張立麗，侯玉麗，趙艷明，黃雁翔，于艷華，婁金麗，趙艷(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院臨檢中心，北京 100069)

·臨床檢驗技術(shù)研究·

HCV RNA陽性標本PCR-熒光探針法病毒亞型未檢出原因分析*

張立麗，侯玉麗，趙艷明，黃雁翔，于艷華，婁金麗，趙艷
(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院臨檢中心，北京 100069)

目的 探討血清HCV RNA陽性，但PCR-熒光探針法病毒亞型檢測未檢出的原因。方法 收集2015年7月至2016年3月北京佑安醫(yī)院臨檢中心分子室病毒載量>1 000 IU/mL但未測出病毒亞型的標本55例，采用基因測序方法對病毒擴增產(chǎn)物進行分型分析。結(jié)果 55例HCV病毒載量>1 000 IU/mL，但HCV病毒亞型未檢出的標本中，其中3例為病毒載量接近病毒亞型檢測下限，經(jīng)測序分析為1b型2例，2a型1例；5例為檢測試劑盒未覆蓋亞型并且其探針位置無突變，HCV 1a型4例，6n型1例，占9.1%(5/55)；47例因探針序列位置基因突變導(dǎo)致病毒亞型未檢出，占85.5%(47/55)，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)其中1a型6例(6/47，12.8%)，1b型32例(32/47，68.1%)，2a型3例(3/47，6.4%)，2b型1例(1/47,2.1%)，3b型 1例(1/47,2.1%)，6a型2例(2/47,4.3%)，1b、6q、6c混合型1例(1/47,2.1%)，6n型1例(1/47,2.1%)。探針序列位置基因突變組中以HCV病毒5′非翻譯區(qū)(5′ UTR) 204 C/T突變?yōu)橹?31/47, 66.0 %)，其次為5′UTR 168 C/A突變(5/47, 10.6%)。結(jié)論 病毒載量低、試劑盒覆蓋的病毒亞型有限、探針對應(yīng)的序列存在變異均會影響PCR-熒光探針法檢測HCV基因型，其中探針序列變異是病毒亞型未測出的主要原因。

丙型肝炎病毒；病毒基因型；病毒變異；病毒載量

HCV是一種有很高變異率的不均質(zhì)病毒株，復(fù)制過程中所依賴的RNA多聚酶具有錯配傾向[1]。不同的HCV基因型其致病毒力、預(yù)后及其抗病毒難度治療的反應(yīng)性方面都有差異，因此檢測HCV基因型對臨床的治療方案選擇、預(yù)后評估具有重要意義[2]?，F(xiàn)有的HCV基因型檢測試劑盒主要選取HCV的保守區(qū)域設(shè)計相應(yīng)的特異性引物和探針，但臨床存在HCV RNA陽性，基因分型未檢測出的現(xiàn)象，給臨床診斷和治療帶來極大困擾。針對該現(xiàn)象，我們總結(jié)分析HCV病毒載量陽性，但基因型不能分辨現(xiàn)象的原因及該部分患者的臨床特征。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2015年7月至2016年3月北京佑安醫(yī)院臨檢中心分子室HCV病毒載量>1 000 IU/mL，但PCR-熒光探針法未測出病毒亞型的標本55例；隨機選取同時期HCV病毒載量>1 000 IU/mL，且PCR-熒光探針法病毒分型為1b 亞型的標本50例作為對照組。所有患者HCV感染診斷均符合2011年版《慢性丙型肝炎防治指南》。研究組及對照組均未進行抗病毒治療。

1.2 標本采集 抽取待檢者清晨空腹靜脈血2 mL，室溫放置1 h，500×g離心分離血清后于-20 ℃保存。

1.3 試劑與儀器 磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒、PCR-熒光探針法HCV核酸檢測試劑盒(湖南圣湘公司)；ABI 7500熒光PCR儀(美國ABI公司)；HCV基因分型檢測試劑盒(PCR-熒光探針法，中國泰普生物科學(xué)公司)。

1.4 HCV病毒載量檢測 用磁珠法提取HCV RNA，在ABI 7500熒光PCR儀上用PCR-熒光探針法定量檢測HCV核酸，按照試劑說明書進行操作。

1.5 HCV基因分型檢測 用PCR-熒光探針法進行HCV基因分型，試劑盒覆蓋的亞型為1b、2a、3a、3b、6a，按試劑盒要求進行操作。HCV各亞型的RNA最低檢出量均為1 000 IU/mL。

1.6 未分型標本測序分析 用Sanger 測序，由中國泰普生物科學(xué)公司協(xié)助完成。在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站進行序列比對。

1.7 肝功能相關(guān)生化項目檢測 用Olympus AU5400全自動生物化學(xué)分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等指標。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果分析 55例熒光探針法未分型標本中，經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)HCV 1a型4例，6n型1例，系檢測試劑盒未覆蓋亞型，占未分型病例的9.1%(5/55)；47例因探針序列位置基因突變導(dǎo)致病毒亞型未檢出，占85.5%(47/55)；3例病毒載量分別為1 100、1 008、1 064 IU/mL，因接近病毒亞型檢測下限而未能分型，經(jīng)測序分析為1b型2例，2a型1例。病毒載量大于1 000 IU/mL、因探針序列位置基因發(fā)生變異而導(dǎo)致病毒亞型未測出的47例標本中，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)其中1a型6例(6/47，12.8%)，1b型32例(32/47，68.1%)，2a型3例(3/47，6.4%)，2b型1例(1/47，2.1%)，3b型 1例(1/47，2.1%)，6a型2例(2/47，4.3%)，1b、6q、6c混合型1例(1/47，2.1%)，6n型1例(1/47，2.1%)

2.2 HCV探針序列位置基因變異情況分析 47例突變組中以HCV病毒5′非翻譯區(qū)(5′-untranslated region,5′-UTR) 204 C/T突變?yōu)橹?31/47, 66.0%)，其次為5′UTR168 C/A(5/47, 10.6%)、5′UTR 214 A/T(2/47, 4.3%)、5′UTR 214 A/C(2/47, 4.3%)、 5′UTR 168 C/G(2/47, 4.3%)、5′UTR 214 A/C (1/47, 2.1%)、5′UTR 212 TC/GT(1/47, 2.1%)、84 T/G(1/47, 2.1%)、5′UTR 216 T/C(1/47,2.1%)及5′UTR 220 T/G(1/47, 2.1%)。

2.3 HCV 1b基因突變型的臨床特征 1b型5′UTR變異組32例與1b型無變異的52例(其中正常檢出無變異50例，檢出失敗但非變異2例)患者ALT、AST水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但HCV 1b亞型5′UTR變異組、非變異組病毒載量(IU/mL)的lg值分別為5.7±1.3、6.6±0.5，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)。見表1。

表1 1b亞型5′UTR變異組與非變異組患者一般情況比較

3 討論

HCV基因組為正鏈RNA，全長約9 600 bp，含有單一開放閱讀框(open reading frame, ORF)，編碼3 000多個氨基酸組成的多聚蛋白前體。HCV目前分為1～7個基因型和若干個亞型，我國HCV基因亞型以1b型最為常見(56．8%)，其次為2型(24.1%)、3型(9.1%)與6型(6.3%)[3]，上述基因型在我們使用的試劑盒中均可檢測。

已有研究表明，不同的HCV基因型對以干擾素為基礎(chǔ)的治療表現(xiàn)出不同的免疫應(yīng)答反應(yīng)。與基因型2、3、5和6相比，基因型1和4對基于干擾素的聯(lián)合治療敏感性較低，基因型1和4對標準的干擾素治療耐受時間為48周，而2型和3型的耐受時間只有24周[4]。1型對干擾素治療的持續(xù)應(yīng)答率為70%，2型和3型的持續(xù)應(yīng)答率可達到90%，4型的持續(xù)應(yīng)答率僅有65%，而6型的持續(xù)應(yīng)答率可達80%[5-6]。因此，HCV基因型在臨床上常作為藥物療效的預(yù)測指標。另外，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)HCV 1b亞型與丙型肝炎的進展及發(fā)展成肝細胞癌具有密切關(guān)系[7]，因此HCV基因型還可用來預(yù)測疾病進程和肝臟病變的嚴重程度，以提高丙型肝炎診斷的準確率。

HCV基因組的5′UTR共有341個核苷酸序列，在HCV基因組中最為保守，該區(qū)域包含一段必需順式作用元件和一段序列更為保守的內(nèi)源性核糖體進入位點(IRES)。IRES上游序列對病毒復(fù)制是必需的，而IRES的部分莖環(huán)結(jié)構(gòu)在病毒蛋白的翻譯過程中起著重要作用[8]。5′UTR是HCV中高度保守的序列，具有雙重功能：一是含有IRES，可以指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成；二是在負鏈中提供順式作用復(fù)制元件(Cis-acting replication elements，CREs)指導(dǎo)子代正鏈的合成[9-10]。在本研究中，所用試劑盒是基于5′UTR序列進行HCV分型，這也是當前檢測HCV基因型的主要方式。

目前，HCV基因分型方法包括血清學(xué)分型、特異性探針雜交法、特異性引物擴增法、DNA免疫酶分析法、限制性片段長度多態(tài)性分析法和核酸測序及同源性比較法[11]，其中核苷酸同源性分型法最為準確可靠。臨床檢測中發(fā)現(xiàn)HCV RNA陽性，而基因型未測出的情況，分析其原因有以下幾種：(1)病毒載量低，影響病毒亞型的檢測；(2)試劑盒覆蓋的病毒亞型有限，不在試劑盒檢測范圍內(nèi)；(3)探針對應(yīng)的序列存在變異。本研究中探針對應(yīng)序列變異情況占未分型病例的85.5%(47/55)，其中的1a和6n型屬于本試劑盒未覆蓋的亞型，具有試劑盒的局限性，而探針位點各種試劑盒通用，因此將其歸為探針突變型，更具有廣泛性?？梢钥闯觯琑NA陽性、熒光探針法病毒亞型未測出的主要原因是由于探針對應(yīng)序列的變異。

本研究結(jié)果顯示，病毒載量陽性因基因變異導(dǎo)致病毒未分型病例中仍以1b 亞型為主要的HCV基因型，其次為1a型。此外，HCV基因型突變中不同亞型所占比例在不同區(qū)域中有一定差異[12]。在1b基因型突變組中，由于病毒突變所付出的適應(yīng)性代價(即病毒為了逃避機體免疫功能所付出的代價)導(dǎo)致HCV載量相對無突變組較低，這個結(jié)果與其他學(xué)者報道的結(jié)果一致[13]。

總之，臨床檢驗中會出現(xiàn)HCV RNA 陽性、病毒亞型未能測出的現(xiàn)象，其中特異性探針對應(yīng)序列出現(xiàn)變異，影響探針結(jié)合是其主要原因，這部分患者在北京地區(qū)以1b 亞型為多見，并且病毒載量較非變異患者有減低的趨勢。針對這一問題，有研究指出聯(lián)合HCV多區(qū)段例如將非結(jié)構(gòu)蛋白5B區(qū)和core區(qū)與現(xiàn)常用的5′UTR相結(jié)合，能提高檢測HCV基因型的準確性及靈敏度[14]。

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(本文編輯：劉群)

北京市醫(yī)管局“揚帆計劃”重點專業(yè)項目(ZYLX201711)；北京市豐臺區(qū)科技項目(BJYAH2015YN15)。

張立麗，1977年生，女，副主任技師，碩士，研究方向為微生物學(xué)及分子診斷學(xué)；侯玉麗，1992年生，女，碩士研究生，研究方向為傳染性疾病的早期診斷。兩位對本文貢獻等同，共為第一作者。

趙艷，研究員，E-mail：18911380390@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.08

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2017-02-23)