趙雪梅,宋建英,王茜,王軟林,楊斌盛,梁愛華*

(1.山西大學 生物技術研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,太原 030006;2.山西大學 分子科學研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,太原 030006)

八肋游仆蟲ARF1蛋白的表達純化及其與嘌呤核苷酸的相互作用

趙雪梅1,宋建英1,王茜1,王軟林1,楊斌盛2,梁愛華1*

(1.山西大學 生物技術研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,太原 030006;2.山西大學 分子科學研究所,化學生物學與分子工程教育部重點實驗室,太原 030006)

ADP核糖基化因子1(ARF1)是Ras超家族的成員,調控細胞內囊泡運輸,進而影響細胞的生長發(fā)育。為了研究單細胞真核生物八肋游仆蟲ARF1的功能,構建了重組表達質粒pET28a-ARF1,在大腸桿菌BL21中進行了表達純化,獲得高純度的八肋游仆蟲腺苷酸核糖基化因子1蛋白EoARF1,隨后通過熒光光譜法檢測了其與嘌呤核苷酸的相互作用。結果表明,表達純化的EoARF1蛋白能與嘌呤核苷酸發(fā)生相互作用,其結合位點數(shù)n約等于1,且與鳥嘌呤核苷酸作用強弱順序為GTP>GDP>GMP,與GDP的結合強度明顯大于與ADP的結合強度。

ADP核糖基化因子1;八肋游仆蟲;表達純化;熒光光譜法

細胞內的物質轉運對于細胞的生存和生長至關重要,真核細胞大分子與顆粒性物質的跨膜運輸是通過將它們包裹在脂雙層膜圍繞的囊泡中進行轉運[1]。囊泡轉運受多種調節(jié)分子控制,其中就有ADP核糖基化因子1(ADP ribosylation factor 1, 簡稱ARF1)[2]。ARF1蛋白是肉豆蔻酰基化的小鳥嘌呤核苷結合蛋白家族中的一員,是霍亂毒素的變構激活劑,主要參與網格狀蛋白和無網格狀蛋白兩種囊泡被膜的形成,并進一步調控囊泡運輸,參與細胞內物質運輸[3-4]。與其他GTPase一樣,當它結合GDP成為失活態(tài),結合GTP時被激活成活化態(tài),活化后的ARF1與下游效應分子相互作用形成運輸囊泡,主要是通過調節(jié)鳥嘌呤核苷置換因子(GEFs)、BFA和GTP酶活化蛋白(GAPs)來進行調節(jié)[5-10]。而GAP 能水解ARF1上的GTP,促使這兩種囊泡的被膜和膜解離,從而囊泡和目的細胞器的膜最終融合[11]。這樣囊泡可在內質網和高爾基復合體之間運輸多種細胞內物質。人的 ARF1(hARF1)由181個氨基酸組成,含有ARF家族中與GTP結合與水解的結構域(GX4GK, DVGG, NKQD, CAT)和N末端作為十四烷基化位點高度保守的第二位甘氨酸[12-13]。有文獻報道,利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達獲得的重組hARF1能夠在體外與GDP/ADP相互作用,與GDP的結合強度大于與ADP的結合[14]。

纖毛蟲是一類結構復雜的單細胞原生動物,有兩種大小不同的核,一種是二倍體的小核,負責基因重組,另一種是多倍體的大核,負責調控細胞生長發(fā)育。這類生物體內各細胞器之間囊泡運輸系統(tǒng)極為完善。本課題組前期對八肋游仆蟲(Euplotesoctocarinatus)的小分子GTP酶Rab蛋白家族進行了基因克隆,并在體內研究了部分Rab蛋白的定位和功能[15]，然而對游仆蟲中ARF家族成員在膜泡運輸過程中的功能了解甚少。為了研究游仆蟲ARF1的性質與功能,克隆了八肋游仆蟲的ARF1基因,構建了重組表達質粒pET28a-ARF1,在大腸桿菌中進行了表達純化,獲得了高純度的八肋游仆蟲ARF1(EoARF1),表達產物經Western blot檢測為陽性,通過熒光光譜技術檢測了EoARF1蛋白與嘌呤核苷酸之間的相互作用,為進一步研究EoARF1蛋白的功能奠定了實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

1.1.2 菌株和質粒

八肋游仆蟲由本課題組通過綠藻培養(yǎng);菌株E.coliDH5α,E.coliBL21(DE3) 由本實驗室保存;表達載體pET-28a(+)購于Novagen公司,其中含有T7啟動子和6×His標簽,帶有卡那霉素(Kanamycin)抗性;PCR引物由Sangon Biotech公司合成;DNA測序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.1.3 試劑

質粒小量提取試劑盒,膠回收試劑盒購于TIANGEN公司,DNA Taq聚合酶、Trans2k PlusⅡ DNA Marker購于全式金生物技術有限公司;限制性內切酶、T4 DNA連接酶購于TaKara公司;GDP-2Na和ADP-2Na、GTP-3Na、GMP-2Na購于Sangon Biotech公司,HisTrap FF 5 mL預裝柱和SuperdexTM75 凝膠層析柱購于GE Healthcare公司;其他常用試劑均購于Sangon Biotech公司。

1.2 實驗方法

1.2.1EoARF1基因的克隆

根據(jù)八肋游仆蟲的基因組轉錄組數(shù)據(jù),設計EoARF1基因特異性引物,上游引物:5’-CGGGATCCATGGGATTTGTGTTTTC-3’;下游引物:5’-ACGCGTCGACTTTCAAGAATTTACTTT-3’;分別以游仆蟲基因組和cDNA為模板進行PCR擴增(95℃變性5 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30循環(huán)后72℃延伸5 min, 得到EoARF1擴增產物。與克隆載體pMD?18-T過夜連接后,轉入大腸桿菌DH5α中,篩選獲得陽性克隆,提取pMD?18-EoARF1質粒后交由公司測序鑒定。

1.2.2 pET28a-ARF1-T重組表達質粒的構建

以質粒pMD?18-EoARF1為模板,利用上述EoARF1特異性引物進行PCR,將純化的PCR產物與表達載體pET28a均用限制性內切酶BamHⅠ和SalⅠ分別進行酶切并進行膠回收,然后利用T4 DNA連接酶16℃過夜連接。將連接產物轉化于大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,涂在含35 μg/mL 卡那抗性的LB平板上。次日選取陽性轉化子進行菌液PCR初步篩選,隨后進行質粒提取,用BamHⅠ和SalⅠ對質粒進行雙酶切鑒定后,送北京華大基因公司測序驗證獲得pET28a-ARF1。

為使EoARF1基因能在大腸桿菌中表達,設計了定點突變引物將328位的苯丙氨酸(T)刪除使其能夠順利通讀,上游引物:5’-GTTAGTCAACTAGAATTCTTTAACCTTATCCTT-3’;下游引物:TTCAGAATTAAGGATAAGGTTAAAGAATTC;以質粒pET28a-ARF1為模板,進行PCR突變,取8 μL PCR產物加入0.5 μLDpnⅠ和2 μL Buffer,37℃過夜消化后,轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,在含有卡那抗性的LB固體平板培養(yǎng)基上37℃倒置培養(yǎng)約16 h,挑取單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),提取質粒pET28a-ARF1-T,交由公司測序鑒定。

1.2.3 EoARF1重組蛋白的表達純化

將測序正確的重組質粒pET28a-ARF1-T轉化于大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中,涂布在含有卡那抗性的LB平板上,37℃恒溫過夜培養(yǎng)。挑取單菌落至5 mL含卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),次日將菌液按1∶100的比例擴大接種至500 mL含有卡那抗性的LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至OD600達到0.4-0.6,加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,37℃誘導5 h后,8 000 r/mim,4℃離心10 min收集菌體。然后用40 mL緩沖液(20 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,10 mmol/L 咪唑,pH 8.0)進行懸洗,置于冰浴中進行超聲破碎至無明顯菌體,13 000 r/min離心20 min,收集上清,將上清蛋白加入已用平衡緩沖液 (20 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,10 mmol/L 咪唑,pH 8.0)平衡好的鎳柱中,置于4℃搖床結合 2 h;利用洗滌緩沖液 (20 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L 咪唑,pH 8.0)對非特異結合的蛋白進行洗滌;最后再用洗脫緩沖液 (濃度梯度咪唑,pH 8.0) 將目的蛋白進行洗脫;合并洗脫液,利用10 kD 的濃縮管將目的蛋白通過4℃,3 000 r/mim條件進行濃縮至1 mL,將濃縮蛋白利用0.22 μm濾膜進行過濾后,上樣于用緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L NaCl, pH 7.4)平衡好的 SuperdexTM75 凝膠層析柱, 以達到進一步純化的目的。將純化的目的蛋白經 15% SDS-PAGE檢測,并將濃縮后的蛋白經酶標儀檢測濃度后,于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 EoARF1重組蛋白的Western Blot檢測

將目的蛋白經15% SDS-PAGE分離后,剪同樣大小的兩張濾紙和PVDF膜,將PVDF膜放置于甲醇中,進行活化20 s后,在蒸餾水中清洗2 min,置于轉膜儀中,90 V恒壓冰浴轉膜90 min,轉膜結束后將PVDF膜置于脫脂牛奶封閉液中封閉1 h,利用anti-His抗體4℃孵育過夜(1∶1 500稀釋),PBST中清洗3-5次后,羊抗鼠熒光二抗(1∶10 000稀釋)4℃孵育1 h,PBST中清洗5次后經Odyssey Family雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)掃膜成像。

1.2.5 熒光光譜法測定EoARF1蛋白與嘌呤核苷酸的相互作用

采用熒光光譜法測定EoARF1蛋白與嘌呤核苷酸GMP/GDP/GTP以及ADP的相互作用[14]。蛋白質因含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸殘基而能發(fā)射較強的內源熒光,在270～300 nm的紫外光照射下發(fā)出熒光,當測定體系中加入小分子配體時,配體和蛋白質發(fā)生弱相互作用,會導致蛋白質熒光的靜態(tài)淬滅。利用這個現(xiàn)象,可以確定蛋白質與配體的作用類型以及其結合部位等[16-17]。

將EoARF1純化蛋白用緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L NaCl,pH 7.4)調節(jié)至終濃度為1.25 μmol/L。取2 mL置于4 mL石英比色皿中,隨后利用10 mmol/L GDP溶液進行熒光滴定(累積滴定1、2、4、8、16 μL等等),直到熒光強度穩(wěn)定為止。在每次滴加GDP溶液結束后攪拌均勻,穩(wěn)定2 min后,進行熒光光譜變化的測量。設定測試條件:室溫下 (25℃),激發(fā)波長280 nm,掃描波長300～450 nm,狹縫寬度激發(fā)狀態(tài)為4.0 nm,發(fā)射狀態(tài)為5.0 nm,掃描速率300 nm/min。在同等條件下,分別利用 10 mmol/L 的GMP/GTP/ADP溶液取代GDP溶液重復以上實驗。

2 結果與分析

2.1 八肋游仆蟲ARF1基因克隆、序列分析及重組質粒pET28a-ARF1的構建

序列分析表明,游仆蟲ARF1基因編碼區(qū)全長 565 bp,無內含子。編碼區(qū)有兩個開放閱讀框,第一個讀框編碼ARF1的前109個氨基酸,而從328 bp起的第二個開放讀框編碼ARF1剩余的78個氨基酸。該基因序列已經提交GanBank,登錄號為KU981055。分析后初步確定這個基因是游仆蟲中的一個+1位的編程性移碼基因,兩個讀框的銜接處是TTTTAAC,屬于一個新的七核苷酸滑動序列類型[18],兩個讀框編碼的完整游仆蟲ARF與人的ARF1序列同源性為 45.9%。含有與 GTP結合與解離相關的四個結構域(見討論)。

以pMD?18-EoARF1質粒為模板,利用上下游引物擴增EoARF1基因,將其克隆到表達載體pET28a(+)中,通過雙酶切鑒定以及測序證實重組質粒pET28a-ARF1構建成功。為了使這個基因能夠在大腸桿菌中得到表達,通過定點突變將七核苷酸滑動序列TTTTAAC變?yōu)門TTAAC(圖1),以保證產生結構域完整的EoARF1。

Fig.1 Partial sequences before (A) and after (B) site-directed mutation of EoARF1 gene圖1 EoARF1基因的定點突變前(A)后(B)的序列

2.2 EoARF1重組蛋白的表達純化

將重組表達質粒pET28a-ARF1-T轉化至大腸桿菌BL21中進行表達,表達產物通過15% SDS-PAGE分析,在分子量約為25 kD左右出現(xiàn)一條誘導表達蛋白條帶,并且該表達產物存在于上清液中,而在未經IPTG誘導的工程菌中無此條帶,將上清液中的目的蛋白通過親和層析進行純化,SDS-PAGE中顯示為單一條帶(圖2A,泳道3-5),Western印跡分析表明,可溶性的EoARF1 蛋白可與anti-His 抗體特異性反應(圖2B)。隨后對目的蛋白又進行了SuperdexTM75 凝膠柱層析純化(圖2C),SDS-PAGE分析表明蛋白達到了電泳純(圖2D)。

A: SDS-PAGE analysis of expressed product. Lane 1: whole cell lysate of E.coli BL21(DE3)/pET28a-ARF1;Lane 2:Supernatant of E.coli BL21(DE3)/pET28a-ARF1; Lane 3-5: protein fraction from the Ni-column eluted with 50 mmol/L, 100 mmol/L and 150 mmol/L imidazole; B: Western blot of pET28a-ARF1;C: Gel filtration chromatography of the EoARF1; D: SDS-PAGE analysis of purified EoARF1 protein.Lane M: Low molecular weight markerFig.2 Expression and purification of pET28a-ARF1A: 表達產物的SDS-PAGE圖。Lane 1:E.coli BL21(DE3)/pET28a-ARF1全菌;Lane 2:E.coli BL21(DE3)/pET28a-ARF1上清;Lane 3-5;不同濃度咪唑洗脫樣品;B: pET28a-ARF1 的Western 印跡分析;C: ARF1蛋白經凝膠柱純化的洗脫圖;D:SuperdexTM75 凝膠柱層析純化后的EoARF1的SDS-PAGE圖。 Lane M: 低分子量標準蛋白圖2 pET28a-ARF1的表達純化

2.3 EoARF1蛋白與嘌呤核苷酸相互作用的熒光光譜分析

為了探究表達的EoARF1是否具有與嘌呤核苷酸的結合活性,采用熒光光譜法[14]。EoARF1蛋白編碼181個氨基酸,其內源熒光來自于分子中的色氨酸(W66,W78,W153,W172)和酪氨酸(Y35,Y81,Y91)。將EoARF1蛋白濃度固定后,隨著鳥嘌呤GMP/GDP/GTP或者腺嘌呤ADP濃度的增加,EoARF1蛋白的內源熒光強度降低,不同濃度的嘌呤核苷酸導致EoARF1蛋白的熒光猝滅結果見圖3。

EoARF1蛋白與嘌呤核苷酸形成復合物引起熒光猝滅,二者的結合可用熒光物質-猝滅分子間的結合常數(shù)表達式lg{[F0-F]/F}=lgK+nlg[Q]進行計算[19],求得結合常數(shù)以及結合位點數(shù)(表 1)。

A:Fluorescence spectroscopies of the addition GMP to EoARF1. B:Plot of lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]} versus lgGMP of EoARF1. C: Fluorescence spectroscopies of the addition GDP to EoARF1.D:Plot of lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]} versus lgGDP of EoARF1.E: Fluorescence spectroscopies of the addition GTP to EoARF1. F:Plot of lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]} versus lgGTP of EoARF1.G:Fluorescence spectroscopies of the addition ADP to EoARF1.H:Plot of lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]} versus lgADP of EoARF1Fig.3 Fluorescence quenching by the addition GMP/GDP/GTP/ADP to EoARF1 A:GMP滴定EoARF1的熒光光譜;B: lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]}對lgGMP作圖。 C: GDP滴定EoARF1的熒光光譜;D: lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]}對lgGDP作圖。 E: GTP滴定EoARF1的熒光光譜;F:lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]}對lgGTP作圖。 G: ADP滴定EoARF1的熒光光譜;H:lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]}對lgADP作圖。圖3 以GMP/GDP/GTP/ADP滴定EoARF1的熒光淬滅圖

嘌呤核苷酸結合常數(shù)(Ka)結合位點數(shù)(n)相關系數(shù)(R)GMP4.53×103mol-0.8320.8320.9985GDP6.82×103mol-0.9030.9030.9985GTP7.06×103mol-0.8790.8790.9884ADP1.88×103mol-0.7780.7780.9950

表1結果顯示,表達純化的EoARF1蛋白能夠與嘌呤核苷酸相互作用,且結合位點數(shù)n≈1,與GMP、GDP和GTP的結合常數(shù)分別為4.53×103mol-、6.82×103mol-、7.06×103mol-,表明其與鳥嘌呤核苷酸作用強弱順序為GTP>GDP>GMP,此外與ADP的結合常數(shù)為1.88×103mol-,表明EoARF1蛋白與GDP的結合強度大于與ADP的結合,與重組hARF1與嘌呤核苷酸結合性質一致[14]。

3 討論

真核細胞中許多大分子物質的運輸需要通過囊泡轉運完成,其中COP I(coat protein I)型囊泡主要介導內質網和高爾基體之間和高爾基體內部的轉運過程[20],ARF1蛋白是COPⅠ包被的囊泡運輸中重要的調節(jié)蛋白。ARF1在GDP結合型和GTP結合型兩種構象間循環(huán),當它與GDP結合時為非活性狀態(tài),位于胞質中,而與GTP結合時為活性狀態(tài),可以錨定在膜上,這種狀態(tài)的ARF1能夠啟動COPⅠ囊泡的形成[21]。本研究主要將單細胞真核生物八肋游仆蟲的ARF1基因在大腸桿菌BL21中進行了表達純化,得到高純度的重組蛋白,利用光譜學手段研究了重組EoARF1蛋白與嘌呤核苷酸的相互作用。

Fig.4 Alignment of deduced amino acid sequence of ARF1 from different organisms.The blue box shows the conserved motif involved in GTP dissociation.The red boxes show the conserved motifs involved in GTP binding.The red triangle indicates G2, the site of N-terminal myristoylation afterco-translational removal of methionine.The red asterisks indicate the frameshift region圖4 八肋游仆蟲ARF1與其他生物的ARF1的氨基酸序列比對圖。藍色方框標注的是保守的GTP解離結構域,紅色方框標注的是保守的GTP結合結構域,紅色三角形標注的是N末端十四烷基化位點G2,紅色星號標注的是移碼位點

分析八肋游仆蟲ARF1基因序列時發(fā)現(xiàn),該基因是一個編程性核糖體移碼基因(programmed ribosomal frameshift, PRF),編程性核糖體移碼是指翻譯中的核糖體在mRNA上的特定位置,從起始的0讀框轉換到+1或-1讀框,然后繼續(xù)翻譯的現(xiàn)象[22],目前已經在多種生物中發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象的存在。編程性核糖體移碼是在翻譯水平上的一種基因表達調控方式。本實驗室通過基因組轉錄組研究發(fā)現(xiàn),八肋游仆蟲中存在高頻率的編程性核糖體移碼現(xiàn)象[18]。八肋游仆蟲的ARF1基因移碼位點位于距翻譯起始109氨基酸殘基處,對應的氨基酸序列為107-EFFN-110 (圖4,星號表示),如果不發(fā)生移碼,只能形成一個截短蛋白。有文獻報道,利用分子對接法表明重組hARF1蛋白與嘌呤核苷酸的結合位點位于高度保守的GDP結合區(qū)域(126-NKQD-129),且GDP能通過與TCAT結構域(158-TCAT-161)的相互作用來增加其穩(wěn)定性,其中Ala-160與鳥嘌呤堿基形成氫鍵[14]。該分子對接結果提示,這種相互作用既有嘌呤核苷酸分子中磷酸基團的參與,也有堿基的作用[14]。八肋游仆蟲ARF1與鳥嘌呤核苷酸作用的熒光光譜結果顯示其結合強弱順序為GTP>GDP>GMP,體現(xiàn)了磷酸基團在結合中的重要性；同時,當比較鳥嘌呤核苷酸GDP以及腺嘌呤核苷酸ADP與EoARF1結合常數(shù)時,表明EoARF1蛋白與GDP的結合強度大于與ADP的結合,體現(xiàn)了堿基在相互作用中的重要性。因此,本研究從實驗上支持了利用hARF1與嘌呤核苷酸分子對接結果。

比較八肋游仆蟲ARF1與其他生物的ARF1氨基酸序列發(fā)現(xiàn),游仆蟲的ARF1序列中也同樣含有保守氨基酸序列NKXD(圖4,見紅色方框),然而這個結構域在移碼位點之后。如果這個基因在游仆蟲體內是有功能的,在蛋白質翻譯時必須通過一次+1移碼產生一個包括NKXD結構域的完整蛋白,才能與GDP結合,發(fā)揮其囊泡運輸?shù)恼{節(jié)功能。游仆蟲ARF1的TCAT相應結構域處是CCAL(圖4,紅色方框),保守的Ala氨基酸可與鳥嘌呤形成氫鍵,增強了鳥嘌呤與ARF1結合的穩(wěn)定性。本研究為后續(xù)游仆蟲ARF1特異性抗體制備提供了實驗材料,同時也為游仆蟲編程性核糖體移碼機制的研究提供了新思路。

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Expression and Purification of a Recombinant ARF1 ofEuplotesoctocarinatusand Its Interaction with Purine Nucleotides

ZHAO Xuemei1,SONG Jianying1,WANG Xi1,WANG Ruanlin1,YANG Binsheng2,LIANG Aihua1*

(1.Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006,China;2.Institute of Moleculat Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

ADP ribosylation factor 1 (ARF1) is a member of the Ras superfamily, which regulate the intracellular vesicle transport and thereby affect the cell growth and development. In order to study the function of ARF1 fromEuplotesoctocarinatus, a recombinant plasmid pET28a-ARF1 was constructed and expressed inE.coliBL21. High purity of EoARF1 was obtained. The interaction between EoARF1 with purine nucleotides was investigated by using fluorescence spectroscope. The results showed that the EoARF1 protein could interact with purine nucleotides, the binding site value was nearly one and the intensity of the interaction with guanine nucleotides was GTP>GDP>GMP. In addition, the binding constant indicated that the interaction between EoARF1 and GDP was stronger than that of ADP.

ADP ribosylation factor 1;Euplotesoctocarinatus;expression and purification;fluorescent spectrometry

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.02.026

2016-12-22；

2017-02-17

國家自然科學基金(31372199；31272100)

趙雪梅(1990-)，女，山西朔州人，碩士研究生，研究方向為原生動物細胞分子生物學。E-mail:464391230@qq.com

*通信作者：梁愛華(LIANG Aihua),E-mail:aliang@sxu.edu.cn

Q74

A

0253-2395(2017)02-0365-08