金菲，文怡，許雨喬，梅亞寧，夏文穎，王玨，倪芳(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部，南京 210029)

·微生物生物膜·

甜菜堿對金黃色葡萄球菌生物膜形成抑制與分散的作用*

金菲，文怡，許雨喬，梅亞寧，夏文穎，王玨，倪芳
(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部，南京 210029)

目的 研究金黃色葡萄球菌生物膜形成及甜菜堿對其抑制與分散的作用。方法 采用結(jié)晶紫染色法分別測定終濃度為1.0 g/L的甜菜堿對20株金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制能力和甜菜堿對金黃色葡萄球菌生物膜的分散能力。結(jié)果 20株金黃色葡萄球菌均能形成生物膜，其中甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)培養(yǎng)24 h時形成生物膜吸光度值(A590 nm)達(dá)峰值，為1.99±0.53；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)培養(yǎng)48 h時形成生物膜A590 nm達(dá)峰值，為1.13±0.47。加入甜菜堿共培養(yǎng)后，MSSA培養(yǎng)24 h后生物膜A590 nm為1.74±0.61，MRSA培養(yǎng)48 h后生物膜A590 nm為0.40±0.12，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.43和5.84，P均<0.05)。當(dāng)生物膜形成后加入甜菜堿，與對照組相比，MSSA和MRSA的生物膜A590 nm差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 1.0 g/L甜菜堿對金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有良好的抑制作用，但不能分散已經(jīng)形成的生物膜。

金黃色葡萄球菌；生物膜；甜菜堿

細(xì)菌生物膜(biofilm)是細(xì)菌為了適應(yīng)生存環(huán)境而粘附在生物體或者非生物體表面，自身分泌細(xì)胞外基質(zhì)，將細(xì)菌群包裹在內(nèi)而形成，是區(qū)別于游離細(xì)菌的另一種常見生存模式。在自然條件下，生物膜形態(tài)占99%，人類感染疾病65%涉及細(xì)菌生物膜[1]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)常以生物膜形式致病，使患者發(fā)生慢性持續(xù)性感染[2]。甜菜堿(betaine)是一種季銨型水溶性生物堿，為無色或微棕色結(jié)晶的化合物，已被廣泛應(yīng)用于畜牧、醫(yī)藥、農(nóng)林、食品和日化等領(lǐng)域，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域，人們相繼發(fā)現(xiàn)甜菜堿具有許多優(yōu)良的藥理作用，但對細(xì)菌生物膜的抑制和分散作用未見報道。本文就甜菜堿在體外對金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制和分散作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 19株臨床分離的金黃色葡萄球菌均來自我院2016年5月至6月住院患者血培養(yǎng)標(biāo)本，用Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)對其鑒定。其中，10株為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus, MSSA)，9株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)。MRSA判定采用CLSI推薦方法[3]。另有1株金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25923。

1.2 主要試劑與儀器 結(jié)晶紫溶液：結(jié)晶紫飽和液(結(jié)晶紫2 g溶于100 mL 95%乙醇)20 mL+10 g/L草酸銨溶液(草酸銨10 g加溫溶解于1 L蒸餾水)80 mL，混勻后用中速濾紙過濾后置于棕色瓶中備用。96%甜菜堿(南京明生醫(yī)藥技術(shù)有限公司)，無菌生理鹽水稀釋實(shí)驗(yàn)終濃度為1.0 g/L；Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)、DESICHECK比濁儀(法國生物梅里埃公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國 Corning/Coster公司)；全自動恒溫震蕩儀SHA-B(金壇市國華儀器廠)；Thermo 自動酶聯(lián)儀(美國Thermo公司)。

1.3 金黃色葡萄球菌生物膜模型建立 挑取金黃色葡萄球菌單個菌落于4 mL LB培養(yǎng)基中，35 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?。用LB培養(yǎng)液1∶100稀釋上述菌懸液后，取100 μL加入96孔板中，再加100 μL LB培養(yǎng)液，以不加菌液的200 μL LB 培養(yǎng)液作空白對照，35 ℃靜置培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后分別檢測生物膜。所有檢測孔均設(shè)置3孔。

1.4 金黃色葡萄球菌生物膜成膜能力檢測 采用結(jié)晶紫染色法，參照文獻(xiàn)[4-5]進(jìn)行。待生物膜形成之后，吸去96孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，加200 μL結(jié)晶紫溶液染色15 min，棄去染色液并用PBS沖洗3次洗去浮游細(xì)菌，待干后加200 μL 95%乙醇以溶解與細(xì)菌結(jié)合的結(jié)晶紫，用酶聯(lián)儀測590 nm處吸光度(A590 nm)值。以空白對照孔平均吸光度值+3倍空白對照孔的標(biāo)準(zhǔn)差作為cut off值(Ac)。若實(shí)驗(yàn)組的A590 nm≤Ac，則成膜能力陰性；若A590 nm>Ac，則成膜能力陽性。

1.5 金黃色葡萄球菌生物膜抑制試驗(yàn) 0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏慕瘘S色葡萄球菌菌懸液制備同1.3操作，用LB培養(yǎng)液1∶100稀釋后每孔加100 μL，設(shè)3個復(fù)孔，同時每孔加2.0 g/L甜菜堿100 μL，以LB 培養(yǎng)液作空白對照，35 ℃靜置培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，采用結(jié)晶紫染色法檢測細(xì)菌生物膜A590 nm。

1.6 金黃色葡萄球菌生物膜分散試驗(yàn) 0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏慕瘘S色葡萄球菌菌懸液制備同1.3操作，用LB培養(yǎng)液1∶100稀釋后每孔加100 μL，設(shè)3個復(fù)孔，以LB 培養(yǎng)液作空白對照，35 ℃靜置培養(yǎng)24 h后(MRSA組靜置48 h)，用PBS 清洗3 遍以去除浮游菌后每孔加1.0 g/L甜菜堿100 μL，35 ℃靜置培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，采用結(jié)晶紫染色法檢測細(xì)菌生物膜A590 nm。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個復(fù)孔取平均值，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對照組與抑制組、分散組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌成膜能力 19株金黃色葡萄球菌臨床菌株和1株標(biāo)準(zhǔn)菌株均形成生物膜，但MSSA和MRSA成膜時間有差別。MSSA培養(yǎng)24 h時生物膜吸光度A590 nm值即達(dá)峰值，為1.90±0.53；48 h和72 h時分別為1.54±0.74、1.44±0.32。MRSA成膜時間較長，24 h時A590 nm值為0.41±0.11；48 h時吸光度A590 nm為1.13±0.47，達(dá)峰值；72 h時降為1.04±0.83。

2.2 甜菜堿對金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用 在形成生物膜的過程中同時加入甜菜堿，MSSA組作用24 h、48 h和72 h時A590 nm值與對照組比較均顯著性降低(t分別為2.43、4.03和3.34，P均<0.05)；MRSA組在48 h、72 h時A590 nm值與對照組比較也顯著性降低(t分別為5.84和2.78，P均<0.05)。見表1。

表1 甜菜堿對MSSA、MRSA組生物膜形成(A590 nm)的作用

注：*，與對照組相比，P<0.05。

2.3 甜菜堿對金黃色葡萄球菌生物膜分散的作用 在形成生物膜后加入甜菜堿， MSSA組24 h、48 h和72 hA590 nm值與對照組24 h比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MRSA組因在48 h形成生物膜峰值，故將甜菜堿24 h、48 h和72 h后與對照組48 h比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

金黃色葡萄球菌是臨床常見的致病菌，據(jù)醫(yī)院感染監(jiān)控網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，金葡菌在導(dǎo)致醫(yī)院感染的革蘭陽性菌中占第一位[6]。其中MRSA是臨床抗感染治療中比較棘手的多重耐藥菌之一。即使是不攜帶耐藥基因的金黃色葡萄球菌一旦形成生物膜，抗菌藥物治療效果也會大幅下降。本研究結(jié)果揭示，實(shí)驗(yàn)選取的19株臨床菌株均形成生物膜，MSSA 24 h即形成生物膜，而MRSA稍慢，48 h生物膜形成達(dá)峰值。國外有研究認(rèn)為，MRSA與MSSA生物膜形成機(jī)制不同， 胞間黏附素(intercellar adhesion, ica)依賴途徑在MSSA生物膜形成中起重要作用，而MRSA生物膜形成主要由ica非依賴途徑介導(dǎo)[7-8]。目前研究人員還不能明確MSSA和MRSA形成生物膜能力不同的原因。MSSA與MRSA在生物膜形成達(dá)峰值后，吸光度開始下降，這與其他研究一致[9],生物膜形成后由于深層的細(xì)菌很難獲得養(yǎng)分和氧氣，代謝產(chǎn)物難以排出而堆積，細(xì)菌進(jìn)入衰減期。

甜菜堿是在甜菜中含量最多的生物堿，具有保肝護(hù)腎、抑瘤抗癌、降壓鎮(zhèn)靜、解熱鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[10-11]。目前已有甜菜堿具有抑菌活性的報道[12]，其作用機(jī)制為帶正電荷的N+吸附在表面帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面形成靜電鍵，這種靜電作用會使細(xì)胞壁的壓力增大，然后長鏈烷基刺入細(xì)菌的細(xì)胞膜，使細(xì)菌的內(nèi)容物外泄，同時還能使細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)變性，降低蛋白質(zhì)通道活性[13]。本研究通過甜菜堿對金黃色葡萄球菌生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對于MSSA，加入1.0 g/L甜菜堿作用24 h就能有效抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，MRSA加甜菜堿后48 h也有效抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)對已形成生物膜的MSSA和MRSA，0.1%甜菜堿均無法分散其生物膜。文獻(xiàn)報道，中藥對生物膜破壞作用呈劑量依賴性[9]，本實(shí)驗(yàn)所用甜菜堿濃度為1.0 g/L，分析原因，可能甜菜堿分散生物膜也依賴一定濃度與劑量，是否與1.0 g/L甜菜堿沒有達(dá)到破壞金黃色葡萄球菌生物膜的濃度有關(guān)，后續(xù)將進(jìn)一步研究不同濃度甜菜堿對金黃色葡萄球菌生物膜的分散作用。

本研究證實(shí)甜菜堿可以抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成，給臨床感染治療帶來更多選擇。但這些都只是基于體外研究，在體內(nèi)情況如何及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：劉群)

Inhibitory and dispersive effects of betaine on formation ofStaphylococcusaureusbiofilm

JINFei,WENYi,XUYu-qiao,MEIYa-ning,XIAWen-ying,WANGJue,NIFang
(DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalMedicalUniversity,Nanjing210029,Jiangsu,China)

Objective To observe the formation ofStaphylococcusaureusbiofilm and the inhibitory and dispersive effects of betaine on the biofilm. Methods The inhibitory and dispersive effects of 0.1% betaine on the biofilm from 20 strains ofStaphylococcusaureuswere examined by crystal violet assay. Results All the 20 strains ofStaphylococcusaureusformed biofilm. The biofilm of methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus(MSSA) was formed in 24 hours with peak value of absorbance(A590 nm)(1.99±0.53). The biofilm of methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) was formed in 48 hours with peak value of absorbance(A590 nm)(1.13±0.47). After adding betaine, the absorbance(A590 nm) of MSSA biofilm fell down to(1.74±0.61) in 24 hours, while the absorbance(A590 nm) of MRSA biofilm fell down to(0.40±0.12) in 48 hours, which was significantly reduced compared with the controls(t=2.43, 5.84,P<0.05 respectively). When adding betaine after the biofilm formed, the absorbancies(A590 nm) of both MSSA and MRSA showed no significant difference compared with the controls(P>0.05). Conclusion Betaine could inhibit biofilm formation ofStaphylococcusaureusat concentration of 0.1%, but it could not disperse the mature biofilm ofStaphylococcusaureus.

Staphylococcusaureus; biofilm; betaine

江蘇省實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金(xk201114)；南京醫(yī)科大學(xué)“十二五”教育研究課題(JYK2015020)。

金菲，1987年生，女，大學(xué)本科，從事臨床微生物專業(yè)工作。

倪芳，主任技師，E-mail:yunerni@163.com；王玨，主管技師，E-mail:13852299659@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.06

R446.5

A

2017-02-01)