體植株，沒有出現(xiàn)單條帶型的卵細胞孤雌生殖單倍體或純合二倍體植株。圖3為引物CESR-0831 對SC5誘導子代的鑒定結果，圖4為引物CESR-0604對SC10誘導子代的鑒定結果。

2.5 SRAP分子標記鑒定異質(zhì)雜合性或同質(zhì)雜合性

2.5.1 SRAP引物篩選 利用SC5和SC10作為模板對64對木薯SRAP標記引物進行PCR擴增。其中SC5作為模板篩選出穩(wěn)定性好、條帶清晰且有差異擴增的18對引物，以SC10作為模板篩選出了15對條帶清晰且多態(tài)性明顯的引物。SRAP標記引物篩選結果見表4。

2.5.2 誘導子代的SRAP標記鑒定 利用18對SC5及15對SC10篩選出的SRAP標記引物對23 株誘導子代進行分子標記鑒定，結果發(fā)現(xiàn)：14株SC5的誘導子代中有12株與親本SC5帶型具明顯差異，其中2株由800～900 Gy 60Coγ射線輻射誘導的子代與親本SC5帶型一致；而SC10的9株誘導子代均與親本SC10的帶型具明顯差異（圖5、6）。由此可以判斷本試驗60Coγ射線輻射花粉誘導獲得了2株與親本SC5基因型一致的遺傳同質(zhì)體，該2株遺傳同質(zhì)體為木薯的無融合生殖途徑產(chǎn)生，無融合生殖在誘導子代的發(fā)生頻率為8.7%。

3 討論

采用物理或化學及生物學方法誘導植物無融合生殖已有許多成功事例[20]，但木薯無融合生殖的人工干預誘導國內(nèi)外鮮有報道。在通過種間雜交獲得木薯無融合生殖種質(zhì)報道中，Nassar[21]認為，木薯的無融合生殖可能由于發(fā)生不正常的減數(shù)分裂所導致，或由于其他因素激活木薯中的某些基因，這些基因會使一些位于珠心或有性胚囊內(nèi)的體細胞發(fā)育形成無孢子生殖胚囊，從而形成了木薯的二倍體孢子生殖或無孢子生殖類型的兼性無融合生殖現(xiàn)象。由于木薯自然無融合生殖頻率極低，進行人工干預提高木薯無融合生殖頻率具備較好的應用前景。

不同植物在無融合生殖的機理方面存在很大差異，無融合生殖誘導會受多重因素的影響，如不同誘導技術、不同基因型材料、不同生育期、濃度劑量、外界環(huán)境因素等[22]。本試驗過程證實，木薯花粉輻射后誘導無融合生殖受輻射劑量和不同品種材料的影響，60Coγ 800～900 Gy劑量的誘導效果優(yōu)于500～600 Gy，且SC5品種誘導效果優(yōu)于SC10。所以，適宜輻射劑量的篩選及品種材料的選擇是必要的，這與許多相關研究觀點一致，如γ射線照射番茄花粉的有效劑量為5 000～7 000 R、小麥5 000～8 000 R、煙草5 500 R，X射線照射煙草的有效劑量為1 500 R[17]；而在甜瓜、黃瓜、核桃、胡楊等輻射花粉的誘導表明，不同基因型材料的差異會影響無融合生殖的誘導頻率[8， 23-25]。

由于無融合生殖類型多樣，所發(fā)生的機制也極為復雜，輻射花粉誘導大多應用于單倍體育種[11-14]，目前輻射花粉誘導技術機制還不完全清楚，無融合生殖遺傳同質(zhì)體的產(chǎn)生主要來源于無孢子生殖或二倍孢子體生殖途徑，其基因型與親本相同，子代繼承了親代固有的遺傳特性，形成遺傳上穩(wěn)定的可由種子繁殖的胚囊體細胞或孢原細胞的無性后代[26]。另外，試驗過程出現(xiàn)21株帶型與親本對照具明顯差異的二倍體誘導子代，經(jīng)EST-SSR檢測并未發(fā)現(xiàn)純合體現(xiàn)象，因此該21株可判斷為異質(zhì)雜合體，即由正常雜交所產(chǎn)生的雜種子代。不排除輻射后變異花粉也有可能參與受精，導致出現(xiàn)異質(zhì)雜合體現(xiàn)象，或者與木薯的兼性無融合生殖有關[3]。

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