任迎虹 劉松青 祁偉亮 羅翠華 龔壁燃 歐莉萍

摘要： 該研究以6個四川桑樹品種為對象，對供試桑樹品種進行連續(xù)的人工干旱處理，利用生理方法明確保護酶系（SOD）的變化規(guī)律，并采用硝基四氮唑藍（NBT）還原試驗進行超氧陰離子O-2·組織化學的可視化檢測。結果表明：隨著干旱脅迫的加劇，SOD的含量明顯高于對照組，其中SOD活性呈先升后降的變化趨勢，而超氧陰離子一直呈加重的趨勢。6個桑樹品種的SOD 含量從正常到中度脅迫都呈現不同程度的上升趨勢，上升趨勢明顯的品種是九龍拐和湖桑32，上幅分別為62.7%和60.1%，其次是云桑1號和荷葉白一號上幅，分別為52.2%、58.2%，油桑和充桑的上幅為50.8%和47.4%，說明SOD正發(fā)揮著積極的作用。在中度脅迫之后SOD 的含量與活性氧的水平表現出相反的趨勢，原因可能是隨著干旱脅迫的加劇，O-2·達到最大值且超出一定域值，從而導致SOD活性的降低。通過電鏡觀察發(fā)現，超氧陰離子由葉脈向周圍擴散，同時面積逐漸增大。其中，抗旱性強的品種湖桑32葉片表面茸毛比較長，且基部膨大，端部有明顯的刺狀突起，而抗旱性弱的品種荷葉白1號葉片表面茸毛比較細短且端部的刺狀突起不明顯，因此推測葉片表面茸毛的特性與抗旱性存在一定關系。

關鍵詞： 桑樹， 干旱脅迫， 超氧化物歧化酶， 超氧陰離子， 葉片表面茸毛

中圖分類號： Q945.78， S888.2文獻標識碼： A文章編號： 10003142（2017）09112208

Abstract： We used six mulberry varieties in Sichuan Province as the research object， by using physiological method and used NBT test to determine the activities of SOD and to study the changes of super oxygen anion （O-2·） in the leaf blade tissues under different drought conditions. The results showed that the SOD content of six mulberry varieties were significantly higher than those of the controls. The change trend of SOD activity was raised and then fell later， and super oxide anion grew steadily. Possible reasons were that reactive oxygen beyond a certain threshold， which led to SOD activity decreased. Under different drought conditions， from normal stress treatment to middle stress， the SOD content of six mulberry varieties also demonstrated rapid growth. Jiulonggui and Husang 32 showed a rising trend and increased by 62.7% and 60.1% obviously； followed by Yunsang 1 and Heyebai 1 raised to 52.2% and 58.2%； Yousang and Chongsang were increased to 50.8% and 47.4%， respectively. This showed that the SOD played an active and effective role to reduce O-2·. After moderate stress level of SOD and active oxygen showed the opposite trend， which showed significant degradation effect， and had a mechanism of active oxygen injury. Super oxide anion spread around the veins， area of super oxide anion gradually increased， which were observed by transmission electron microscope. It is obeserved that Husang 32 has its ability to eliminate the superoxide free radical， and its drought resistance abilities and leaf blade surface hairs were higher than that of Heyebai 1. Hence， it can be inferred that the length of leaf blade surface hairs has a certain relationship with drought resistance.

Key words： mulberry， drought stress， superoxide dismutas， super oxygen anion， leaf blade surface hairs

桑樹屬桑屬（Morus L.）桑科（Moraceae），我國約15個種，分布于北溫帶，屬于多年生的雙子葉落葉喬木，具有食用、藥用、材用及觀賞等多種利用價值，是一種重要的經濟作物（秦儉等，2010）。蠶桑產業(yè)是四川傳統(tǒng)特色產業(yè)，是四川省重點發(fā)展的“十大”農業(yè)產業(yè)之一。而干旱是桑樹種植最主要的非生物脅迫因素，嚴重影響桑葉的產量和品質。植物在受到干旱脅迫時會發(fā)生PSII和PSI的光抑制現象，而PSI的光抑制現象與活性氧（ROS）的產生緊密相關（Liu et al， 2004； Asada， 2006）。體內活性氧含量的增加，如過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O-2·），對植物的生長會產生不利影響（Strid et al， 1994； Yu et al， 2006； Pradedova et al， 2011）。因此，植物在干旱或者鹽脅迫下正常生長的關鍵是控制葉綠體中活性氧的平衡（Tseng et al， 2007）。為防止超氧化物對細胞體的破壞，植物將啟動酶和非酶的防御系統(tǒng)來有效清除活性氧，以保護細胞膜等免受氧化傷害，從而有利于維持其他生理代謝的正常進行 （Prochazkova et al， 2001； Gutteridge & Halliwell， 2010）。其中，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 在保護細胞免受氧自由基的毒害中發(fā)揮著重要作用（Kim et al， 2010），SOD通過歧化反應把O-2·轉化為H2O2，H2O2再被過氧化氫酶和氧化物酶轉化為H2O，從而達到清除細胞內氧自由基，來緩解植物受到的逆境脅迫（Tian & Lei， 2007； Miller et al， 2010）。因此，抗氧化酶的活性與植物的抗逆性強弱有關（Kochhar & Kochhar， 2005）。應朝陽等（2006）、謝亞軍等（2008）和陳珺（2013）分別采用不同的植物花生、甘草以及四種觀賞植物紅葉石楠、小葉黃楊、金葉女貞及大葉黃楊，研究土壤干旱脅迫下對活性氧代謝及保護酶活性的影響變化規(guī)律。任迎虹（2009）研究報道在干旱條件下桑樹保護酶活性隨干旱脅迫的加強而提高。

前人研究當中經常使用紫外—可見吸收分光光度的方法，進行檢測O-2·，但此法難以準確用于O-2·的定性分析。Donahue（1997）和Liang et al（2003）利用硝基四氮唑藍（NBT）還原法進行O-2·的組織化學定位， 此法測定靈敏度高。廖展如等（2003）模擬干旱脅迫利用NBT還原法，對水稻、棉花、小麥、玉米、油菜、花生等作物進行O-2·組織化學檢測、光鏡及電鏡觀察。在桑樹抗逆性研究中，利用硝基四氮唑藍還原法進行O-2·的研究報道比較少。因此，本研究以6個四川桑樹品種為研究對象，進行干旱脅迫處理，利用生理生化方法來明確活性氧（O-2·）及保護酶系（SOD）的變化規(guī)律，釆用電鏡細胞化學標記技術在亞細胞水平上對O-2·的空間分布進行定位，以研究活性氧在不同干旱脅迫下的變化規(guī)律，這為細胞學研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1 材料

供試材料充桑，荷葉白1號，九龍拐，油桑，湖桑32號，云桑1號。均采集于四川省西昌市蠶種場品保園，其中旱地對照材料為湖桑32號。

1.2 方法

1.2.1 干旱脅迫處理2015年4月室內模擬干旱條件對種子進行發(fā)芽后盆栽， 土壤混合比例（土壤∶營養(yǎng)土為1∶1）。7月，苗木高度在40 cm左右時，選擇長勢相對一致的苗木，對供試桑樹品種進行連續(xù)的人工干旱處理。實驗分成試驗組和對照組，每個品種為12盆，待各品種桑樹生長正常后，選取長勢基本一致的于5月初對試驗組進行水分脅迫。將干旱和對照處理均澆透水后再分別處理，試驗組停止?jié)菜?，自然失水，對照組每隔2 d澆一次水，每次每盆1 500 mL。

分別于土壤干旱處理后7、l4、21 d后的早上8：00取上部同葉位葉片，進行各項指標的測定，三次重復。測得田間最大持水量為34.85%，據此設為正常處理（含水量為85%～100%）、輕度干旱（含水量為65%～75%）、中度干旱（含水量為50%～65%）、重度干旱（含水量為30%～45%）。

1.2.2 O-2·組織化學檢測和SOD活性測定方法O-2·的可視化檢測方法是按照Wang et al（2011）的方法，作微小修改進行，選取抗旱性強的品種湖桑32和抗旱性弱的品種荷葉白1號進行電鏡觀察，觀察超氧陰離子在細胞內部的變化規(guī)律。SOD活性測定參考Beauchamp & Fridovich （1971）的測定方法。

1.2.3 數據統(tǒng)計分析所有數據均為3次重復的平均值，采用EXCEL和SPSS軟件（王滿蓮等，2014）進行數據統(tǒng)計分析。

2結果與分析

2.1 超氧化物歧化酶的活性變化

隨著干旱脅迫的加劇，SOD活性呈先升后降的變化趨勢，在各脅迫處理水平下，6個桑樹品種的水分含量變化存在顯著差異（P<0.05）。從CK到中度，各品種在干旱脅迫下持續(xù)升高并達到最大值（圖1），上升趨勢明顯的品種是九龍拐和湖桑32，分別升高了62.7%和60.1%，其次是云桑1號和荷葉白一號，分別升高了52.2% 、58.2%，油桑和充桑的分別升高了50.8%和47.4%，表明湖桑32和九龍柺的活性氧清除能力比較強。從中度到重度，SOD活性呈下降趨勢，各品種SOD活性從弱到強依次是荷葉白1號<油桑<充桑<云桑1號<九龍柺<湖桑32。這說明自由基活性氧濃度未超過傷害“閾值”時，保護酶SOD活性會表現出積極應對；而超過“閾值”后，保護酶SOD活性下降，從而進一步促使了膜脂過氧化。

2.2 脅迫條件下對活性氧積累的影響

隨著干旱脅迫的加劇，超氧陰離子的藍色斑點聚合產物面積呈上升的變化趨勢，面積越大表明植物對干旱脅迫的防御機制越差，抗旱性能力就越低。在正常處理水平下，6個桑樹品種的超氧陰離子藍色斑點聚合產物均有少量的積累，表明葉片本身也存在少量的超氧陰離子（圖2：a、e、i、m、q、u）。輕度處理下，6個桑樹品種的超氧陰離子的藍色斑點積累產物面積比較小且數目開始增加（圖2：b、f、j、n、r、v）。中度處理下，6個桑樹品種的超氧陰離子的藍色斑點積累產物主要集中在葉脈附近，斑點面積增大，且數目開始增加（圖2：c、g、k、o、s、w）。在重度干旱脅迫處理下，超氧陰離子（O-2·）的藍色斑點積累產物面積增大，且色度加深，其中湖桑32和九龍拐的的藍色斑點產物比較少（圖2：d、h），云桑1號和充桑的次之（圖2：l、p），荷葉白1號和油桑的最多（圖2：t、x）。這表明隨著干旱脅迫的加劇湖桑32和九龍拐的自身防御機制比較強，抗旱能力比較好，云桑1號和充桑次之，荷葉白1號和油桑的抗旱能力較弱。

2.3 干旱脅迫下對超氧陰離子的葉片表皮細胞化學定位觀察

隨著干旱脅迫的加劇，超氧陰離子的藍色斑點積累產物主要集中在葉脈附近，斑點面積逐漸增大，葉脈茸毛中的超氧陰離子積累也隨之發(fā)生變化。在正常處理下，葉脈和細胞表面的藍色斑點積累產物較淡（圖3：a、e），其中抗旱性強的湖桑32葉脈茸毛較長且呈透明狀，抗旱性弱的荷葉白1號葉脈茸毛較短（圖4：a、e）。在輕度處理下，葉脈中不同部位出現淡藍色斑點積累產物，葉脈茸毛末端部位有淡藍色的產物積累，表明超氧陰離子的積累相對比較少（圖3：b、f，圖4：b、f）。在中度處理下，葉脈部位的藍色斑點積累產物加深，細胞表面茸毛周圍的超氧陰離子逐漸增多，而葉脈茸毛中的超氧陰離子藍色斑點積累達到最大（圖3：c、g，圖4：c、g）。在重度處理下，細胞表面的超氧陰離子的積累產物面積增大，其中湖桑32在細胞表面及茸毛部位中的藍色斑點面積區(qū)域增大且茸毛部位尖端呈透明狀（圖3：d，圖4：d）；而荷葉白1號超氧陰離子的藍色斑點面積顏色較深、茸毛數量多顏色比較深（圖3：h，圖4：h），這表明抗旱性強的品種湖桑32超氧陰離子的清除能力比較強，荷葉白1號比較弱。

3討論

3.1 干旱脅迫下超氧化物歧化酶的活性變化

夏慧莉等（1999）研究表明，細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累能誘導細胞發(fā)生凋亡。通常細胞內有一系列有效的抗氧化防御機制，包括清除ROS的SOD、CAT、POD等，其中，SOD 是抵御活性氧自由基介導的氧化損傷的第一道防線，是抗氧化酶系統(tǒng)中的關鍵酶，SOD 能以O-2·為基質進行歧化反應（任永波等，2001）。隨著干旱脅迫的加劇，一旦活性氧水平超出一定域值，自由基產生與清除間的平衡失調，就會導致 SOD 酶活性的降低（林永英2002）。在本研究中，隨著干旱脅迫的加劇，SOD 活性總體呈現先上升后下降的變化趨勢，超氧陰離子一直呈加重的趨勢，6種桑樹SOD 活性變化與張旭穎等（2010）和陳珺（2013）的測定結果一致。SOD 的含量在中度脅迫下達到最大，說明SOD發(fā)揮著積極的作用。在中度脅迫之后SOD 的活性與活性氧的水平表現出相反的趨勢，原因可能是在重度處理下活性氧達到最大值，超出一定域值，從而導致抗氧化酶活性的降低。

3.2 超氧陰離子在細胞中的分布規(guī)律

葉脈系統(tǒng)是葉片里重要的水分輸導系統(tǒng)，也是運輸養(yǎng)分和光合產物的通道。葉脈密度和葉脈直徑等， 共同決定著葉脈系統(tǒng)的水力導度（Sack et al，2013）。隨著干旱脅迫加劇，超氧陰離子藍色斑點積累產物最先出現在葉脈中，并且面積區(qū)域逐漸增大，其可能原因是土壤水分缺失，葉片中葉脈區(qū)域最先表現出超氧陰離子的積累，這與葉脈的疏導性存在一定的關系。段喜華等（2003）認為，葉片表皮毛數量較多，可以減少空氣流對氣孔的影響，也減少葉表蒸騰，因此，葉表皮茸毛在一定程度上反映植物的抗旱能力和抗逆特性。趙述文等（1991）通過大豆不同抗旱性品種葉片電鏡觀察，發(fā)現抗旱性強的品種葉片茸毛粗而長，茸毛基部膨大，抗旱性弱的品種茸毛細而短，上面的刺狀突起不明顯。該研究通過電鏡觀察及O-2·的葉片、葉脈表皮細胞化學定位觀察，研究結果表明茸毛部位的超氧陰離子積累由基部向端部擴散，抗旱性強的品種湖桑32葉細胞表面茸毛比較長且端部比較尖。隨著干旱脅迫的加劇，在重度處理下，湖桑32葉脈中超氧陰離子積累藍色斑點產物顏色變淺，在茸毛的細胞基部和端部呈透明狀、中部顏色加深，這表明湖桑32的氧自由基的清除能力比較強。而抗旱性弱的品種荷葉白1號，葉脈表面茸毛比較短，超氧陰離子積累藍色斑點產物顏色并未發(fā)生明顯變化。推測隨著干旱脅迫的加劇，細胞表面茸毛越長能夠減少葉表蒸騰，同時對超氧陰離子的清除能力比較強，從而表現出較好的抗旱性。

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