稅劍，鄒明祥，王海晨，李軍，劉文恩，晏群(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院檢驗科，長沙 410008)

·微生物生物膜·

銅綠假單胞菌臨床分離株生物膜、群體感應(yīng)相關(guān)基因及耐藥性分析*

稅劍，鄒明祥，王海晨，李軍，劉文恩，晏群
(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院檢驗科，長沙 410008)

目的 研究臨床分離銅綠假單胞菌生物膜形成能力、群體感應(yīng)相關(guān)基因攜帶情況與耐藥性間的關(guān)系。方法 結(jié)晶紫染色法半定量分析94株銅綠假單胞菌生物膜形成能力，K-B法測定菌株的耐藥性，PCR檢測菌株的群體感應(yīng)相關(guān)基因lasI、lasR、rhlI、rhlR，分析不同生物膜形成能力銅綠假單胞菌的耐藥性差異及群體感應(yīng)相關(guān)基因攜帶情況對生物膜形成的影響。結(jié)果 所測94株銅綠假單胞菌中有89株(94.7%)具有成膜能力，其中成膜能力弱陽性22株(23.4%)，成膜能力陽性44株(46.8%)，成膜能力強(qiáng)陽性23株(24.5%)。不同成膜能力銅綠假單胞菌對阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素的耐藥率不同(P<0.05)，其中成膜能力強(qiáng)陽性菌株對阿米卡星的耐藥率高于成膜能力陽性和弱陽性菌株(P<0.05)，對妥布霉素、慶大霉素的耐藥率高于弱陽性菌株(P<0.05)。所測94株銅綠假單胞菌有91株攜帶lasI、lasR、rhlI、rhlR基因，2株lasR基因缺失，1株lasI、lasR、rhlI、rhlR基因缺失。lasR基因缺陷型菌株以及l(fā)asI、lasR、rhlI、rhlR基因缺陷型菌株成膜能力陰性，對常規(guī)抗菌藥物敏感。結(jié)論 絕大多數(shù)銅綠假單胞菌臨床分離株具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，銅綠假單胞菌耐藥性與生物膜形成能力具有一定的相關(guān)性，群體感應(yīng)相關(guān)基因影響生物膜形成。

銅綠假單胞菌；生物膜；耐藥性；群體感應(yīng)相關(guān)基因

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是臨床最常見的革蘭陰性非發(fā)酵桿菌。研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌容易粘附于惰性生物材料或機(jī)體表面形成生物膜，后者阻礙抗生素對膜內(nèi)細(xì)菌的殺滅作用，從而引起慢性持續(xù)性感染[1]。銅綠假單胞菌形成生物膜的過程受群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)調(diào)控[2]。銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)包括las系統(tǒng)和rhl系統(tǒng)，其中l(wèi)as系統(tǒng)由lasI基因和lasR基因組成，rhl系統(tǒng)由rhlI基因和rhlR基因組成[3]。本研究擬在體外建立一種銅綠假單胞菌生物膜半定量檢測方法，對94株臨床菌株的生物膜能力進(jìn)行測定，分析其耐藥性與生物膜成膜能力的相關(guān)性，同時對94株臨床分離菌株的QS相關(guān)基因(lasI、lasR、rhlI、rhlR)進(jìn)行檢測，探討其對生物膜形成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株 收集2016年6月至9月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床分離的銅綠假單胞菌94株，剔除同一患者相同部位重復(fù)分離的相同細(xì)菌。其中63株來源于痰，10株來源于分泌物，5株來源于尿液標(biāo)本，4株來源于血液，3株來源于膽汁，9株來源于其他標(biāo)本(包括組織塊、引流液、支氣管肺泡灌洗液、大便、腹水等)。經(jīng)法國生物梅里埃公司Vitek 2 Compact微生物鑒定系統(tǒng)鑒定到種。質(zhì)控菌株為ATCC 27853購自國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心。

1.2 抗菌藥物藥敏紙片 抗菌藥物藥敏紙片購自英國Oxiod公司，種類包括哌拉西林/他巴唑坦、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星。

1.3 主要試劑及儀器 LB液體培養(yǎng)基自行配制，1 g/L結(jié)晶紫(北京索萊寶公司)，95%乙醇(長沙市潔玉消毒用品廠)，2×Taq PCR Master Mix試劑(北京百泰克生物技術(shù)公司)，DNA marker DL-2000(大連寶生物工程公司)，瓊脂糖(西班牙Biowest公司)，引物由上海生工公司合成。96孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板(美國Corning公司)，臺式恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海比朗公司)，恒溫培養(yǎng)箱(上海永興醫(yī)化器械制造廠), Vitek 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)、比濁儀(法國生物梅里埃公司)，InGenius凝膠成像分析系統(tǒng)(英國Syngene公司)，ABI 2720基因擴(kuò)增儀(美國ABI公司)，Hoefer PS 2A200水平電泳儀(美國Hoefer公司)，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)，多功能酶聯(lián)儀(奧地利TECAN公司)。

1.4 細(xì)菌藥敏試驗 用K-B法測定銅綠假單胞菌的耐藥性，實驗方法、質(zhì)量控制及判斷標(biāo)準(zhǔn)參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2013年標(biāo)準(zhǔn)[4]。

1.5 生物膜半定量測定 參照文獻(xiàn)[5]，稍加改進(jìn)。將臨床分離株轉(zhuǎn)種至血平板，于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。從血平板上挑取單個菌落接種至5 mL液體LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h。用比濁儀調(diào)整菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，吸?00 μL調(diào)整后的菌液加入組織培養(yǎng)板的加樣孔。于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，吸棄液體培養(yǎng)基，生理鹽水清洗培養(yǎng)孔3次，去除浮游菌，自然晾干。每孔加入100 μL 1 g/L結(jié)晶紫染液染色15 min，棄染液，在流水下緩慢沖洗3次，自然晾干。每孔加入100 μL 95%乙醇，混勻2 min，酶聯(lián)儀570 nm處比色讀取吸光度(A)值，每株菌做5個復(fù)孔。5個陰性對照孔每孔僅加100 μL LB液體培養(yǎng)基。陰性對照的平均A值加上其標(biāo)準(zhǔn)差定義為Ac，待測孔A與Ac比較。生物膜形成能力可分為4類：陰性(-)：無生物膜形成，A≤Ac；弱陽性(+)：Ac4Ac。

1.6 PCR擴(kuò)增初篩QS相關(guān)基因 采用煮沸法提取細(xì)菌總DNA。根據(jù)文獻(xiàn)[6]合成4對引物，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，蒸餾水6 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，相應(yīng)溫度(見表1)退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳(100 V)40 min后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

表1 群體感應(yīng)相關(guān)基因引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 21.0軟件進(jìn)行。不同成膜能力銅綠假單胞菌耐藥率的比較進(jìn)行行×列卡方檢驗，兩兩比較采用Fisher確切概率法或χ2分割法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銅綠假單胞菌藥敏結(jié)果 94株銅綠假單胞菌的藥敏結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌對氨曲南、亞胺培南的耐藥率分別高達(dá)46.8%、36.2%，對阿米卡星的耐藥率最低，為9.6%。94株銅綠假單胞菌對11種抗菌藥物的藥敏結(jié)果見表2。

表2 94株銅綠假單胞菌對11種抗菌藥物的藥敏結(jié)果[n(%)]

2.2 生物膜半定量測定 結(jié)晶紫染色法半定量測定培養(yǎng)24 h的94株銅綠假單胞菌的成膜能力，其中成膜能力陰性5株(5.3%)，弱陽性22株(23.4%)，陽性44株(46.8%)，強(qiáng)陽性23株(24.5%)。

2.3 銅綠假單胞菌耐藥性與成膜能力關(guān)系分析 根據(jù)成膜能力的不同，對臨床分離的94株銅綠假單胞菌進(jìn)行分組。不同成膜能力銅綠假單胞菌對阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素的耐藥率不同，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中，成膜能力強(qiáng)陽性菌株對阿米卡星的耐藥率高于陽性(χ2=4.823，P<0.05)和弱陽性菌株(P=0.022)，對妥布霉素、慶大霉素的耐藥率高于弱陽性菌株(P均<0.05)。不同成膜能力銅綠假單胞菌對其他常用抗菌藥物的耐藥性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 94株銅綠假單胞菌不同成膜能力的耐藥性比較

注：a，與成膜能力弱陽性組比較，P<0.05；b，與成膜能力陽性組比較，P<0.05。

2.4 PCR擴(kuò)增QS相關(guān)基因結(jié)果及與成膜能力關(guān)系分析 臨床分離94株銅綠假單胞菌QS相關(guān)基因PCR擴(kuò)增分析發(fā)現(xiàn)， 91株攜帶lasI、lasR、rhlI、rhlR基因，其中89株能形成生物膜；1株lasI、lasR、rhlI、rhlR基因缺陷，不能形成生物膜；2株lasR基因缺陷，也不能形成生物膜。4個基因部分菌株電泳結(jié)果見圖1。

注：M，DNA marker DL2000；1～15，檢測菌株；7，lasI、lasR、rhlI、rhlR缺陷菌株；9、12，lasR缺陷菌株。

圖1 部分菌株群體感應(yīng)相關(guān)基因PCR產(chǎn)物電泳分析

3 討論

本研究通過96孔組織培養(yǎng)板體外構(gòu)建生物膜，94株臨床分離銅綠假單胞菌中有89株具有不同程度的成膜能力，與李曉霞等[7]、周俊立等[8]研究結(jié)果相近。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)不同成膜能力的菌株對阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素的耐藥性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中成膜能力強(qiáng)陽性菌株對阿米卡星的耐藥率高于陽性和弱陽性菌株，對妥布霉素、慶大霉素的耐藥率高于弱陽性菌株。目前細(xì)菌生物膜耐藥機(jī)制主要有2個學(xué)說。(1)抗菌藥物滲透障礙學(xué)說：生物膜中含有大量蛋白質(zhì)、多糖、胞外DNA等物質(zhì)，可以有效減緩抗菌藥物的滲透，降低其中抗菌藥物的濃度，其成膜能力越強(qiáng)，胞外基質(zhì)越厚，對抗菌藥物滲透的阻力越大。同時生物膜的某些組分還可以與抗菌藥物結(jié)合，阻止抗菌藥物與細(xì)菌接觸。(2)營養(yǎng)限制學(xué)說:生物膜底層細(xì)菌由于缺氧、缺營養(yǎng)，長期處于休眠狀態(tài)(稱之為饑餓細(xì)胞)，這種狀態(tài)下的細(xì)菌對抗菌藥物不敏感[9]。生物膜的特殊結(jié)構(gòu)以及其中細(xì)菌表型的異質(zhì)性，使成熟的生物膜高度耐藥，在臨床抗感染治療中，即使選擇體外試驗敏感的抗菌藥物，依然難以清除生物膜病灶。因此，在臨床抗感染治療中要特別注意生物膜相關(guān)感染，使用高效抗菌藥物及時清除生物膜，降低持續(xù)慢性感染發(fā)生率。

QS是廣泛存在細(xì)菌群體中的依賴細(xì)菌密度的信號通訊系統(tǒng)[10]。細(xì)菌在生長繁殖過程中會分泌大量信號分子，當(dāng)信號分子濃度達(dá)到一定閾值時，與其受體結(jié)合，直接或者間接啟動相應(yīng)基因表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)菌毒力因子的產(chǎn)生、生物膜的形成，增強(qiáng)細(xì)菌的致病性和耐藥性。本研究對94株銅綠假單胞菌臨床分離株的QS相關(guān)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并成像，發(fā)現(xiàn)有91株菌均攜帶lasI、lasR、rhlI、rhlR基因，1株菌出現(xiàn)4個基因同時缺陷，2株菌出現(xiàn)lasR基因缺陷。通過對這些菌株的成膜能力對比，發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)相關(guān)基因缺陷菌株均不能形成生物膜，且對常規(guī)抗菌藥物敏感。本研究發(fā)現(xiàn)其中有2株菌QS相關(guān)基因正常但菌株成膜能力陰性，分析其原因可能是銅綠假單胞菌在生物膜形成過程中產(chǎn)生了抑制生物膜的物質(zhì)。Kolodkin等[11]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌在形成生物膜過程中產(chǎn)生一種能夠抑制生物膜的D-氨基酸，Carlos等[12]證實D-氨基酸也具有抑制銅綠假單胞菌生物膜功能。因此，我們推測銅綠假單胞菌QS相關(guān)基因正常但成膜能力陰性，可能與其成膜過程中產(chǎn)生抑制生物膜的物質(zhì)有關(guān)。接下來，我們將通過高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)分離出這種能夠抑制生物膜的物質(zhì)并對其作用進(jìn)行研究。研究表明，QS系統(tǒng)對生物膜的形成發(fā)揮重要的調(diào)控作用，而生物膜的形成又與細(xì)菌耐藥密切相關(guān)。因此通過對QS相關(guān)基因進(jìn)行研究，有望找到抗生物膜的新靶點，從而有效控制慢性持續(xù)感染。

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(本文編輯：劉群)

Analysis for biofilm, quorum sensing related genes and drug resistance in clinical isolates ofPseudomonasaeruginosa

SHUIJian,ZOUMing-xiang,WANGHai-chen,LIJun,LIUWen-en,YANQun
(DepartmentofClinicalLaboratory,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,Hunan,China)

Objective To study the relationship between biofilm-forming ability, distribution of quorum sensing related genes and antibiotic resistance in clinical isolates ofPseudomonasaeruginosa. Methods The biofilm-forming ability of 94 clinical isolates was analyzed semi-quantitatively by crystal violet staining. The antibiotic resistance of the isolates was determined by K-B method. Quorum sensing related genes,lasI,lasR,rhlRandrhlI, were detected by PCR. The differences of drug resistance ofPseudomonasaeruginosawith different biofilm-forming ability and the effects of quorum sensing related genes on biofilm-forming ability were analyzed. Results Of the 94 isolates, 89(94.7%) showed biofilm-forming ability. The 89 isolates consisted of 22(23.4%) isolates with weakly positive biofilm-forming ability, 44(46.8%) with positive biofilm-forming ability and 23(24.5%) with strongly positive biofilm-forming ability. The strains ofPseudomonasaeruginosawith different biofilm-forming ability showed different drug resistance rates to amikacin, tobramycin and gentamicin(P<0.05). The drug resistance rate of the strains with strong positive biofilm-forming ability to amikacin was higher than that of the strains with positive and weakly positive biofilm-forming ability(P<0.05), and the drug resistance rates to tobramycin and gentamicin were higher than those of the strains with weakly positive biofilm-forming ability(P<0.05). Of the 94 isolates, 91 strains carriedlasI,lasR,rhlIandrhlRgene and 2 strains only lostlasRgene, and 1 strain lost all the 4 genes. The strains with onlylasRgene deficiency or all thelasI,lasR,rhlIandrhlRgene deficiencies showed negative biofilm-forming ability, and were sensitive to conventional antimicrobial agents. Conclusion Most of the clinical isolates ofPseudomonasaeruginosain this study showed strong ability of biofilm-forming ability which may correlate positively to partial antibiotic resistance. The quorum sensing related genes may affect biofilm formation ofPseudomonasaeruginosa.

Pseudomonasaeruginosa; biofilm; antibiotic resistance; quorum sensing related genes

湖南省發(fā)展和改革委員會資助項目(湘發(fā)改投資[2014]658號)。

稅劍，1986年生，男，碩士研究生，技師，從事細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。

鄒明祥，主任技師，碩士研究生導(dǎo)師，博士，E-mail：zoumingxiang@126.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.04

R446.5

A

2017-01-17)