陳玨,張立偉

(1.山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,山西 太原 030006)

低共熔溶劑對丹酚酸B藥物組織分布的影響

陳玨1,2,張立偉1*

(1.山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,山西 太原 030006)

為了研究低共熔溶劑對丹酚酸B在小鼠體內(nèi)的藥物組織分布影響,將健康小鼠隨機分為對照組和受試組,其中對照組和受試組分別給予溶解在水中的丹酚酸B和溶解在氯化膽堿-甘油(摩爾比1∶2)中的丹酚酸B,小鼠按200 mg/kg灌胃給予丹酚酸B后收集不同時間點的心、腦、肝組織器官,并采用HPLC-MS法測定給藥后組織中的丹酚酸B含量。結(jié)果表明,受試組中丹酚酸B在肝組織的達峰時間為20 min,較對照組相比提前了10 min;且達峰濃度為1.66 μg/g,約為對照組峰濃度的1.63倍。由此可見,低共熔溶劑可以增加丹酚酸B在小鼠肝組織中的分布,并且加快其吸收和消除,起到一定的減毒增效作用。

低共熔溶劑;丹酚酸B;藥物組織分布

0 引言

低共熔溶劑是由氫鍵受體(常為季銨鹽)與氫鍵供體(多元醇、多元酸、金屬鹽和尿素等)以一定化學(xué)計量比通過氫鍵形成的均一穩(wěn)定體系,且形成的低共熔溶劑熔點低于組成原料[1]。低共熔溶劑的理化性質(zhì)(密度、粘度、導(dǎo)電性等)與離子液體相似,因此被稱為“新型離子液體”[2-3];但與離子液體相比,低共熔溶劑具有基本無毒、合成簡單、原料利用率高、價格低廉、可生物降解等優(yōu)勢[4-6]。由此可見,低共熔溶劑有望替代離子液體,廣泛應(yīng)用到各個領(lǐng)域[7-9]。

丹酚酸B為中藥丹參的主要水溶性活性成分之一,目前在臨床上主治缺血性中風(fēng)[10]。現(xiàn)代研究表明丹酚酸B具有抗氧化、抗纖維化、清除自由基等多種活性[11-13],對心、肝、腦等均有顯著的藥理作用[14-15]?，F(xiàn)有文獻報道丹酚酸B口服給藥后在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)顯示,它具有吸收差、穩(wěn)定性差和首過效應(yīng)等缺陷[16-17]。而我們之前的研究證明低共熔溶劑可以增強丹酚酸B的穩(wěn)定性[18],并且促進丹酚酸B的透膜吸收。因此,本研究采用低共熔溶劑溶解丹酚酸B,對小鼠灌胃給藥,用來研究低共熔溶劑對丹酚酸B體內(nèi)組織分布的影響,以期為低共熔溶劑作為藥物載體在藥效學(xué)和制劑學(xué)的進一步研究和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

METTLER TOLEDO分析天平(萬分之一級);離心機;勻漿機;渦旋儀;美國 Waters 2695高效液相色譜儀,2998PDA檢測器。

甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸均為色譜純;水為娃哈哈純凈水;丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品純度>99%,由成都曼斯特生物科技有限公司提供。

1.2 動物

4-5周的清潔級小鼠(北京海淀興旺動物養(yǎng)殖場提供,許可證號:SCXK-(軍)2012-2004),體重20～22 g,數(shù)量108只,雌雄各半。小鼠雌雄分開飼養(yǎng)于小鼠籠內(nèi),保持恒溫(22 ± 2℃)、恒濕(40%)及12 h光暗周期的飼養(yǎng)條件。小鼠適應(yīng)環(huán)境一周后進行實驗,實驗前小鼠禁食12 h,但允許自由飲水。

1.3 低共熔溶劑的合成

低共熔溶劑是由氯化膽堿和甘油以摩爾比1∶2的比例(ChCl-GL,1∶2)混合后,在100℃的恒溫磁力攪拌器中持續(xù)加熱攪拌直至形成宏觀上均一穩(wěn)定的透明液體。

1.4 色譜條件

丹酚酸B在小鼠組織中的分析測定采用Waters Acquity H-class UPLC?液相系統(tǒng)(Waters,Milford,MA,USA),含在線真空脫氣機、高壓四元泵、自動進樣器、柱溫箱、UPLC?-光電二極管陣列(PDA)檢測器和QDA質(zhì)譜檢測器。QDA質(zhì)譜檢測器采用正離子模式和負離子模式,ESI毛細管電壓為±0.8 kV,錐孔電壓為15 V,探頭溫度為600℃,離子掃描范圍設(shè)置為m/z100～1 000。色譜分離采用ACQUITY UPLC?BEH C18反相柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters, USA);柱溫:20℃;流動相:0.4%甲酸水溶液(V/V)(A)-乙腈(B);梯度洗脫程序:0～8 min 時10%～50% B,8～12 min時50%～80% B,12～15 min 時80%～100% B。流速:0.3 mL/min。進樣體積:10 μL。數(shù)據(jù)采集及處理采用Empower 2分析軟件(Waters, Milford, MA, USA)。

1.5 組織樣品的采集和處理方法

將適量丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品分別置于兩個10 mL離心管中,分別加入適量純水和低共熔溶劑(ChCl-GL 1∶2),其中丹酚酸B的濃度均為40 mg/mL。

取禁食12 h的昆明小鼠(雌雄各半)隨機分為兩組,分別灌胃給藥丹酚酸B溶解于水中(對照組,SAB-H2O)和丹酚酸B溶解于ChCl-GL 1∶2(受試組,SAB-DES)。每組每個時間點均為6只小鼠,給藥劑量為200 mg/kg,給藥體積為5 mL/kg,并于給藥前和給藥后0.083、0.33、0.5、1、2、5、12、24 h處死6只小鼠并放凈血液,立即在冰盤中剖取心臟、肝臟和大腦等組織樣品。

組織樣品用預(yù)冷的生理鹽水漂洗凈殘血,濾紙吸干后稱重,用2倍量生理鹽水勻漿,然后4 500 r/min離心10 min,取上清液作為組織勻漿液備用。精密吸取0.20 mL組織液,置于2 mL離心管中,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL和10%鹽酸(V/V,10 μL),渦旋1 min;然后加入600 μL乙酸乙酯經(jīng)2 min 渦旋震蕩后,以4 500 r/min 離心10 min,取上清液轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中,氮氣流吹干后用100 μL乙腈使殘留物溶解,再渦旋2 min,12 000 r/min離心10 min,取上清液,HPLC-MS進樣測定。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

精密稱取丹酚酸B適量,用水配成1.0 mg/mL的母液,然后稀釋為一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液。內(nèi)標(biāo)氯霉素用水配成1.0 μg/mL的工作液。取200 μL空白組織液,加入10 μL 10%鹽酸水溶液混合和50 μL內(nèi)標(biāo)工作液,然后加入50 μL稀釋到合適濃度的丹酚酸B工作液。該混合溶液渦旋混勻1 min之后,在4℃于12 000 r/min離心10 min,制得0.05、0.15、0.75、3.75、5.00和10.00 μg/mL的丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。三個高中低濃度的質(zhì)控(quality control,QC)樣品以同樣方法制備,丹酚酸B的濃度分別為0.05、0.75、5.00 μg/mL。所有溶液置于-20℃冰箱待用。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時,待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo),丹酚酸B濃度為橫坐標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性考察

圖1為小鼠心、肝、腦的空白組織色譜圖(A)、空白組織中加入丹酚酸B及內(nèi)標(biāo)后的色譜圖(B)及給藥30 min后組織樣品處理所得的色譜圖(C),通過比較證明小鼠組織中所含內(nèi)源性物質(zhì)對丹酚酸B和內(nèi)標(biāo)均無干擾,待測物的專屬性良好。其中,在該檢測條件下,內(nèi)標(biāo)和丹酚酸B的保留時間分別為4.28和4.71 min。

Fig.1 Chromatograms of blank tissue (A), blank tissue spiked with salvianolic acid B and IS (B) and tissue sample after oral administration for 30 min and IS(C)圖1 空白組織(A)、空白組織加丹酚酸B及內(nèi)標(biāo)(B)和給藥后的組織樣品及內(nèi)標(biāo)(C)色譜圖

2.1.2 線性關(guān)系及最低定量限

精密取大鼠空白組織勻漿液 200 μL,分別精密加入系列濃度0.05、0.15、0.75、3.75、5.00和10.00 μg/mL的丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)工作液200 μL,渦旋混勻 1 min,按照“1.5” 節(jié)下方法操作,測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個濃度平行制備6份樣品。每個樣品測定3次,記錄各對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比,以峰面積比為縱坐標(biāo)Y,對照品濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)X,計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2),結(jié)果見表1。在測定濃度范圍內(nèi),丹酚酸B的峰面積和濃度具有良好的線性關(guān)系,R2>0.993 5,且定量限(LOQ)>37.55 ng/mL,檢測限(LOD)>8.96 ng/mL。

2.1.3 穩(wěn)定性考察

按照“1.6標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備”節(jié)下方法操作,分別制備高、中、低濃度的組織質(zhì)控樣品,每個濃度平行制備6份樣品。在以下條件下考察高、中、低3個濃度組織樣品的穩(wěn)定性:于20℃下放置12 h;4℃下保存24 h;于-20℃下反復(fù)凍融-冷凍循環(huán)三次。表2中為小鼠不同組織中丹酚酸B的穩(wěn)定性結(jié)果,表明組織勻漿液中丹酚酸B較穩(wěn)定,符合生物樣品的檢測要求。

表1 小鼠不同組織中丹酚酸B的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

表2 小鼠不同組織中丹酚酸B的穩(wěn)定性

2.1.4 精密度和回收率考察

按“1.6”節(jié)下的方法制備高、中、低濃度(為0.05、0.75、5.00 μg/mL)的組織質(zhì)控樣并測定,計算日內(nèi)、日間精密度和回收率。結(jié)果如表3,不同組織的日內(nèi)、日間精密度的RSD值均小于13.05,準(zhǔn)確度范圍為87.40%～113.19%;回收率均大于70%。

表3 小鼠不同組織中丹酚酸B的精密度和回收率

2.2 藥物組織分布的影響

小鼠灌胃給予丹酚酸B后,測定結(jié)果表明,丹酚酸B在腦內(nèi)的含量低于檢測限,僅能通過光譜和質(zhì)譜信息(見圖2)確定有微量的丹酚酸B存在,推測其基本不能透過血腦屏障。此外,并沒有在心臟組織中檢測到丹酚酸B,該結(jié)果與之前的文獻報道相符[19],表明低共熔溶劑對丹酚酸B在心和腦組織的分布沒有顯著影響。

Fig.2 Spectrogram and mass-spectrogram of SAB圖2 丹酚酸B的光譜和質(zhì)譜圖

圖3可見,灌胃給藥后,受試組與對照組在肝組織中丹酚酸B濃度呈現(xiàn)出先增加后降低的特點,且分布和清除速度均較快。給藥5 min后即可在小鼠肝臟檢測到丹酚酸B,給藥2 h后丹酚酸B的含量很低,5 h后基本已經(jīng)清除干凈。但受試組中丹酚酸B的達峰時間在20 min,較對照組提前10 min;且受試組中丹酚酸B在肝臟中的濃度為1.66 μg/g,顯著高于對照組(1.02 μg/g)。由此可見,ChCl-GL(1∶2)對丹酚酸B在肝組織中的分布情況有一定的影響,可以明顯加快丹酚酸B在肝臟的吸收和清除,并且提高丹酚酸B在肝臟的分布,從而可能有利于丹酚酸B對肝臟疾病的治療。

Fig.3 Concentration vs time profiles of SAB in liver after oral administration圖3 給藥后丹酚酸B在小鼠肝組織的藥物濃度與時間的關(guān)系圖

3 結(jié)論

本研究根據(jù)課題組前期對丹酚酸B的血漿藥代動力學(xué)的實驗結(jié)果,選擇在丹酚酸B血藥濃度時間曲線的吸收相、分布相和消除相各選擇幾個時間點;此外,根據(jù)文獻報道,丹酚酸B主要的藥理作用為抗心腦缺血、抗肝纖維化作用等,因此,選取腦、心和肝作為研究組織。

實驗結(jié)果表明,與對照組相比,低共熔溶劑對丹酚酸B在小鼠肝組織中的分布情況產(chǎn)生了一定的影響,具體表現(xiàn)為:丹酚酸B溶解在ChCl-GL(1∶2)后給藥,增加了其在肝組織的分布,并且加快其吸收和消除,起到一定的減毒增效的作用。該結(jié)果與我們前期研究的結(jié)果基本一致,為低共熔溶劑在臨床應(yīng)用及實驗研究提供了一定的參考。

[1] Abbott A P,Capper G,Davies D L,etal.Novel Solvent Properties of Choline Chloride/Urea Mixtures[J].ChemicalCommunications,2003,9:70-71.DOI:10.1039/b210714g.

[2] Abbott A P,Boothby D,Capper G,etal.Deep Eutectic Solvents Formed between Choline Chloride and Carboxylic Acids:Versatile Alternatives to Ionic Liquids[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2004,126:9142-9147.DOI: 10.1021/ja048266j.

[3] Kareem M A,Mjalli F S,Hashim M A,etal.Phosphonium-based Ionic Liquids Analogues and Their Physical Properties[J].JournalofChemicalandEngineeringData,2010,55:4632-4637.DOI: 10.1021/je100104v.

[4] Alonso D A,Baeza A,Chinchilla R,etal.ChemInform Abstract:Deep Eutectic Solvents:The Organic Reaction Medium of the Century[J].EuropeanJournalofOrganicChemistry,2016,47:612-632.DOI:10.1002/ejoc.201501197.

[5] Francisco M,Bruinhorst A V D,Kroon M C.ChemInform Abstract:Low-Transition-Temperature Mixtures (LTTMs):A New Generation of Designer Solvents[J].AngewandteChemie,2013,52:3074-3085.DOI:10.1002/chin.201327237.

[6] Hammond O S,Bowron D T,Edler K J.Liquid Structure of the Choline Chloride-urea Deep Eutectic Solvent (Reline) from Neutron Diffraction and Atomistic Modelling[J].GreenChemistry,2016,18:2736-2744.DOI:10.1039/C5GC02914G.

[7] Tang B,Row K H.Recent Developments in Deep Eutectic Solvents in Chemical Sciences[J].MonatsheftefürChemie-ChemicalMonthly,2013,144:1427-1454.DOI: 10.1007/s00706-013-1050-3.

[8] Espino M,Fernández M D L,Gomez F J V,etal.Natural Designer Solvents for Greening Analytical Chemistry[J].TrendsinAnalyticalChemistry,2016,76:126-136.DOI:10.1016/j.trac.2015.11.006.

[9] Li X,Row K H.Development of Deep Eutectic Solvents Applied in Extraction and Separation[J].JournalofSeparationScience,2016,39:3505-3520.DOI:10.1002/jssc.201600633.

[10] Li Y E,Yuan H E.Pathway-pathway Network-based Study of the Therapeutic Mechanisms by Which Salvianolic acid B Regulates Cardiovascular Diseases[J].科學(xué)通報: 英文版.2012,57(14):1672-1679.DOI:10.1007/s11434-012-5142-y.

[11] Yang T L,Lin F Y,Chen Y H,etal.Salvianolic acid B Inhibits Low-density Lipoprotein Oxidation and Neointimal Hyperplasia in Endothelium-denuded Hypercholesterolaemic Rabbits[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,2011,91:134-141.DOI:10.1002/jsfa.4163.

[12] Zhao G R,Zhang H M,Ye T X,etal.Characterization of the Radical Scavenging and Antioxidant Activities of Danshensu and Salvianolic Acid B.[J].FoodandChemicalToxicology,2008,46:73-81.DOI: 10.1016/j.fct.2007.06.034.

[13] Xu S,Zhong A,Bu X,etal.Salvianolic Acid B Inhibits Platelets-mediated Inflammatory Response in Vascular Endothelial Cells[J].ThrombosisResearch,2015,135:137-145.DOI:10.1016/j.thromres.2014.10.034.

[14] Shu T,Pang M,Rong L,etal.Protective Effects and Mechanisms of Salvianolic Acid B Against H2O2-Induced Injury in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cells[J].NeurochemicalResearch,2015,40:1133-43.DOI:10.1007/s11064-015-1573-6.

[15] Wu W,Wang Y P.Pharmacological Actions and Therapeutic Applications of Salvia Miltiorrhiza depside Salt and Its Active Components[J].中國藥理學(xué)報:英文版,2012,33:1119-1130.DOI:10.1038/aps.2012.126.

[16] Zhang Y J,Wu L,Zhang Q L,etal.Pharmacokinetics of Phenolic Compounds of Danshen Extract in Rat Blood and Brain by Microdialysis Sampling[J].JournalofEthnopharmacology,2011,136:129-136.doi:10.1016/j.jep.2011.04.023.

[17] Qi Q,Hao K,Li F Y,etal.The Identification and Pharmacokinetic Studies of Metabolites of Salvianolic Acid B After Intravenous Administration in Rats[J].ChineseJournalofNaturalMedicines,2013,11:560-565.DOI:10.1016/S1875-5364(13)60101-6.

[18] Chen J,Li S,Yao Z,etal.Improved Stability of Salvianolic Acid B from RadixSalviaemiltiorrhizaein Deep Eutectic Solvents[J].AnalyticalMethods,2016,8:2502-2509.DOI:10.1039/c5ay03351a.

[19] Xu M,Fu G,Qiao X,etal.HPLC Method for Comparative Study on Tissue Distribution in Rat After Oral Administration of Salvianolic Acid B and Phenolic Acids fromSalviaMiltiorrhiza[J].BiomedicalChromatography,2007,21:1052-1063.DOI: 10.1002/bmc.852.

Effect of Deep Eutectic Solvents on the Tissue Distribution of Salvianolic Acid B

CHEN Jue1,2,ZHANG Liwei1*

(1.Institute of Molecular Science,Shanxi University, Taiyuan 030006,China;2.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

To investigate the effect of deep eutectic solvents on the tissue distribution of salvianolic acid B (SAB) in mice,the fasted mice were randomly divided into control group and test group, that were oral administration of SAB dissolved in water and SAB dissolved in choline chloride-glycerol (ChCl-GL, molar ratio 1∶2), respectively. After intragastric administration at the dose of 200 mg/mL of SAB, the main tissues (heart, brain and liver) were collected at different time points.The content of salvianolic acid B was determined by HPLC-MS.The result indicated that the peak time of SAB in liver tissue was at 20 min in test group, which was 10 min shorter than in control group. And the peak concentration of test group was 1.66 μg/g, which was 1.63 times of the control group. Therefore, deep eutectic solvent can increase the distribution of SAB in the liver tissue of mice, and accelerate the absorption and elimination of SAB, which may be play a certain role in reducing toxicity and synergism.

deep eutectic solvents;salvianolic acid B;tissue distribution

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.02.022

2017-02-22；

2017-03-10

2016年山西省研究生教育創(chuàng)新項目(2016BY030)

陳玨(1988-)，女，山西渾源人，博士研究生，研究方向：生藥活性成分與質(zhì)量評價研究，E-mail:juechenyzm@sina.com

*通信作者：張立偉(Liwei Zhang),E-mail:lwzhang@sxu.edu.cn

R966

A

0253-2395(2017)02-0347-06