王月秋++李珊珊++曾紅++張景海

【摘 要】大多數(shù)來自東亞鉗蝎的具有鎮(zhèn)痛活性的多肽類神經(jīng)毒素53位均為天冬氨酸，但目前尚無這個殘基在毒素鎮(zhèn)痛活性中作用的報道。本研究采用突變分析的方法考察Asp53與東亞鉗蝎神經(jīng)毒素BmK9鎮(zhèn)痛活性的關聯(lián)，構建突變體D53A，D53E，D53N和D53K，小鼠扭體法測定重組BmK9及其突變體的鎮(zhèn)痛活性。結(jié)果顯示除D53E這一保守取代外，其余三個突變都導致了鎮(zhèn)痛活性的顯著降低。目前的研究結(jié)果提示，Asp53與東亞鉗蝎神經(jīng)毒素BmK9的鎮(zhèn)痛活性相關，其側(cè)鏈羧基發(fā)揮了關鍵作用。

【關鍵詞】Asp53 BmK9 鎮(zhèn)痛活性 定點突變 結(jié)構功能關系

東亞鉗蝎（BmK）作為傳統(tǒng)中藥用于治療多種慢性疼痛已有幾千年的歷史，迄今為止，發(fā)現(xiàn)了十余種多肽類的東亞鉗蝎毒素具有鎮(zhèn)痛活性[1-5]。它們都是60-76個氨基酸構成的單鏈多肽，屬于蝎長鏈神經(jīng)毒素，具有共同的結(jié)構核心[6]。這些毒素結(jié)構的相似性是否意味著它們有著共同的鎮(zhèn)痛活性相關位點值得關注，研究者通過基因突變分析的方法對幾個毒素的結(jié)構鎮(zhèn)痛活性關系進行了考察，揭示了幾個位點與鎮(zhèn)痛活性的關聯(lián)[5，7-11]。最近，鄧理等報道了兩個保守的酪氨酸（Tyr5 和Tyr42） 在BmK AGP-SYPU1[12]鎮(zhèn)痛活性中的作用，但有關東亞鉗蝎毒素鎮(zhèn)痛活性相關位點的信息還非常有限。

BmK9是從東亞鉗蝎蝎毒獲得的65個氨基酸殘基構成的單鏈鎮(zhèn)痛活性肽[5]，編碼BmK9前體（GenBank ID： DQ981785）的全長cDNA已被克隆。BmK9的53位是一個天冬氨酸，在大多數(shù)的東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛肽中該位點都被天冬氨酸占據(jù)（圖1所示），但是目前還沒有Asp53在這類毒素鎮(zhèn)痛活性中作用的研究。本研究對BmK9在53位進行定點突變以考察53位天冬氨酸在鎮(zhèn)痛活性中的作用?；讷@得的實驗結(jié)果，討論了Asp53在BmK9鎮(zhèn)痛活性中的重要性。

通過ClustalW2進行比對[13]（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）。在序列中插入空隙（用“-”表示）以獲得最大相似性，氨基酸殘基的編號及序列一致性以BmK9為依據(jù)，53位殘基用箭頭指示?；驇煨蛄刑柸缦拢築mK9 （DQ981785），BmK AngM1 （AF164203），BmK AGAP（AF464898），BmK AGP-SYPU1 （GU726488），BmK AGP-SYPU2 （GU726489），BmK dITAP3 （AF064821）[14]，BmK IT2 （UniProtKB/Swiss-Prot： P68727）[15]，BmK IT-AP （AF156171），BmK AS （AF079060）和BmK AS1 （AF079061）[16]。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pSYPU-BmK9和pSYPU由實驗室構建，用于表達的宿主菌BL21（λDE3）購于上海生工生物工程技術服務有限公司；限制性內(nèi)切酶，T4 DNA 連接酶，Taq DNA聚合酶和引物來自南京金斯瑞生物工程技術服務有限公司；金屬離子螯合親和層析及陽離子交換層析介質(zhì)購于瑞典Pharmacia公司；SPF級昆明種小白鼠由北京華富康生物科學公司（NO： SCXK-[京]2009-004，北京，中國）提供。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構建

根據(jù)BmK9的序列設計4個下游引物：D53A，5′-CGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT AGC GGG CA-3′； D53N，5′-CCGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT ATT GGG CA-3′；D53E，5′-CCGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT TTC GGG CA-3′；D53K，5′ -CCGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT CTT GGG CA-3′。以質(zhì)粒pSYPU-BmK9為模板，T7引物為上游引物，D53A，D53N，D53E和D53K分別為下游引物進行PCR擴增。產(chǎn)物酶切后克隆至載體pSYPU，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取陽性克隆菌落PCR驗證后測序。

1.2.2 誘導表達及分離純化

將含有重組質(zhì)粒pSYPU-BmK9，pSYPU-BmK9/D53A，pSYPU-BmK9/D53N pSYPU-BmK9/D53E 和 pSYPU-BmK9/D53K 的大腸桿菌接種于含 50 mg·L-1 卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，異丙基-β-D -硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導目的蛋白表達。收集菌體超聲破碎后離心，上清液經(jīng)金屬離子螯合的親和層析柱（Chelating Sepharose Fast Flow， 1.0 cm×6.5 cm）進行初步純化，以pH值3.0的0.1 mol·L-1 PBS洗脫目的蛋白。收集目的蛋白，經(jīng)SP Sepharose Fast Flow柱（1.0 cm×20 cm）進一步純化，用0～1.0 mol·L-1NaCl水溶液（含50 mmol·L-1PBS，pH值6.6）梯度洗脫目的蛋白。SDS-PAGE 分析重組蛋白純度，考馬斯亮藍R-250 染色[8]。

1.2.3 鎮(zhèn)痛活性

小鼠醋酸扭體法考察鎮(zhèn)痛活性，用生理鹽水配制合適濃度的重組蛋白溶液進行活性檢測。取18～20g昆明種 SPF 級小鼠，雌雄各半，隨機分組，每組10只，按 0.5mg/kg 的劑量尾靜脈給藥，20min 后按 0.2ml/20g 體重腹腔注射 0.6% 醋酸引起內(nèi)臟痛，5min 后記錄小鼠 10min 內(nèi)的扭體次數(shù)。以重組BmK9 為陽性對照，生理鹽水為陰性對照，按照下述公式計算各個給藥組的扭體反應抑制率。

2 結(jié)果

2.1 表達載體的構建

以質(zhì)粒 pSYPU-BmK9為模板，T7引物為上游引物，D53A，D53N，D53E和D53K分別為下游引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物克隆至表達載體pSYPU，構建成功的表達質(zhì)粒分別熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21（λDE3）細胞，挑取重組子驗證。DNA序列測定顯示 BmK9 及其突變體基因均正確克隆。

2.2 誘導表達及分離純化

IPTG誘導后，重組蛋白主要以可溶性形式表達。兩步層析法純化重組蛋白后，15%SDS-PAGE分析重組蛋白（以突變體D53A為例）的純度，結(jié)果見圖2所示，重組蛋白的純度基本達到電泳純。

泳道1，兩步層析純化的重組BmK9；泳道2，兩步層析純化的突變體D53A；泳道M，低分子量蛋白標準品

2.3 鎮(zhèn)痛活性

如表1所示，與生理鹽水組相比，重組BmK9及其突變體均呈現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛效果（p<0.05）。與重組BmK9相比，突變體D53A，D53N和D53K的鎮(zhèn)痛活性均顯著降低，而突變體D53E與重組BmK9的鎮(zhèn)痛活性無明顯差別。

3 討論

大多數(shù)來自東亞鉗蝎的具有鎮(zhèn)痛活性的多肽類神經(jīng)毒素的53位都是天冬氨酸，Asp53在這類毒素鎮(zhèn)痛活性中的作用有待鑒定，而定點突變是闡明特定位點氨基酸殘基作用的一種有效途徑。用非極性的甲基（CH3）取代天然毒素的羧甲基（CH2COOH），突變體D53A的鎮(zhèn)痛活性顯著降低（下降42%），提示Asp53與BmK9的鎮(zhèn)痛活性相關，其側(cè)鏈羧基發(fā)揮了關鍵作用。極性不帶電荷的天冬酰胺取代天冬氨酸的突變D53N也導致鎮(zhèn)痛活性的顯著降低（下降50%），提示Asp53的側(cè)鏈羧基是通過凈電作用在鎮(zhèn)痛活性中發(fā)揮作用。同種電荷取代的突變體D53E的鎮(zhèn)痛活性與BmK9的鎮(zhèn)痛活性幾乎相同，而相反電荷取代的突變體D53K的鎮(zhèn)痛活性顯著降低（下降34%），則進一步證實了53位的側(cè)鏈負電荷對毒素鎮(zhèn)痛活性的重要性。

本研究結(jié)果提示東亞鉗蝎神經(jīng)毒素BmK9的Asp53通過其側(cè)鏈羧基的凈電作用在鎮(zhèn)痛活性中發(fā)揮關鍵作用，這一結(jié)果為蝎毒素結(jié)構鎮(zhèn)痛活性關系研究提供了進一步的信息。

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