余進(jìn)德 熊宏 宋健 陳海濤 劉小燭 丁勇

摘要： 油質(zhì)蛋白基因?qū)ΨN子中油體的形成至關(guān)重要，該研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對麻瘋樹的兩個(gè)油質(zhì)蛋白基因JcOle14.3和JcOle16.6在種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：兩個(gè)基因在種子發(fā)育初期（10～30 d）表達(dá)量逐漸升高，但表達(dá)水平均較低；40 d時(shí)表達(dá)量急劇增加并達(dá)到最高，而種子發(fā)育后期（50～55 d）兩個(gè)基因表達(dá)水平均逐漸降低。由此可初步推測，JcOle14.3和JcOle16.6基因的表達(dá)量可能與種子油脂積累量存在正相關(guān)。該研究結(jié)果為麻瘋樹油體形成機(jī)理和油質(zhì)蛋白的深入研究提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 麻瘋樹， 種子， 油質(zhì)蛋白， 熒光定量， 表達(dá)分析

中圖分類號(hào)： Q943.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 10003142（2017）09109605

Abstract： The oleosin gene is very important to the formation of oil body in seeds， present study analyzed the expression patterns of oleosin genes JcOle14.3 and JcOle16.6 in different development stages of Jatropha curcas seeds by quantity RTPCR， and the results showed that the expression levels of JcOle14.3 and JcOle16.6 were increased gradually at the early development stage （10-30 d） of seeds， but the levels were low. However， on the 40th day after pollinated， the expression levels of these two genes increased dramatically and arrived the highest， and the levels were reduced at the late development stage （50-55 d） of seeds. The results could be presumed that the expression 1evels of JcOle14.3 and JcOle16.6 may have the positively correlation with the lipid accumulation in the seeds.

Key words： Jatropha curcas， seeds， oleosin， quantity RTPCR， expression analysis

麻瘋樹 （Jatropha curcas） 為大戟科（Euphobiaceae）麻瘋樹屬（Jatropha）多年生落葉灌木或小喬木（劉志軍等，2005），主要分布于中美、南美、東南亞、印度和非洲（Choodhury，2001），在我國產(chǎn)于廣東、廣西、云南、四川、貴州、臺(tái)灣、福建和海南等地（張明生等，2005）。麻瘋樹植物油脂含量很高，并主要以油體的形式儲(chǔ)存于種子中，其含油率高達(dá)40%～60%（王巖等，2007），是目前最具潛力的生物柴油原料（王濤，2005；Wu et al，2009）。

植物油脂作為理想的生物柴油之一，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和種子中，但主要以油體的形式存在于種子中（Huang，1992，1996），并可為種子的萌發(fā)和幼苗的生長提供能量儲(chǔ)備（Wanner et al，1981）。油體由中性脂肪、磷脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成。從結(jié)構(gòu)上看，油體內(nèi)部主要為液態(tài)的三酰甘油酯中性脂肪，外層則被磷脂單分子層及附著于其上的油體結(jié)合蛋白所包被，而油體結(jié)合蛋白包括油質(zhì)蛋白（oleosin）、油體鈣蛋白（caleosin）、油體固醇蛋白A（steroleosinA）和油體固醇蛋白B（steroleosinB）（Tzen et al， 1990，1997；丁勇等，2012），其中oleosin最早被發(fā)現(xiàn)，且含量最豐富，占90%左右。研究表明，作為最主要的油體相關(guān)蛋白，oleosin可能對油體的形成、穩(wěn)定及油脂代謝等過程均起著重要的生物學(xué)作用（Tzen & Huang，1992；Chen et al，1999；Millichip et al ，1996；Naested et al，2000）。截至目前，oleosin基因已從麻瘋樹、芝麻（Sesamum indicum）（Chen et al，1999；Lin et al，2002）、油菜（Brassica campestris）（Murphy et al，1989；Keddie et al，1992；丁勇等，2008，2010）、水稻（Oryza sativa）（Frandsen et al，1996）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）（Naested et al，2000）等植物中分離克隆。Wu et al（1999）研究發(fā)現(xiàn)，oleosin基因以為數(shù)不多的基因家族形式存在，其中在裸子植物中僅發(fā)現(xiàn)一種oleosin基因，在被子植物中有兩種不同的oleosin蛋白異構(gòu)體，并且存在于同一油體上（Tzen et al，1998），而在麻瘋樹中，本課題組已克隆了兩個(gè)oleosin基因：JcOle14.3（GenBank：JX073623）和JcOle16.6（GenBank：JX073622）（宋健等，2016；熊宏等，2016），表明麻瘋樹中oleosin基因亦以基因家族的形式存在，該文在此基礎(chǔ)上對這兩個(gè)基因進(jìn)行了深入研究。

當(dāng)油體在植物種子中開始形成時(shí)，oleosin基因隨即轉(zhuǎn)錄并翻譯成油質(zhì)蛋白，這些油質(zhì)蛋白鑲嵌于油體表面，并且具有電荷斥力和空間位阻效應(yīng)，從而維持了油體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性（Tzen & Huang，1992）。Murphy et al（1989）研究表明，油菜種子在發(fā)育早期（花后前6周），oleosin 的mRNA表達(dá)量較低，而在花后6～12周，即油體的大量形成與穩(wěn)定時(shí)期，mRNA表達(dá)量迅速增高并維持在較高水平。同樣的結(jié)果顯示，在芝麻種子的發(fā)育過程中，oleosin基因亦有相似的表達(dá)模式（Lin et al，2002）。然而，麻瘋樹種子作為最具潛力的生物柴油來源，其發(fā)育過程中oleosin基因JcOle14.3和JcOle16.6的表達(dá)特性尚未見報(bào)道。該文擬從麻瘋樹種子的不同發(fā)育時(shí)期研究JcOle14.3和JcOle16.6基因的表達(dá)模式，進(jìn)而闡明oleosin基因在麻瘋樹種子中的表達(dá)特性，為麻瘋樹油體形成機(jī)理以及oleosin蛋白的深入研究提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為利用麻瘋樹進(jìn)行生物柴油的生產(chǎn)提供重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1材料與方法

1.1 材料

麻瘋樹種子采自于云南省西雙版納熱帶植物研究所。在麻瘋樹花序未開放時(shí)去除雄花并進(jìn)行套袋，當(dāng)雌花開放時(shí)進(jìn)行人工授粉，授粉當(dāng)天記為種子發(fā)育0 d，授粉后對不同發(fā)育階段（10、20、30、40、50和55 d）的種子進(jìn)行取樣：選取9株植株，并以每3株植株上的種子混合為1個(gè)樣品， 3次重復(fù)，每個(gè)發(fā)育階段的取樣方法與上相同。樣品用液氮速凍后保存于-80 ℃低溫冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 樣品RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄種子樣品總RNA提取參照丁勇等（2012）的方法進(jìn)行，cDNA的合成按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明合成。

1.2.2 基因表達(dá)分析利用熒光定量PCR對麻瘋樹種子不同發(fā)育階段的JcOle14.3和JcOle16.6基因進(jìn)行表達(dá)模式分析，每個(gè)樣品3次重復(fù)。熒光定量PCR 采用SYBR Green master mix （Fermentas）法進(jìn)行。JcOle14.3引物為JcOle14.3qF（5′GGATCTCTTCTAGTTCTCT3′），JcOle14.3qR（5′TGAATATGACCAGCAATG3′）；JcOle16.6引物為JcOle16.6qF（5′AGCCACACGTTCAAG3′），JcOle16.6qR（5′TCTGAGCTGATGGACCTT3′）；內(nèi)參基因18S（GenBank： AY823528.1）引物為18SqF（5′ACATAGTAAGGATTGACAGA3′），18SqR（5′TAACGGAATTAACCAGACA 3′）。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃解鏈15 s，60 ℃同時(shí)復(fù)性延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)。基因相對表達(dá)量的計(jì)算方法采用 2-△△ Ct 法。

2結(jié)果與分析

2.1 JcOle14.3基因表達(dá)模式分析

以麻瘋樹種子發(fā)育第10天作為對照，對麻瘋樹JcOle14.3基因在種子不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量進(jìn)行了熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示（圖 1），JcOle14.3基因在整個(gè)種子發(fā)育過程中均有表達(dá)，在種子發(fā)育初期（10～30 d），表達(dá)量有逐漸升高的趨勢，但表達(dá)較低，而在發(fā)育40 d時(shí)，JcOle14.3表達(dá)量急劇增加并達(dá)到最高，是種子發(fā)育10 d的90多倍，而在發(fā)育后期（50～55 d）表達(dá)量開始下降。

2.2 JcOle16.6基因表達(dá)模式分析

以同樣的方法對麻瘋樹JcOle16.6基因在種子不同發(fā)育階段的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。圖2結(jié)果顯示，JcOle16.6表達(dá)情況與JcOle14.3相似，在種子發(fā)育40 d前，JcOle16.6表達(dá)量逐漸升高，在授粉后40 d表達(dá)量急劇增加并達(dá)到最高，為種子發(fā)育10 d的110多倍，而發(fā)育40 d后表達(dá)量亦開始下降。

3討論

麻瘋樹種子是最具潛力的生物柴油（王濤，2005；Wu et al，2009），而種子中的油體是開發(fā)生物柴油的前提，故油體的形成至關(guān)重要。本研究在種子發(fā)育過程中，oleosin基因JcOle14.3和JcOle16.6的表達(dá)情況對油體的形成、穩(wěn)定和大小均起到重要作用。本研究表明，JcOle14.3和JcOle16.6在種子發(fā)育階段的表達(dá)呈先升高后降低的趨勢，在發(fā)育初期（10～30 d），兩個(gè)基因的表達(dá)量均較低，而第40天表達(dá)量迅速增加并達(dá)到最高，40 d后兩個(gè)基因的表達(dá)量又逐漸降低。本研究推測麻瘋樹種子發(fā)育初期因油體形成量較少，故JcOle14.3和JcOle16.6表達(dá)量雖然逐漸增加，但表達(dá)量較低。發(fā)育至40 d時(shí)，種子中的油體大量形成并得以逐漸穩(wěn)定，兩個(gè)基因的表達(dá)量也急劇增加并達(dá)到最大值。40 d后，即種子成熟后期，油體形成量逐漸減低，表達(dá)量亦隨之降低。文錦芬等（2014）的研究表明，在麻瘋樹果實(shí)發(fā)育過程中，與油脂合成相關(guān)的酰基輔酶A結(jié)合蛋白基因（JcACBP）的表達(dá)也表現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但該基因的表達(dá)在發(fā)育后期才略有下降，而本研究JcOle14.3和JcOle16.6基因的表達(dá)在種子發(fā)育后期具有明顯的下降趨勢。造成以上結(jié)果不同的原因可能是由于麻瘋樹的生境及其種子成熟期存在差異所致。如文錦芬等（2014）實(shí)驗(yàn)材料采自云南昆明，JcACBP的表達(dá)在種子發(fā)育50 d時(shí)達(dá)到最高，而本研究的實(shí)驗(yàn)材料采自云南西雙版納熱帶植物研究所，種子發(fā)育40 d時(shí) JcOle14.3和JcOle16.6就達(dá)到最大值。此外，油菜和芝麻中的oleosin基因在種子成熟后期也保持較高的表達(dá)水平（Murphy et al，1989； Lin et al，2002），這可能是由于不同物種的油脂積累模式不同，從而oleosin基因的表達(dá)模式不同所導(dǎo)致。

以往研究表明，麻瘋樹JcACBP基因的表達(dá)量與油脂含量變化趨勢基本一致（文錦芬等，2014），而本研究結(jié)果顯示JcOle14.3和JcOle16.6的表達(dá)模式與JcACBP相似，暗示JcOle14.3和JcOle16.6的表達(dá)量與麻瘋樹油脂合成亦存在正相關(guān)性。

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