于威君+李曉薇+肖洪慶+Aysha+Jameel+侯心悅+李海燕

摘 要：發(fā)狀根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒侵染植物后誘導大量發(fā)狀根發(fā)生，由此發(fā)展起來的遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)成為一項非常重要的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，并被應用到生命科學的多個領(lǐng)域。大豆是重要的糧食作物和油料作物，也是目前轉(zhuǎn)基因種植面積最大的作物。現(xiàn)有的大豆子葉節(jié)、幼胚、胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化效率低、周期長，而發(fā)狀根遺傳轉(zhuǎn)化體系具有轉(zhuǎn)化效率高、周期短等優(yōu)點，因此發(fā)狀根在大豆基因工程研究中被廣泛應用。本文綜述了近年來發(fā)狀根在大豆基因工程中的應用研究進展。

關(guān)鍵詞：發(fā)狀根；大豆；基因工程；分子育種

中圖分類號：Q-1 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170206001

大豆在我國與稻谷、玉米和小麥共同構(gòu)成了四大糧食作物，同時大豆在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食物消費系統(tǒng)中占有重要的地位和作用[1]。近年，全球轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積已是轉(zhuǎn)基因品種種植面積最大的作物?？梢?，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為大豆新品種培育的重要手段。目前應用的大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)主要是以子葉節(jié)、幼胚、胚尖作為外植體，轉(zhuǎn)化后誘導大豆再生植株。但是，這些方法周期較長且轉(zhuǎn)化效率低，不利于快速鑒定相關(guān)基因在大豆育種中的應用潛力。發(fā)狀根農(nóng)桿菌介導的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系，因其周期短、轉(zhuǎn)化效率高且不易產(chǎn)生變異等優(yōu)點，越來越受到重視。本文就發(fā)狀根轉(zhuǎn)化體系在大豆基因工程中的應用研究做一綜述，展望該項技術(shù)的應用前景，為大豆育種工作者們提供一些有用信息。

1 發(fā)狀根遺傳轉(zhuǎn)化體系概述

發(fā)狀根農(nóng)桿菌中含有Ri質(zhì)粒，與根癌農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒類似，上面含有T-DNA區(qū)，侵染植物后，T-DNA區(qū)能夠轉(zhuǎn)移并整合進植物的基因組中。發(fā)狀根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化侵染植物后，在侵染部位或四周產(chǎn)生大量的發(fā)狀根，而且所產(chǎn)生的發(fā)狀根能夠合成該植物特征的次生代謝產(chǎn)物，因此發(fā)狀根可作為植物次生代謝產(chǎn)物的生物反應器。另外，通過單細胞分化而來的發(fā)狀根變異性低，能夠穩(wěn)定遺傳，且更容易獲得再生的轉(zhuǎn)化植株，因此該項技術(shù)自產(chǎn)生以來迅速被應用到基因功能的研究和品種改良等。據(jù)統(tǒng)計有200多種植物[2]可被誘導出發(fā)狀根，大多集中在茄科、菊科、十字花科、旋花科、傘形科、豆科、石竹科和蓼科等草本植物中，而木本植物較少有成功轉(zhuǎn)化的報道[3]。這就意味著，發(fā)狀根遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在植物界，尤其是在草本植物中，具有廣闊的應用前景。

發(fā)狀根誘導培養(yǎng)過程并不復雜。發(fā)狀根農(nóng)桿菌侵染植物組織創(chuàng)傷部位（葉片、莖段、葉柄、根切片等）和發(fā)狀根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，其Ri 質(zhì)粒中的T-DNA區(qū)轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組上。經(jīng)過一段時間培養(yǎng)，植物組織的創(chuàng)傷部位誘導產(chǎn)生發(fā)狀根。接下來按一定長度剪下發(fā)狀根，轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)多次，以消除共培養(yǎng)殘留的農(nóng)桿菌。把每個發(fā)狀根系轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或者進一步誘導再生出轉(zhuǎn)化植株。通常認為創(chuàng)傷組織上，每個萌發(fā)的發(fā)狀根代表一個發(fā)狀根系[4]。

2 發(fā)狀根在大豆基因工程中的應用

2.1 大豆發(fā)狀根用于啟動子的功能研究

大豆發(fā)狀根轉(zhuǎn)化體系具有周期短、轉(zhuǎn)化效率髙、單細胞分化的發(fā)狀根變異性低等優(yōu)點。通過啟動子在大豆發(fā)狀根中可以快速表達的特性，揭示其在大豆自身中的表達活性。植物啟動子的研究有助于了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達模式及其調(diào)控機制，并應用于基因工程中提高或改進外源目的基因的表達。而根特異表達基因的獲得，是進一步研究其啟動子如何進行基因組織特異表達的基礎(chǔ)?，F(xiàn)有報道，通過抗大豆孢囊線蟲（SCN）誘導合成啟動子，驅(qū)動綠色熒光蛋白基因（GFP）在發(fā)狀根中表達，驗證了該合成啟動子是誘導型啟動子[5]。通過大豆水通道蛋白基因（GmTIPp）啟動子及其缺失片段的啟動子調(diào)控報告基因（GUS）在發(fā)狀根中表達，進一步了解GmTIPp啟動子的特異核心序列區(qū)域 [6]。發(fā)現(xiàn)在發(fā)狀根中接種根瘤后，大豆胞外復合物（GmExo70J7、GmExo70J9）啟動子的活性受到顯著的抑制[7]。大豆硫轉(zhuǎn)運蛋白基因（GmSULTR）啟動子截取部分片段序列作為啟動子，具有驅(qū)動下游GUS基因在發(fā)狀根中表達的功能，而且在根毛、根表皮和中柱內(nèi)表達且啟動活性比CaMV35S啟動子的啟動活性弱[8]。在大豆發(fā)狀根中比較玄參花葉病毒（FMV）啟動子，木薯葉脈花葉病毒（CsVMV）啟動子，草莓鑲脈病毒（SVBV2）啟動子，35S和E35S啟動子驅(qū)動GUS基因的表達活性，證明FMV啟動子在根中是強表達[9]。在大豆發(fā)狀根中驗證大豆疫霉誘導性基因（GmaPPO12、 GmaPR1）啟動子功能，可用于轉(zhuǎn)基因植物，增強對疫霉病病原體的抗性[10]。在大豆發(fā)狀根中通過GUS活性測定，得到改造的乙醇脫氫酶基因（Adh）啟動子可由缺氧誘導，但低溫，創(chuàng)傷或ABA不能誘導。得到的Adh啟動子可用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炛腥毖跽T導的表達，以改善植物對水淹或缺氧脅迫的耐受性[11]。在大豆發(fā)狀根利用光響應性驗證了甲基轉(zhuǎn)移酶（rbcMT-T）啟動子片段對報告基因的表達能力[12]?？寺〉拇蠖垢彼岣患鞍谆颍℅mPRP2）啟動子，其表達模式表明該啟動子在大豆的發(fā)狀根中是根優(yōu)先的?？捎糜谔岣邔Σ≡w，害蟲，營養(yǎng)不良和其他非生物脅迫的根抗性或耐受性，減少大豆生產(chǎn)中的大量年產(chǎn)量損失[13]。

2.2 大豆發(fā)狀根用于研究調(diào)控基因

大豆發(fā)狀根多用于功能基因的分析尤其是抗性基因的檢驗，其中抗性中以旱生、耐鹽堿研究為主。在發(fā)狀根中氫離子焦磷酸酶類基因（GmVP）過表達能提高鹽脅迫下發(fā)狀根的相對伸長率，提高發(fā)狀根的耐鹽性，并能提高SOD、POD、CAT活性和減低MDA含量[14]。通過對轉(zhuǎn)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（GmNHX1）、Cl-/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（GmCLC1）、紫色酸性磷酸酶基因（GmPAP3）發(fā)狀根的功能分析，表明其能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的耐鹽性[15]。在發(fā)狀根中，RNA沉默的大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子基因（GmMYB176）導致異黃酮水平降低，顯示GmMYB176是異黃酮類生物合成所必需的[16]。對轉(zhuǎn)大豆20ZF轉(zhuǎn)錄因子基因Gm20ZF-1-RNAi基因的發(fā)狀根進行異黃酮含量檢測，發(fā)狀根中異黃酮含量顯著下降，表明Gm20ZF-1與大豆異黃酮的積累有關(guān)[17]。大豆膨脹素基因（GmEXPB2）參與發(fā)狀根伸長，而影響植物生長和磷吸收，特別是在低磷水平。這一發(fā)現(xiàn)在改善農(nóng)業(yè)作物的生長上具有很大的應用潛力[18]。

2.3 大豆發(fā)狀根用于其他研究

利用大豆發(fā)狀根表達蛋白可以更加簡易，量產(chǎn)。通過大豆發(fā)狀根成功生產(chǎn)表達人堿性成纖維生長因子（bFGF），研究證明發(fā)狀根能夠通過無性繁殖穩(wěn)定遺傳，轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根可作為生物反應器制備，也是安全的，同時為利用發(fā)狀根生產(chǎn)藥物實現(xiàn)工業(yè)化提供實驗基礎(chǔ)[19]。CRISPR/Cas9介導的基因組修飾的每個靶基因座的效率可以利用其在發(fā)狀根中的表達進行快速地評估[20]。通過用大豆查耳酮合酶（CHS6）或異黃酮合成酶（IFS2）基因轉(zhuǎn)化，在發(fā)狀根中改變異黃酮的合成而影響植物抗毒素的合成，得到植物抗毒素在植物中對真菌感染反應中的重要作用的新證據(jù)[21]。大豆胞囊線蟲轉(zhuǎn)化大豆發(fā)狀根可以完成其整個生命周期表達GFP。該系統(tǒng)可以測試基因是否抗大豆胞囊線蟲病，得到抗病植株[22]。

3 展望

全球氣候變化加劇，我國嚴寒、高溫、干旱、洪澇災害頻發(fā)，同時自然災害會引發(fā)一系列病蟲災害，生物脅迫與非生物脅迫共同威脅著大豆的產(chǎn)量與品質(zhì)。目前正通過遺傳學、分子生物學等微觀層面研究大豆相關(guān)脅迫機制，并鑒定重要基因的功能，利用生物技術(shù)，生物工程手段等提高大豆的抗病抗逆性及品質(zhì)，得到優(yōu)良的大豆品系。發(fā)狀根的發(fā)展歷史雖短，但是已經(jīng)深入基礎(chǔ)研究，目前可用于培養(yǎng)物生產(chǎn)有用的活性物質(zhì)，作為研究根系相關(guān)基因的驗證系統(tǒng)，為改善大豆根的特性提供依據(jù)，如能通過組織培養(yǎng)大豆發(fā)狀根獲得再生植株，則開辟了大豆高效遺傳轉(zhuǎn)化的新途徑，提高了大豆轉(zhuǎn)化效率，為大豆育種提供新的方法，同時可以用于快速鑒定大豆相關(guān)的基因功能。大豆發(fā)狀根正在廣泛應用于大豆品種的改良研究，為改良大豆提供依據(jù)，獲得長勢更好，產(chǎn)量更高，抗逆性更強的新植株提供實驗基礎(chǔ)。但是開展大豆轉(zhuǎn)基因品種選育和基因功能研究仍有許多限制因素需要解決。

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