張歡歡李 牛郁婷婷胥雨菲李國(guó)強(qiáng)王秀敏,3沈亦平,4王 劍,3

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)遺傳科（分子診斷實(shí)驗(yàn)室）（上海 200127）；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科（上海 200336）；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌遺傳代謝科（上海 200127）；4.美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬波士頓兒童醫(yī)院基因診斷實(shí)驗(yàn)室（美國(guó)波士頓 02115）

Cardio-facio-cutaneous綜合征2例報(bào)告并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

張歡歡1,2李 牛1郁婷婷1胥雨菲1李國(guó)強(qiáng)1王秀敏1,3沈亦平1,4王 劍1,3

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)遺傳科（分子診斷實(shí)驗(yàn)室）（上海 200127）；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科（上海 200336）；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌遺傳代謝科（上海 200127）；4.美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬波士頓兒童醫(yī)院基因診斷實(shí)驗(yàn)室（美國(guó)波士頓 02115）

目的探討Cardio-facio-cutaneous綜合征（CFC）的臨床表型及基因變異特征。方法提取2例CFC患兒及其父母外周血DNA，采用靶向基因高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)變異基因，并運(yùn)用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果2例患兒均為漢族女性，分別為13個(gè)月和7歲半，有內(nèi)眥贅皮、鼻梁塌平、頭發(fā)稀疏等相似的顱面部特征，均伴有生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及癲癇發(fā)作史。1例心電圖有T波變化，P-R間期正常高限；另1例心電圖正常。基因檢測(cè)顯示，2例患兒在MAP2K1基因3號(hào)外顯子上各有一處雜合的錯(cuò)義變異，分別為 c.383G＞T,p.Gly128Val 和 c.389A＞G,p.Tyr130Cys，且均為新生突變（de novo），均系文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的CFC變異位點(diǎn)。結(jié)論2例為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道CFC病例，且均為MAP2K1基因突變型。因既往報(bào)道CFC患兒大多合并心臟病變，2例患兒均繼續(xù)隨訪(fǎng)心臟功能。

Cardio-facio-cutaneous綜合征； MAP2K1基因； 靶向基因測(cè)序技術(shù)； 新生突變

Cardio-facio-cutaneous 綜合征（CFC）與 Noonan綜合征 (NS)、Costello 綜合征 (CS)一起被歸類(lèi)為“RAS心肌病群”[1]。該病群臨床表現(xiàn)復(fù)雜，既有很多相似的表型也有各自相對(duì)特異性的表征。該病群患者均可出現(xiàn)不同程度的心臟發(fā)育異常、精神發(fā)育遲滯及身材矮小等臨床特征[1]，CFC與NS患者都可出現(xiàn)上瞼下垂、瞼裂下斜、內(nèi)眥贅皮褶皺、塌鼻梁、鼻孔前傾等顱面特征以及多發(fā)雀斑、毛發(fā)稀疏等皮膚特征[2]。CS患者則表現(xiàn)出更嚴(yán)重的面部畸形，并在嬰兒期有明顯的心律失常[3]，CFC患者在嬰幼兒期即可出現(xiàn)嬰兒痙攣癥或其他類(lèi)型癲癇發(fā)作，這一點(diǎn)不同于NS與CS患者[1]。該病群的各種臨床表現(xiàn)會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)生改變，僅憑表型進(jìn)行診斷十分困難。目前根據(jù)不同情況可選用高通量測(cè)序等[4，5]分子診斷技術(shù)，結(jié)合臨床表現(xiàn)和基因檢測(cè)結(jié)果來(lái)確診CFC及其他RAS心肌病。本文報(bào)道2例有特殊顱面特征及癲癇發(fā)作史的患兒，分別運(yùn)用靶向基因高通量測(cè)序方法進(jìn)行測(cè)序分析明確診斷。

圖1 患兒面部特征圖

1 臨床資料

例1，女，13個(gè)月，漢族。因驚厥間斷發(fā)作3 d至上海兒童醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)內(nèi)科就診。就診過(guò)程中驚厥發(fā)作，呈雙上肢屈曲強(qiáng)直，右下肢強(qiáng)直，眼睛眨動(dòng)，伴哭鬧，持續(xù)約2 min左右，發(fā)作后疲軟無(wú)力，易入睡。患兒無(wú)發(fā)熱，無(wú)咳嗽流涕?；純合礕2P2，有宮內(nèi)窘迫史，有臍帶扭轉(zhuǎn)史，36周早產(chǎn)，產(chǎn)時(shí)有窒息，出生體質(zhì)量3.75 kg。母乳喂養(yǎng)，按時(shí)按序添加輔食。生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，不能坐起，不會(huì)翻身，不會(huì)爬，不能抬頭，不會(huì)叫喊父母；既往有屏氣發(fā)作病史。父母體健，否認(rèn)近親結(jié)婚，否認(rèn)遺傳病史。體格檢查：體質(zhì)量7.4 kg，身高75 cm；內(nèi)眥贅皮，眼距稍寬，鼻梁塌平，面色蒼白，頭發(fā)稀疏（圖1）；四肢末梢偏涼，稍蒼白；心率106次/ min，律齊，無(wú)雜音，雙側(cè)呼吸音清，未及啰音。外院頭顱MRI提示腦白質(zhì)發(fā)育不良；心電圖示T波變化，P-R間期正常高限。初步診斷為繼發(fā)性癲癇。

例2，女，7歲半，漢族，因生長(zhǎng)發(fā)育遲緩至上海兒童醫(yī)學(xué)中心遺傳門(mén)診就診?；純合礕1P1，足月順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.1 kg，身高46 cm，出生時(shí)Apgar評(píng)分1分鐘9分，5分鐘9分。出生時(shí)因反復(fù)上肢抖動(dòng)被診斷為“高酮戊二酸血癥、HIE伴左側(cè)腦室出血”。出院后偶有抽搐發(fā)作，曾口服抗癲癇藥物治療2年，4歲以后抽搐未再發(fā)作。曾于3歲2個(gè)月查腦電圖為異常腦電圖、腦電地形圖。父母非近親結(jié)婚，否認(rèn)家族史?；純哼\(yùn)動(dòng)發(fā)育滯后，說(shuō)話(huà)少，5個(gè)月抬頭，3歲多可獨(dú)走，可有意識(shí)叫喊父母。體格檢查：體質(zhì)量13 kg，身高105 cm；眼距稍寬，鼻梁塌平，鼻孔朝前，外側(cè)眼角偏下，口唇稍干燥，面部皮膚局部粗糙，牙齒排列不齊、大小不一，上頜前正中方向牙齒較短，頭發(fā)稀疏（圖1）；呼吸平穩(wěn)，心率100次/min，律齊，未聞及明顯雜音；肌力可，精神運(yùn)動(dòng)較差。

經(jīng)醫(yī)院倫理審核及父母知情同意后，采集患兒及父母外周血各2 mL，置含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝試管充分混勻。取200 μL全血，使用德國(guó)Qiagen公司QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取基因組DNA，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)所提DNA濃度及比值（OD260/280比值在1.8～2.0之間）。取患兒基因組DNA 3 μg，經(jīng)美國(guó)Covaris?公司M220打斷儀處理后得到150～200 bp的DNA片段，使用Agilent SureSelect XT 試劑盒制備測(cè)序文庫(kù)，捕獲探針為Agilent Inherited Disease panel（包括2 742個(gè)基因，目標(biāo)區(qū)域約為12 Mbp）。使用美國(guó)Illumina公司HiSeq 2500 System進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina Sequence Control Software（SCS）評(píng)估合格后，使用NextGENe?軟件（美國(guó)SoftGenetics公司）讀取數(shù)據(jù)，上傳到Ingenuity?Variant Analysis? 軟件（美國(guó)Ingenuity Systems公司）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

Sanger 測(cè)序驗(yàn)證候選基因 MAP2K1變異：采用 UCSC 在線(xiàn)軟件（http://genome.ucsc.edu/index. html）設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增MAP2K1（GenBank序列號(hào)：NM_002755.3）基因序列的引物。針對(duì)3號(hào)外顯子變異位點(diǎn)的引物序列：正向引物（E 3 F）5’-GCCAATGCCTGCCTTAGTAC -3’，反向引物（E3R）5’-TTAGACTTCCCAGATGCCCC-3’。分別取2例患兒及其父母的基因組DNA 20 ng進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后使用ABI3730測(cè)序儀上機(jī)測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)采用MutationSurveyor?軟件（美國(guó)SoftGenetics公司）進(jìn)行分析。

2例患兒及其父母的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)首先經(jīng) Next Gene?軟件分析單核苷酸變異（SNVs），并比對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期已積累的對(duì)照測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。最終結(jié)果顯示：例1的15號(hào)染色體上q22.31區(qū)域MAP2K1基因發(fā)生雜合錯(cuò)義突變c.383G＞T，使128位密碼子由GGC變?yōu)镚TC，甘氨酸替換為纈氨酸，即p.Gly128Val，人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（HGMD）上將其列為致病性突變；例2的15號(hào)染色體上q22.31區(qū)域MAP2K1基因發(fā)生雜合錯(cuò)義突變c.389A＞G，使130位密碼子由TAT變?yōu)門(mén)GT，酪氨酸替換為半胱氨酸，即p.Tyr130Cys，HGMD上將其列為致病性突變；未發(fā)現(xiàn)其他與2例患兒臨床癥狀相關(guān)的可疑或致病性 SNVs。進(jìn)一步Sanger測(cè)序結(jié)果表明：2例患兒各自父母在MAP2K1基因3號(hào)外顯子上相應(yīng)位點(diǎn)均為野生型，2例患兒在該基因上分別產(chǎn)生的突變c.383G＞T 及 c.389A＞G均為新生突變（de novo）。見(jiàn)圖2。

圖2 Sanger 法測(cè)序結(jié)果

2 討論

CFC 是一種極罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病，完全外顯，最早由Reynolds等[6]于1986年報(bào)道。目前CFC在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率不詳，日本約為1/810 000[7]。CFC患兒通常伴有特征性異常面容，如相對(duì)大頭畸形、額頭高大、雙顳側(cè)變窄、下巴小，上瞼下垂、瞼裂下斜、內(nèi)眥贅皮褶皺，鼻子基底部過(guò)寬、球狀鼻頭、鼻孔前傾，嘴大、人中溝深，耳朵低垂、后翻等；可合并出現(xiàn)咬合不良、高唇系帶、高顎弓等牙齒表型及斜視、屈光不正、眼球震顫、視神經(jīng)發(fā)育不全等眼科癥狀；同時(shí)還可出現(xiàn)肺動(dòng)脈瓣狹窄、肥厚性心肌病、房間隔缺損、室間隔缺損等不同種類(lèi)的心血管疾病及多發(fā)的色素痣、皮膚過(guò)度角化、黑棘皮病等不同程度的皮膚病變[8,9]。除顱面、心臟、皮膚的異常改變外，CFC患兒還普遍存在生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和智能障礙，出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)異常且嚴(yán)重程度不一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約40%～50%的CFC患兒有各種各樣的癲癇癥狀[10]，癲癇類(lèi)型包括混合型、全身強(qiáng)直-陣攣型、失神發(fā)作/嬰兒痙攣癥。部分CFC患者還可發(fā)生腎臟/泌尿生殖系統(tǒng)病變，也有少數(shù)CFC患者可伴發(fā)腫瘤[8,11]。

CFC主要有4種基因突變型，分別為BRAF、MAP2K1、MAP2K2和KRAS[8,12]。其發(fā)病機(jī)制為基因突變導(dǎo)致Ras/Raf/MAPK信號(hào)通路持續(xù)活化[13]，干擾細(xì)胞的增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、凋亡及衰老的正常過(guò)程，從而引起患者心臟缺陷、面容改變、外胚層異常。由于Ras/Raf/MAPK 通路在胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1）的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中也起有重要作用，而IGF-1可以介導(dǎo)生長(zhǎng)激素（GH）的生長(zhǎng)效應(yīng)；同時(shí)MAPK的激活在調(diào)節(jié)垂體生長(zhǎng)激素的合成和釋放過(guò)程有重要作用，這些因素共同作用會(huì)導(dǎo)致患兒出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢及身材矮小。

目前研究顯示，CFC患者的4種基因突變型別中近75%為BRAF雜合基因突變，近25%為MAP2K1和MAP2K2雜合基因突變，約2%～3%為KRAS雜合基因突變[8,12-15]。MAP2K1和MAP2K2是一對(duì)異構(gòu)體，兩者均為蘇氨酸/酪氨酸激酶，具有磷酸化激活ERK1、ERK2的功能，構(gòu)成MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)。MAP2K1激活ERK1/2后，活化的ERK1/2可以入核激活cJun、cMyc、Elk1、PPc-fos、c-Jun、Elk-1、c-myc和ATF2等多種核轉(zhuǎn)錄因子和核蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的殖和分化，ERK1/2還可磷酸化胞漿內(nèi)的細(xì)胞骨架成份，如微管相關(guān)蛋白MAP-1、MAP-2和MAP-4，參與細(xì)胞形態(tài)的調(diào)節(jié)及細(xì)胞骨架的重分布。基因突變可以引起MAP2K1活性增加，保持MAPK通路的持續(xù)活化狀態(tài)，引起細(xì)胞異常增殖及凋亡障礙，從而產(chǎn)生一系列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)。MAP2K1基因定位于人類(lèi)15號(hào)染色體長(zhǎng)臂上（15q22.1-q22.33），基因全長(zhǎng)104 kb，包含11個(gè)外顯子。據(jù) HGMD 統(tǒng)計(jì)，目前在人類(lèi)MAP2K1基因中發(fā)現(xiàn)了14種不同的突變形式，幾乎都是以錯(cuò)義突變的形式存在，突變發(fā)生區(qū)域集中在第2、3、6外顯子區(qū)域。

本文2例患兒均在MAP2K1基因3號(hào)外顯子區(qū)域發(fā)生新生雜合突變，其中例2 MAP2K1基因上的新生雜合錯(cuò)義突變c.389A＞G是目前明確的致病突變，也是MAP2K1基因上最常見(jiàn)的錯(cuò)義突變，早在2006年Rodriguez-Viciana等[12]在Science上就報(bào)道過(guò)此位點(diǎn)變異的CFC病例。例1 MAP2K1基因上的新生雜合錯(cuò)義突變c.383G＞T目前被列為可疑致病/致?。╨ikely pathogenic/ pathogenic）突變，已有文獻(xiàn)報(bào)道其可引起CFC綜合征[16]。根據(jù)患兒的臨床表型，結(jié)合分子診斷資料，本文2例患兒均被診斷為 CFC綜合征。此為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道的CFC病例，也是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道的MAP2K1基因突變的CFC病例。

本文中2例患兒被確診時(shí)分別是13個(gè)月和7歲半，年齡差距較大，表型上有一些相似的地方，如特征性面容、皮膚毛發(fā)異常、生長(zhǎng)發(fā)育滯后、智力落后、癲癇發(fā)作等，與已有的報(bào)道相符。例1的心電圖提示T波變化和P-R間期正常高限，未發(fā)現(xiàn)其他心臟相關(guān)指標(biāo)異常；例2尚未觀測(cè)到心臟結(jié)構(gòu)功能改變?，F(xiàn)有的 CFC基因型和表型關(guān)聯(lián)研究資料表明，MAP2K1基因型CFC患兒先天性心臟病發(fā)生率（62%）略低于BRAF基因型（74%）[8,14,15]。對(duì)于CFC患兒心臟病的自然病史及其伴發(fā)肥厚性心肌病的年齡進(jìn)展規(guī)律目前還不明確，因此有待于對(duì)2例患兒進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪(fǎng)，定期評(píng)估其心臟功能。

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The clinical feature and gene analysis of Cardio-facio-cutaneous syndrome in children: a report of 2 cases and literature review

ZHANG Huanhuan1,2, LI Niu1, YU Tingting1, XU Yufei1, LI Guoqiang1, WANG Xiumin1,3, SHEN Yiping1,4, WANG Jian1,3
(1. Department of Medical Genetics (Molecular Diagnostic Laboratory), Shanghai Children's Medical Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200127, China; 2. Department of Clinical Laboratory, Tongren Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200336, China; 3. Department of Endocrine and Genetic Metabolic, Shanghai Children's Medical Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200127, China; 4. Department of Gene Diagnostic Laboratory, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, 02115, USA)

ObjectiveTo explore the clinical phenotype and gene variation features of Cardio-facio-cutaneous syndrome (CFC).MethodDNA were extracted from peripheral blood in 2 children with CFC and their parents, and the mutation gene were detected by high throughput sequencing of target gene and veri fi ed by Sanger sequencing.ResultsTwo patients were Han nationality females and aged 13 months and 7.5years respectively. Both of them showed craniofacial features of epicanthus, fl at nose and scant hair, and had history of growth retardation and epileptic seizure. The electrocardiogram in one case showed that there was a change in T wave and P-R interval reached the normal high limit. The electrocardiogram in the other case was normal. Genetic detection revealed that there were two heterozygous missense mutation in the third exon of MAP2K1, c.383G＞T, p.Gly128Val and c.389A＞G, p.Tyr130Cys, which were new mutations (de novo) and CFC mutation sites reported in the literature.ConclusionThe two cases of CFC were fi rst reported in China and both had MAP2K1 mutations. The children with CFC were reported to be mostly complicated with heart disease, thus these 2 patients should be followed up for cardiac function.

cardio-facio-cutaneous syndrome; MAP2K1 gene; targeted gene sequencing; de novo mutation

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.04.011

2016-10-18)

(本文編輯：蔡虹蔚)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81472051）；上海市科委國(guó)際合作項(xiàng)目 （No.15410722800）；上海市教委高峰計(jì)劃項(xiàng)目（No.20152529）

王劍 電子信箱：wangjian@scmc.com.cn