王央霞，高戈，鄭濤濤(.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，長沙 4003；.澧縣紅十字會(huì)醫(yī)院感染科，湖南澧縣 45000)

·微生物生物膜·

阿司匹林對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成和分散的影響*

王央霞1，高戈1，鄭濤濤2
(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，長沙 410013；2.澧縣紅十字會(huì)醫(yī)院感染科，湖南澧縣 415000)

目的 探討阿司匹林對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的形成和分散的作用。方法 微量肉湯稀釋法檢測(cè)銅綠假單胞菌浮游菌對(duì)阿司匹林的敏感性；通過微孔板構(gòu)建生物膜，結(jié)合結(jié)晶紫染色探討阿司匹林對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的形成和分散的影響；通過微孔板結(jié)合稀釋平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)阿司匹林對(duì)銅綠假單胞菌初始粘附能力的影響。結(jié)果 銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1和臨床菌株P(guān)A18、PA53和PA67對(duì)阿司匹林MIC值分別為5 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL和5 mg/mL。當(dāng)阿司匹林濃度為2.5 mg/mL時(shí)可顯著抑制PAO1和PA18生物膜的形成(t=5.65，P<0.05；t=5.06，P<0.05)，當(dāng)其濃度分別為1.25 mg/mL和0.313 mg/mL時(shí)能顯著抑制PA67和PA53生物膜的形成(t=4.10，P<0.05；t=5.12，P<0.05)。2.5 mg/mL阿司匹林可顯著分散PAO1和PA18培養(yǎng)24 h形成的生物膜(t=6.45，P<0.05；t=6.26，P<0.05)，1.25 mg/mL和0.313 mg/mL時(shí)可顯著分散PA67和PA53形成的生物膜(t=7.82，P<0.05；t=9.18，P<0.05)。2.5 mg/mL阿司匹林能顯著抑制銅綠假單胞菌的初始粘附(P<0.05)。結(jié)論 阿司匹林能有效抑制銅綠假單胞菌的初始粘附能力和生物膜的形成，并對(duì)已形成生物膜具有分散能力。

阿司匹林；銅綠假單胞菌；生物膜；初始粘附；結(jié)晶紫染色

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是一種常見的革蘭陰性條件致病菌，常見于院內(nèi)感染[1]。PA能粘附于物體或人體組織表面并相互聚集，分泌胞外多糖、DNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)將自身包裹，形成的“蘑菇狀”膜性聚合物即為生物膜。生物膜狀態(tài)下PA的耐藥性比浮游菌增強(qiáng)10～1 000倍，給臨床治療帶來極大困難[2]。傳統(tǒng)抗菌藥物難以有效根治PA生物膜引起的感染。殘留于人體內(nèi)的PA在不斷受到亞抑菌濃度抗生素的刺激下，易發(fā)生突變而產(chǎn)生耐藥性[3-4]。新型抗生素的研發(fā)已難以跟上細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的步伐。因此，“老藥新用”成為了當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。阿司匹林作為一種非甾體類解熱鎮(zhèn)痛消炎藥被廣泛應(yīng)用于心血管及風(fēng)濕免疫性疾病，近年來研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林具有廣譜抗菌活性[5]，然而其對(duì)細(xì)菌生物膜的影響尚處于研究階段。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1由湘雅三醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。臨床菌株(PA18、PA53、PA67)分離自2015年4月至6月中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院臨床非重復(fù)痰液標(biāo)本分離菌株。

1.2 儀器與試劑 Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀(法國生物梅里埃公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)；多功能微孔板檢測(cè)酶聯(lián)儀(美國BioTek公司)；M-H肉湯(美國BD公司)；LB肉湯(北京陸橋公司)；結(jié)晶紫顆粒(天津中信凱泰化工公司)；阿司匹林(上海阿拉丁生化公司)。

1.3 藥敏試驗(yàn) 將配備好的阿司匹林母液用M-H肉湯倍比稀釋(0.078～20 mg/mL)，以未加阿司匹林的M-H肉湯作為空白對(duì)照。在96孔板中每孔分別加入100 μL，制備微量稀釋盤。將菌懸液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?，?∶20稀釋，使其菌含量為5×106CFU/mL，取10 μL上述菌懸液加入至制備好的微量稀釋盤中。35 ℃培養(yǎng)16～20 h，肉眼所見能完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度判為最低抑菌濃度(MIC)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.4 生物膜形成抑制試驗(yàn) 挑取單個(gè)菌落置于LB肉湯中37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)16 h，3 000×g離心20 min后用生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度至1麥?zhǔn)蠞岫葐挝?。取LB肉湯倍比稀釋至不同濃度(0.078～10 mg/mL)的阿司匹林溶液各198 μL分別加入96孔板，以未加阿司匹林的LB肉湯作為陰性對(duì)照，再向每孔分別加入2 μL備用的PA菌懸液。37 ℃培養(yǎng)24 h后，用生理鹽水漂洗3次去除浮游菌。(1)結(jié)晶紫染色：用微量移液器吸干微孔中殘余液體，各孔加入200 μL 5 g/L結(jié)晶紫溶液，振蕩器上搖15 min，棄染液，生理鹽水漂洗3～5次去除未結(jié)合結(jié)晶紫溶液，風(fēng)干后各孔加入200 μL 95%乙醇溶液，以洗脫與生物膜結(jié)合的結(jié)晶紫，靜置20 min后于多功能酶聯(lián)儀檢測(cè)570 nm處的吸光度(A570 nm)[6]。(2)陰性對(duì)照孔和加入2.5 mg/mL阿司匹林的實(shí)驗(yàn)孔進(jìn)行平板菌落稀釋計(jì)數(shù)：向去除浮游菌的微孔中各加入200 μL無菌生理鹽水，超聲振蕩(頻率：40 kHz；功率：200 W)15 min使粘附于孔壁和孔底的生物膜分散成浮游狀態(tài)，用生理鹽水倍比稀釋后取10 μL稀釋菌懸液均勻涂布于羊血瓊脂平板，于培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)后選取長有5～20個(gè)菌落的平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5 24 h生物膜分散試驗(yàn) 1麥?zhǔn)蠞岫葐挝籔A菌懸液制備同1.4。將上述菌液100倍稀釋，每孔取100 μL加入96孔板，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，用生理鹽水漂洗3次。每孔分別加入110 μL倍比稀釋的阿司匹林溶液(0.078～20 mg/mL)，37 ℃靜置溫育24 h。用生理鹽水漂洗3次去除浮游菌，再進(jìn)行結(jié)晶紫染色，對(duì)陰性對(duì)照孔和加入2.5 mg/mL阿司匹林的實(shí)驗(yàn)孔進(jìn)行平板菌落稀釋計(jì)數(shù)。以下步驟同結(jié)晶紫染色法和平板菌落稀釋計(jì)數(shù)法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.6 阿司匹林對(duì)PA初始粘附的影響 1麥?zhǔn)蠞岫葐挝籔A菌懸液制備同1.4。96孔板中每孔分別加入196 μL用LB肉湯倍比稀釋的阿司匹林溶液(0.313～10 mg/mL)，不加阿司匹林的LB肉湯作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)孔和對(duì)照孔分別加入4 μL PA菌懸液。置37 ℃靜置培養(yǎng)30 min后，生理鹽水漂洗3次，再向各孔中加入200 μL生理鹽水，超聲振蕩(頻率：40 kHz；功率：200 W)15 min使生物膜轉(zhuǎn)化成浮游狀態(tài)。用稀釋平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)微孔中細(xì)菌的濃度，具體見1.4所述。細(xì)菌初始粘附率(%)=阿司匹林實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌濃度/未加藥對(duì)照組細(xì)菌濃度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。正態(tài)分布計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PA對(duì)阿司匹林的敏感性 采用微量肉湯稀釋法測(cè)得PAO1、PA18、PA53和PA67對(duì)阿司匹林的MIC值分別為5 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL和5 mg/mL。

2.2 阿司匹林抑制PA生物膜的形成 當(dāng)阿司匹林濃度為2.5 mg/mL時(shí)可顯著抑制PAO1和PA18生物膜的形成，使PAO1生物膜總量A570 nm從2.256±0.250減少至1.142±0.232(t=5.65，P<0.05)，使PA18生物膜總量A570 nm從1.814±0.323減少至0.683±0.213(t=5.06，P<0.05)；當(dāng)阿司匹林的濃度為1.25 mg/mL時(shí)可顯著抑制PA67生物膜的形成，使其生物膜總量A570 nm從2.536±0.261減少至1.670±0.256(t=4.10，P<0.05)；當(dāng)阿司匹林的濃度為0.313 mg/mL時(shí)可顯著抑制PA53生物膜的形成，使其生物膜總量A570 nm從2.777±0.166減少至2.191±0.108(t=5.12，P<0.05)。且隨著阿司匹林濃度的增高，其抑制PA生物膜形成的能力越強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，見圖1。當(dāng)阿司匹林的濃度為2.5 mg/mL時(shí)還能顯著抑制PAO1、PA67、PA53和PA18生物膜的形成(P均<0.05)，見表1。

注： *，各組分別與未加藥的對(duì)照組相比，P<0.05。

圖1 阿司匹林抑制PA生物膜的形成

表1 阿司匹林對(duì)PA生物膜形成活菌計(jì)數(shù)的影響(×108CFU/mL)

分組PAO1PA67PA53PA18實(shí)驗(yàn)組1．82±0．231．20±0．331．19±0．381．20±0．25對(duì)照組5．00±1．030．30±0．382．00±0．853．00±0．97t值8．507．685．025．88P值<0．05<0．05<0．05<0．05

2.3 阿司匹林分散24 h PA生物膜 當(dāng)阿司匹林濃度為2.5 mg/mL時(shí)可顯著分散PAO1和PA18形成的24 h生物膜，使PAO1生物膜總量A570 nm從2.357±0.095減少至1.022±0.112(t=6.45，P<0.05)，使PA18生物膜總量A570 nm從1.298±0.060減少至0.352±0.255(t=6.26，P<0.05)；濃度為1.25 mg/mL時(shí)可顯著分散PA67形成的生物膜，使其生物膜總量A570 nm從2.461±0.154減少至1.053±0.271(t=7.82，P<0.05)；而0.313 mg/mL阿司匹林即可顯著分散PA53形成的生物膜，使其生物膜總量A570 nm從2.418±0.069減少至2.041±0.014(t=9.18，P<0.05)，且阿司匹林對(duì)PA生物膜的分散作用亦呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。見圖2。此外，當(dāng)阿司匹林的濃度為2.5 mg/mL時(shí)能顯著減少成熟24 h PAO1、PA67、PA53和PA18生物膜中活菌的數(shù)量(P均<0.05)。見表2。

注：*，各組分別與未加藥的對(duì)照組相比，P<0.05。

圖2 阿司匹林分散PA已形成的24 h生物膜

表2 阿司匹林對(duì)PA生物膜分散活菌計(jì)數(shù)的影響(×108CFU/mL)

分組PAO1PA67PA53PA18實(shí)驗(yàn)組3．70±0．555．02±0．695．70±0．452．00±0．56對(duì)照組2．00±0．563．00±0．764．00±0．432．00±0．82t值4．154．957．083．38P值<0．05<0．05<0．05<0．05

2.4 阿司匹林抑制PA的初始粘附 當(dāng)阿司匹林濃度為2.5 mg/mL時(shí)能顯著抑制PA的初始粘附，與未加藥的陰性對(duì)照組相比，可分別使PAO1、PA18和PA53的粘附率從100%減少至(55.00±5.11)%(t=8.21，P<0.05)、(46.47±4.32)%(t=13.58，P<0.05)和(62.68±6.53)%(t=6.39，P<0.05)；當(dāng)阿司匹林濃度為1.25 mg/mL時(shí)就能顯著抑制PA67的初始粘附能力，使其粘附率從100%下降至(42.86±2.30)%(t=11.75，P<0.05)。且隨著阿司匹林的濃度升高，其抑制作用明顯增強(qiáng)。見圖3。

注：*，各組分別與未加藥的對(duì)照組相比,P<0.05。

圖3 阿司匹林抑制PA的初始粘附

3 討論

前期體外研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林具有廣泛的抗真菌、細(xì)菌和病毒的作用[5]。此外，阿司匹林與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)用時(shí)，還具有協(xié)同抑制真菌的作用[7]。然而，有關(guān)阿司匹林對(duì)生物膜狀態(tài)下細(xì)菌的影響還尚未完全闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林能有效抑制或分散PA生物膜。此作用可能是通過干擾PA的群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)。QS系統(tǒng)是細(xì)菌間進(jìn)行信號(hào)分子交流的系統(tǒng)，調(diào)節(jié)著生物膜的整個(gè)生理周期，對(duì)生物膜的形成至關(guān)重要。PA的QS系統(tǒng)主要由las、rhl和pqs3條主要通路構(gòu)成，其共同受到lasI/R上游調(diào)節(jié)系統(tǒng)的調(diào)控。PA QS系統(tǒng)之間的信號(hào)分子主要包括兩種：3-OH-C12-HSL和C4-HSL。研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林不僅能抑制QS系統(tǒng)相關(guān)基因如lasI、lasR、rhlI、rhlR、pqsR和pqsA的表達(dá)，還能與3-OH-C12-HSL和C4-HSL信號(hào)分子競(jìng)爭(zhēng)受體，影響下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林能顯著抑制PA的初始粘附能力。PA的生物膜形成過程大致分為4個(gè)主要步驟：(1)細(xì)菌的初始粘附；(2)生物膜形成期；(3)生物膜成熟期；(4)生物膜分散期[9-10]。其中，細(xì)菌的初始粘附期是生物膜形成的第一步，決定著生物膜的形成與否。PA的初始粘附通常發(fā)生在細(xì)菌與介質(zhì)表面接觸的前30 min左右。這段時(shí)間內(nèi)，PA通過自身鞭毛的擺動(dòng)，逐漸游向介質(zhì)表面，并通過菌毛及其他粘附因子與介質(zhì)表面粘附，定植后形成后期生物膜成熟的基礎(chǔ)平臺(tái)[10]。而本研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林能有效抑制PA的初始粘附，可能是通過抑制細(xì)菌鞭毛運(yùn)動(dòng)能力，并抑制PA纖毛和某些粘附因子的表達(dá)而完成，從而達(dá)到阻斷生物膜的形成。

本研究測(cè)得阿司匹林的MIC及有效抑制生物膜濃度值達(dá)到mg/mL級(jí)別，這可能會(huì)進(jìn)一步增加阿司匹林在人體內(nèi)的毒副作用，超過人體的耐受量。但后期研究或開發(fā)應(yīng)用可以考慮將阿司匹林與常規(guī)抗生素聯(lián)合應(yīng)用，減少阿司匹林劑量的同時(shí)促進(jìn)抗生素殺滅細(xì)菌生物膜的效果，同時(shí)延緩細(xì)菌的耐藥性?？傊⑺酒チ帜苡行б种芇A浮游菌的生長、初始粘附能力和生物膜的形成，并能進(jìn)一步分散已形成的24 h生物膜，有望開發(fā)成為新型抗PA生物膜藥物，解決臨床棘手問題。

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(本文編輯：劉群)

Effects of aspirin on formation and dispersion ofPseudomonasaeruginosabiofilm

WANGYang-xia1,GAOGe1,ZHENGTao-tao2
(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,XiangyaMedicalSchoolofCentralSouthUniversity,Changsha410013,Hunan; 2.DepartmentofInfectiousDiseases,LixianRedCrossHospital,Lixian415000,Hunan,China)

Objective To explore the effects of aspirin on formation and dispersion ofPseudomonasaeruginosa(P.aeruginosa) biofilm. Methods The broth microdilution method was used to detect the minimal inhibitory concentration(MIC) of aspirin forP.aeruginosa. The anti-biofilm effects of aspirin onP.aeruginosawere determined on the microtiter plates combined with crystal violet staining. The serial dilution method for counting colony number on microtiter plate was used to explore the effects of aspirin on initial adherence ofP.aeruginosa. Results The MIC values of aspirin against PAO1, PA18, PA53 and PA67 strains ofPseudomonasaeruginosawere 5, 2.5, 5 and 5 mg/mL respectively. Aspirin significantly inhibited the formation and dispersion of the biofilm of PAO1 and PA18 strains(t=5.65,P<0.05 andt=5.06,P<0.05 for inhibition;t=6.45,P<0.05 andt=6.26,P<0.05 for dispersion) at the concentration of 2.5 mg/mL. Similar effects were also found in the determination for PA67 and PA53 strains(t=6.45,P<0.05 andt=6.26,P<0.05 for inhibition;t=7.82,P<0.05;t=9.18,P<0.05 for dispersion) at aspirin concentration of 1.25 and 0.313 mg/mL respectively. Aspirin inhibited the initial adherence ofP.aeruginosaat the concentration of 2.5 mg/mL(P<0.05). Conclusion Aspirin could significantly inhibit the initial adherence and biofilm formation ofP.aeruginosaand disperse the 24 hour-formed mature bioiflm.

aspirin；Pseudomonasaeruginosa；biofilm；initial attachment；crystal violet staining

湖南省自然科學(xué)基金(2015JJ4073)；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(15C0145)；中南大學(xué)研究生自主探索創(chuàng)新課題(2016zzts501)。

王央霞，1990年生，女，大學(xué)本科，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)。

高戈，講師，E-mail:ggboxy@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.02

R446.5

A

2016-11-14)