胡松青 黃政 劉光，2 黃滟波 李琳 侯軼

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510640； 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610； 3.華南理工大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510640)

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)是位于真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種多功能酶，它主要由4個(gè)硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域按照a-b-b′-a′順序排列組成，并在C-末端含有一段由大量酸性氨基酸組成的c尾[1].結(jié)構(gòu)域a和a′含有催化活性位點(diǎn)CXXC基序(C為半胱氨酸，X為除半胱氨酸以外的氨基酸)，非催化結(jié)構(gòu)域b和b′雖不含活性位點(diǎn)，但存在與底物結(jié)合的疏水表面.正是這種結(jié)構(gòu)特性，使得PDI在催化新生肽鏈巰基/二硫鍵交換反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，其能夠催化二硫鍵的氧化、還原以及異構(gòu)反應(yīng)[2].除了催化巰基/二硫鍵交換反應(yīng)，PDI還有另一個(gè)重要功能——分子伴侶，PDI的分子伴侶活性表現(xiàn)為促進(jìn)新生或者變性蛋白質(zhì)的折疊以及恢復(fù)蛋白質(zhì)的天然活性[3].

PDI每個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浠钚载暙I(xiàn)不同，通過刪除或突變PDI結(jié)構(gòu)域可以考察PDI各結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)對其活性的影響[4].發(fā)揮巰基/二硫鍵交換反應(yīng)的最小單元為a或a′結(jié)構(gòu)域，其活性大小與突變?nèi)LPDI另一個(gè)結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)的突變體活性相當(dāng)[5].Klappa等[6]通過考察人來源PDI(hPDI)截短蛋白對多肽底物的結(jié)合作用發(fā)現(xiàn)，hPDI的所有結(jié)構(gòu)域都對底物結(jié)合發(fā)揮作用，且b′結(jié)構(gòu)域提供了最主要的結(jié)合位點(diǎn).另外，Tian等[7]通過截除hPDI的c尾考察了截短蛋白對變性乳酸脫氫酶的分子伴侶活性大小，發(fā)現(xiàn)hPDI的c尾有助于穩(wěn)定PDI的分子伴侶活性.

目前，人和酵母來源PDI的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)得到了較為深入的研究[8- 9]，而有關(guān)植物來源PDI的性質(zhì)研究較為鮮見.相比于動(dòng)物和微生物來源，植物來源PDI表現(xiàn)出不同的功能性質(zhì)，如大豆PDI包含非典型的氧化還原基序CXXC/S，其在體外不具有氧化還原活性和分子伴侶活性[10].因此，有關(guān)植物來源PDI的功能性質(zhì)研究有待深入.

筆者所在課題組前期利用大腸桿菌原核表達(dá)了具有生物活性的重組小麥蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(wPDI)[11]，文中以wPDI為研究對象，通過表達(dá)wPDI各結(jié)構(gòu)域線性組合的截短蛋白，探究了其結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)氧化還原狀態(tài)對wPDI活性的貢獻(xiàn)，以期為深入理解wPDI的功能性質(zhì)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 宿主菌株與質(zhì)粒

克隆菌株E.coliDH5α、表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)購于寶生物工程有限公司；pET- 30b-wpdi重組表達(dá)質(zhì)粒由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建并保存.

1.1.2 宿主菌株與質(zhì)粒

主要試劑：胰島素、牛核糖核酸酶(RNase)、胞苷2′，3′-環(huán)單鈉磷酸鹽(2′，3′-cCMP)和三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，購自美國西格瑪試劑公司；限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI和T4 DNA連接酶，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒和DNA小提試劑盒，購自廣州英贊生物有限公司；還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和丙基硫代半乳糖苷(IPTG)等試劑均為分析純，購自健陽生物科技有限公司.

主要儀器：EDC- 80型基因擴(kuò)增儀，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司生產(chǎn)；Infinite M200 Pro型酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司生產(chǎn)；蛋白電泳儀，美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；NanoVue plus型微量紫外分光光度計(jì)、VCX500型超聲破碎儀，美國SONICS公司生產(chǎn).

1.2 分析及測試方法

1.2.1 wPDI截短蛋白的構(gòu)建分析

從小麥中克隆得到的wpdi基因(genbank No.AF262979.1)全長1 548 bp，與“Wyuna”品種小麥PDI基因同源性達(dá)99%.wpdi基因編碼515個(gè)氨基酸，去除信號(hào)肽序列后剩余490個(gè)氨基酸，按照J(rèn)ohnson等[12]的報(bào)道，各結(jié)構(gòu)域的界限分別為：a結(jié)構(gòu)域包含17-120位氨基酸，b結(jié)構(gòu)域包含128-221位氨基酸，b′結(jié)構(gòu)域包含244-338位氨基酸，a′結(jié)構(gòu)域包含358-459位氨基酸.按照結(jié)構(gòu)域界限對wPDI進(jìn)行線性組合排列，設(shè)計(jì)出8個(gè)截短蛋白片段，分別為ABB′A′、BB′A′C、ABB′、B′A′C、AB、BB′、A′和A.

1.2.2 wPDI各截短蛋白的引物設(shè)計(jì)

不同wPDI截短蛋白的PCR擴(kuò)增引物是以wpdi基因序列為模板，利用Primer Piemier 3.0設(shè)計(jì)的，具體信息見表1.

1.2.3 wPDI重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以pET- 30b-wpdi質(zhì)粒為模板，分別加入wPDI各截短片段上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min后，按以下的參數(shù)進(jìn)行35次循環(huán)——98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s.最后，72 ℃延伸5 min后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并用DNA凝膠回收試劑盒回收各片段基因.

對基因回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pET- 30b(+)分別進(jìn)行BamHI和XhoI雙限制性內(nèi)切酶處理，酶切反應(yīng)條件為37 ℃、30 min.反應(yīng)產(chǎn)物回收、連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布在LB固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng).菌落長成后，隨機(jī)挑選單克隆菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)條件同上.將經(jīng)雙酶切和電泳驗(yàn)證結(jié)果為陽性的重組表達(dá)質(zhì)粒送樣測序，測序結(jié)果與已知的wpdi基因序列對應(yīng)結(jié)構(gòu)域部分進(jìn)行比對，確認(rèn)重組質(zhì)粒序列信息.

表1 不同wPDI截短蛋白的引物設(shè)計(jì)1)

1.2.4 表達(dá)與純化

將測序正確的各重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，并涂布在含Kan的LB固體平板培養(yǎng)基上.37 ℃培養(yǎng)過夜后，挑取形態(tài)飽滿的單克隆菌接種到含有Kan的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)8～10 h后，將菌液以1∶100(體積比)的比例轉(zhuǎn)接到新的LB液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)2～3 h至菌液600 nm吸光值達(dá)到0.5～0.6后，加入IPTG誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá).ABB′A′、ABB′、BB′A′C、B′A′C和AB等截短蛋白添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，BB′、A 和 A′截短蛋白添加終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo).各截短蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件均為20 ℃、200 r/min下誘導(dǎo)過夜.利用SDS-PAGE檢測重組蛋白質(zhì)的表達(dá).

使用Ni-NTA金屬螯合層析和分子排阻層析組合層析方法對wPDI各截短蛋白進(jìn)行分離純化.純化后的蛋白保存于含0.15 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)中，不含有對蛋白結(jié)構(gòu)和活性有影響的SDS和巰基還原劑.各截短蛋白的蛋白質(zhì)濃度采用微量紫外分光光度計(jì)測定，不同截短蛋白的消光系數(shù)ε(mL·mg-1·cm-1)值分別為0.805(ABB′A′)、0.745(ABB′)、0.661(BB′A′C)、0.787(B′A′C)、0.576(AB)、0.606(BB′)、0.817(A′)和0.790(A)，計(jì)算方法參考Simonian等[13]的報(bào)道.

1.2.5 活性測定

wPDI包含多種酶學(xué)活性，包括二硫鍵氧化酶、還原酶以及異構(gòu)酶活性[11].此外，wPDI還具有分子伴侶功能.不同活性的測定方法和底物制備方法參考曹佩等[14]的報(bào)道.

二硫鍵氧化酶和異構(gòu)酶的活性定義如下：單位時(shí)間內(nèi)生成1 μmol 3′-CMP所需酶量為一個(gè)酶活力單位，文中選取反應(yīng)時(shí)間10 min和20 min內(nèi)的線性區(qū)域分別計(jì)算各截短蛋白質(zhì)的二硫鍵氧化酶和異構(gòu)酶活性.通過計(jì)算開始沉淀時(shí)(吸光值相對提高0.01個(gè)單位)的延遲時(shí)間來分析不同截短蛋白質(zhì)二硫鍵還原活性的大小.分子伴侶活性的定義如下：30 min內(nèi)抑制吸光值增加0.01個(gè)單位所需酶量為一個(gè)酶活力單位.

1.2.6 蛋白質(zhì)電泳

使用還原型十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測截短蛋白質(zhì)的純度，使用非還原型SDS-PAGE檢測截短蛋白A和A′活性中心的氧化還原狀態(tài).還原型和非還原型SDS-PAGE方法參照文獻(xiàn)[15]中的方法.

2 結(jié)果與討論

2.1 wPDI截短蛋白的表達(dá)

按照wPDI的各結(jié)構(gòu)域界限，對其按線性排列方式進(jìn)行分段組合，設(shè)計(jì)出8個(gè)截短片段，各片段的結(jié)構(gòu)域組成以及氨基酸個(gè)數(shù)如圖1所示.

圖1 wPDI各截短蛋白的結(jié)構(gòu)域信息

Fig.1 Structure domain information of truncated proteins of wPDI

利用亞克隆方法構(gòu)建不同截短蛋白重組表達(dá)載體.將構(gòu)建好的各重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)后利用SDS-PAGE進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果如圖2(a)所示.由圖可見：截短蛋白ABB′A′、BB′A′C、ABB′、B′A′C、BB′以及A′在電泳膠上的條帶十分明顯，說明它們具有可觀的表達(dá)水平；而截短蛋白AB以及A在電泳膠上的條帶較淡，說明它們雖有表達(dá)，但表達(dá)量相對于其他截短蛋白低.

2.2 wPDI截短蛋白的純化

各截短蛋白的N-端都帶有6×His融合標(biāo)簽，利用Ni-NTA金屬螯合親和層析以及分子排阻層析組合層析方法對各截短蛋白進(jìn)行純化，純化后利用還原型SDS-PAGE檢測各蛋白質(zhì)純度，結(jié)果如圖2(b)所示.由圖可見，wPDI的各截短蛋白在電泳膠上主要以單一條帶存在，它們在凝膠上的相對分子質(zhì)量都略大于其理論相對分子質(zhì)量(含標(biāo)簽)，造成各截短蛋白質(zhì)在凝膠上遷移率變慢的原因可能與重組蛋白所帶His標(biāo)簽上堿性氨基酸過多有關(guān)[16].另外，盡管各截短蛋白質(zhì)在電泳圖譜上表現(xiàn)為單體蛋白，但由分子排阻分析可得，截短蛋白A、A′和B′A′C應(yīng)處于聚集態(tài)形式，其他截短蛋白為單體形式，蛋白的聚集對其活性可能產(chǎn)生影響.

圖2 wPDI各截短蛋白的表達(dá)檢測和純度分析

2.3 wPDI截短蛋白的活性測定

wPDI包含二硫鍵的氧化還原活性、異構(gòu)活性以及分子伴侶活性.因BB′不含催化位點(diǎn)，故僅對其分子伴侶活性進(jìn)行測定，而對剩下的截短蛋白進(jìn)行酶學(xué)活性和分子伴侶活性的考察，結(jié)果如圖3所示.

2.3.1 二硫鍵還原酶活性

圖3(a)為不同截短蛋白二硫鍵還原酶活性測定結(jié)果.由圖可見，在所選蛋白質(zhì)中，除B′A′C、A′和A外，在文中實(shí)驗(yàn)條件下，其他截短蛋白都表現(xiàn)出了二硫鍵還原酶活性，其中wPDI表現(xiàn)出了最強(qiáng)的二硫鍵還原酶活性，說明wPDI所有結(jié)構(gòu)域以及c尾都對其還原胰島素具有相應(yīng)的貢獻(xiàn)，該結(jié)果與Sun等[17]報(bào)道的結(jié)果一致.

圖3 wPDI各截短蛋白的酶學(xué)活性和分子伴侶活性測定結(jié)果

Fig.3 Results of enzymatic activities and molecular chaperone activity assay of different truncated proteins of wPDI

根據(jù)圖3(a)，以wPDI組與對照組開始沉淀時(shí)的時(shí)間差值為標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算各截短蛋白二硫鍵還原酶活性的相對大小，結(jié)果如表2所示.由表可見，僅含有a結(jié)構(gòu)域的截短蛋白的還原活性較不含a結(jié)構(gòu)域的小，如ABB′和AB的二硫鍵還原酶活性分別為全長wPDI二硫鍵還原酶活性的8.6%和15.1%，BB′A′C的活性則為67.8%.該結(jié)果表明wPDI的a′結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)可能偏向還原態(tài)形式，而a結(jié)構(gòu)域偏向氧化態(tài)形式，與hPDI催化活性位點(diǎn)的氧化還原狀態(tài)類似[18].

表2 wPDI各截短蛋白的酶學(xué)活性和分子伴侶活性比較1)

進(jìn)一步分析截短蛋白A的電泳結(jié)果(見圖4)可得，未經(jīng)DTT(二硫蘇糖醇)處理的截短蛋白A單體在電泳圖上位置只有一條條帶(黑色框標(biāo)示).添加1 mmol/L DTT后，該單體條帶出現(xiàn)了上下兩條強(qiáng)度相當(dāng)并緊挨著的條帶.繼續(xù)增大DTT濃度至2 mmol/L后，電泳圖上截短蛋白A單體靠上的條帶強(qiáng)度變?nèi)?，靠下的條帶強(qiáng)度則增強(qiáng).而當(dāng)DTT濃度增至4 mmol/L時(shí)，靠上的條帶基本消失，截短蛋白A單體條帶主要以靠下的條帶為主.這些結(jié)果表明，未加DTT處理的截短蛋白A單體以氧化態(tài)形式存在，添加少量DTT(<2 mmol/L)后，截短蛋白A單體以氧化態(tài)(上條帶)和還原態(tài)(下條帶)共存.而當(dāng)DTT濃度進(jìn)一步增大后，截短蛋白A單體由氧化態(tài)完全轉(zhuǎn)變成還原態(tài).該結(jié)果與活性測定的結(jié)果一致，直接證明了wPDI的a結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)主要以氧化態(tài)形式存在.

圖4 DTT處理下截短蛋白A和A′的非還原SDS-PAGE分析

此外，分析截短蛋白A′的電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加DTT處理后，截短蛋白A′單體條帶并沒有發(fā)生與截短蛋白A單體條帶相類似的條帶遷移率變化(白色框標(biāo)示)，這也從側(cè)面證明了wPDI的a′結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)主要以還原態(tài)形式存在，與活性測定分析的結(jié)果相一致.

2.3.2 二硫鍵氧化酶活性

圖3(b)為不同截短蛋白二硫鍵氧化酶活性測定結(jié)果.由圖可見，所有截短蛋白都表現(xiàn)出了二硫鍵氧化酶活性，在30 min內(nèi)，wPDI引起的溶液吸光值變化最快，說明其二硫鍵氧化酶活性最高，但隨時(shí)間的延長，受到底物消耗以及產(chǎn)物抑制作用的影響，wPDI的氧化活性減弱，當(dāng)時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，ABB′A′和AB實(shí)驗(yàn)組引起的溶液吸光值變化量與wPDI組的相近，說明60 min后三者對變性rRNase的復(fù)性效率相近.以圖3(b)數(shù)據(jù)計(jì)算各截短蛋白的二硫鍵氧化酶活性相對大小，結(jié)果見表2.由表可見，所有截短蛋白的二硫鍵氧化酶活性都低于全長wPDI，同樣說明wPDI的各個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)ζ溲趸钚跃哂幸欢ㄘ暙I(xiàn)[4].

此外，僅含a結(jié)構(gòu)域的截短蛋白AB和ABB′的氧化活性要高于僅含a′結(jié)構(gòu)域的截短蛋白BB′A′C和B′A′C，進(jìn)一步說明wPDI的a結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)主要以氧化態(tài)為主，而a′結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)主要以還原態(tài)為主.另外，截短蛋白A′活性位點(diǎn)主要以還原態(tài)為主，故二硫鍵氧化活性低；而A的活性位點(diǎn)雖然以氧化態(tài)為主，但因活性位點(diǎn)半胱氨酸參與形成分子間二硫鍵交聯(lián)，導(dǎo)致其氧化活性偏低.

2.3.3 二硫鍵異構(gòu)酶活性

圖3(c)為不同截短蛋白二硫鍵異構(gòu)酶活性測定結(jié)果.由圖可見，除截短蛋白A和A′外，剩余截短蛋白都表現(xiàn)出了一定的異構(gòu)活性.研究表明，發(fā)揮PDI異構(gòu)活性的最小結(jié)構(gòu)單元為ab或b′a′c，b′a′c的異構(gòu)活性與全長PDI突變a結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)后的突變體異構(gòu)活性相當(dāng)[19].比較不同截短蛋白的二硫鍵異構(gòu)酶活性發(fā)現(xiàn)，截短蛋白ABB′A′的異構(gòu)活性略高于wPDI，說明c尾并不是異構(gòu)活性所必需的(如表2所示).此外，截短蛋白所含結(jié)構(gòu)域單元越多，其異構(gòu)活性也相應(yīng)越大，同樣表明wPDI各結(jié)構(gòu)域?qū)ζ洚悩?gòu)活性都具有貢獻(xiàn)，這與Darby等[4]的研究結(jié)果相符.

PDI的異構(gòu)作用包括兩種機(jī)制[20]：一種是底物分子內(nèi)直接異構(gòu)機(jī)制，該機(jī)制不需要氧化還原劑的參與，僅要求PDI一個(gè)活性位點(diǎn)處于還原狀態(tài)即可；另一種是還原/氧化循環(huán)機(jī)制，需要兩個(gè)活性位點(diǎn)和氧化還原當(dāng)量的同時(shí)參與.BB′A′C、B′A′C、ABB′和AB只含有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，因此它們發(fā)揮異構(gòu)活性的機(jī)制應(yīng)為第一種機(jī)制；wPDI和ABB′A′含兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，因此它們發(fā)揮異構(gòu)作用應(yīng)同時(shí)包含兩種機(jī)制，這應(yīng)該是它們的異構(gòu)活性較其他截短片段大的部分原因.

2.3.4 分子伴侶活性

圖3(d)為不同截短蛋白分子伴侶活性測定結(jié)果.由圖可見，除截短蛋白A、A′和BB′沒有表現(xiàn)出分子伴侶活性外，剩余截短蛋白都具有一定的抑制變性GAPDH凝沉的能力.研究表明，PDI的b和b′結(jié)構(gòu)域含疏水區(qū)域，提供了與底物結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，該結(jié)合位點(diǎn)顯著影響其異構(gòu)活性和分子伴侶活性.Horibe等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，hPDI相關(guān)蛋白的a和a′結(jié)構(gòu)域單獨(dú)存在時(shí)不具有分子伴侶活性，這與文中所得結(jié)果相似.比較能夠發(fā)揮分子伴侶活性的截短蛋白發(fā)現(xiàn)，各截短蛋白至少需含有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域a(或a′)和非催化結(jié)構(gòu)域b(或b′)，表明wPDI發(fā)揮分子伴侶活性的最小結(jié)構(gòu)單元為ab或b′a′c[21].

表2示出了各截短蛋白對變性GAPDH的相對分子伴侶活性大小.由表可得，截短蛋白所含結(jié)構(gòu)域越多其分子伴侶活性越大，表明每個(gè)結(jié)構(gòu)域都有助于PDI結(jié)合底物，這與前人所獲得的研究結(jié)果相符[22].此外，比較wPDI和ABB′A′相對伴侶的活性大小發(fā)現(xiàn)，wPDI的c尾截去后損失了25%的全長wPDI分子伴侶活性.Tian等[7]通過比較hPDI和abb′a′(hPDI C-末端29個(gè)氨基酸被截除片段)對變性乳酸脫氫酶的分子伴侶活性大小，發(fā)現(xiàn)PDI的C-末端有助于穩(wěn)定PDI的分子伴侶活性.但若hPDI C-末端氨基酸截除數(shù)增至51個(gè)后，hPDI截短蛋白則喪失了恢復(fù)變性GAPDH活性的能力[23- 26].結(jié)合這些研究結(jié)果分析得到，hPDI的C-末端51個(gè)氨基酸中，靠近N端的22個(gè)氨基酸包含了對分子伴侶活性至關(guān)重要的氨基酸或結(jié)合位點(diǎn)，因此，wPDI截短蛋白ABB′A′伴侶活性降低的原因應(yīng)與C-末端截取的氨基酸有關(guān)，截除的41個(gè)氨基酸應(yīng)含與分子伴侶活性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合位點(diǎn).

以上結(jié)果表明，wPDI的a結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)主要以氧化態(tài)形式存在，a′結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)主要以還原態(tài)形式存在，wPDI的所有結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涿笇W(xué)活性和分子伴侶活性都具有一定的貢獻(xiàn)，c尾對其異構(gòu)活性沒有影響，但存在影響分子伴侶活性的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合位點(diǎn).

3 結(jié)語

文中成功制備了8個(gè)wPDI截短蛋白片段，活性試驗(yàn)表明，wPDI所有結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涠蜴I氧化、還原、異構(gòu)以及分子伴侶活性都具有貢獻(xiàn)，其中，a結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)主要以氧化態(tài)形式存在，a′結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)主要以還原態(tài)形式存在，c尾的缺乏不影響其異構(gòu)活性，但該部分含有影響分子伴侶活性的關(guān)鍵氨基酸結(jié)合位點(diǎn).研究結(jié)果不僅有助于理解wPDI活性與其結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)系，而且為充分認(rèn)識(shí)不同來源PDI的共性和特性問題起到了促進(jìn)作用.

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