劉婷婷，程家麗，張雪松，沈 葹，卓 勤

(中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所，北京 100050)

保健食品中番茄紅素測(cè)定方法的建立

劉婷婷，程家麗，張雪松，沈 葹，卓 勤

(中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所，北京 100050)

對(duì)保健品中番茄紅素的提取凈化及液相色譜檢測(cè)方法進(jìn)行研究。樣品用沒食子酸叔丁酯(TBG)—二氯甲烷溶液溶解、超聲波輔助提取、用PTFE濾膜過濾。采用C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5um)分離，以乙腈和甲醇溶液洗脫測(cè)定，外標(biāo)法定量。番茄紅素在5.00～200μg/mL濃度范圍的相關(guān)系數(shù)為0.993，檢出限為0.5 μg/mL，方法的回收率為81%～96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～5.9%。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于保健品中番茄紅素的檢測(cè)要求。

番茄紅素；保健品；沒食子酸叔丁酯；高效液相色譜

番茄紅素是一種重要的類胡蘿卜素，近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素比其它類胡蘿卜素有更強(qiáng)的泯滅單線態(tài)氧自由基的能力，在預(yù)防心血管疾病等方面具有重要生理功能，目前番茄紅素在功能性保健食品中的研究與應(yīng)用已成為一個(gè)新的熱點(diǎn)[1，2]。

目前番茄紅素的分析方法主要有分光光度法[3]、薄層色譜法[4]、液相色譜法[5]。由于不能排除樣品中其他胡蘿卜素的干擾，所以分光光度法很難得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。薄層法測(cè)定過程復(fù)雜、分析時(shí)間長、不易定量。高效液相色譜法是目前番茄紅素研究工作中最常采用的方法，可以將番茄紅素和其他類胡蘿卜素很好分離分析，但番茄紅素的高度不飽和結(jié)構(gòu)導(dǎo)致它的穩(wěn)定性很差，容易發(fā)生氧化降解。本文對(duì)番茄紅素樣品的前處理和色譜檢測(cè)條件進(jìn)行選擇和優(yōu)化，建立了既準(zhǔn)確定量又相對(duì)簡(jiǎn)單的高效液相色譜方法，適合于日常監(jiān)督檢測(cè)和確證分析。

1 材料和方法

1.1 試劑

番茄紅素對(duì)照品(95.9%，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；二氯甲烷、L-抗壞血酸、沒食子酸、沒食子酸叔丁酯、二丁基羥基甲苯、特丁基對(duì)苯二酚(優(yōu)級(jí)純，天津化學(xué)試劑公司)，實(shí)驗(yàn)用水為二次凈化的純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(美國Waters)；高純水發(fā)生器(美國MilliQ)；超聲波清洗機(jī)(江蘇昆山)。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 稱取26.069mg番茄紅素對(duì)照品，置于5mL棕色容量瓶中，加入0.5g/L沒食子酸叔丁酯(TBG)—二氯甲烷溶液溶解并定容至刻度，混勻。由于番茄紅素不穩(wěn)定，此溶液臨用現(xiàn)配。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液 根據(jù)試驗(yàn)需要，稀釋標(biāo)準(zhǔn)液配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 方法

(1)樣品提?。悍Q取約1.000 g樣品(精確至0.001 g)，置于50mL棕色容量瓶中。加入0.5g/L沒食子酸叔丁酯(TBG)—二氯甲烷溶液40mL，超聲提取10min后，加入沒食子酸叔丁酯(TBG)—二氯甲烷溶液定容至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜。(2)液相色譜條件：色譜柱Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相：乙腈：甲醇=95：5；進(jìn)樣量10μL；紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長472 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

為提高前處理過程中番茄紅素的穩(wěn)定性，選取L-抗壞血酸(維生素C)、沒食子酸(GA)、沒食子酸叔丁酯(TBG)、二丁基羥基甲苯(BHT)、特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)抗氧化劑加入到二氯甲烷提取液中。從表1可以看出，GA、TBG、BHT、TBHQ均能顯著地提高番茄紅素的穩(wěn)定性，L-抗壞血酸在一定條件下具有促氧化作用。據(jù)報(bào)道[6]，抗壞血酸對(duì)類胡蘿卜素、亞麻酸酯體系是促氧化劑，這種促氧化作用可能與抗壞血酸所處體系的氧和微量金屬離子的存在有關(guān)。GA、TBG、BHT、TBHQ均屬于多酚類抗氧化劑，其抗氧化作用是酚類物質(zhì)能提供氫原子與氧化過程中產(chǎn)生的自由基結(jié)合，使自由基轉(zhuǎn)變成較穩(wěn)定的化合物[7]。番茄紅素的氧化被認(rèn)為是自由基歷程的反應(yīng)，因此消除自由基即可阻斷氧化反應(yīng)。TBG分子內(nèi)的氫鍵效應(yīng)和電子效應(yīng)最強(qiáng)，其分子穩(wěn)定自由基的作用最大，得到的回收率最高。

表1 抗氧化劑對(duì)番茄紅素穩(wěn)定性的影響

2.2 提取條件的選擇

由圖1可見，超聲后的番茄紅素回收率比不超聲均有所提高，超聲10 min的回收率大約為95%，繼續(xù)增加超聲時(shí)間回收率基本保持不變，因此，選取的超聲時(shí)間為10 min。

圖1 超聲對(duì)回收率影響的比較

2.3 濾膜的選取

本試驗(yàn)比較了聚丙烯膜(GHP)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、聚四氟乙烯膜(PTFE)、尼龍膜(NY)對(duì)上機(jī)前的樣品凈化的效果。1mg/mL的番茄紅素，通過PTFE和GHP濾膜后的回收率均為96%、PVDF膜為90%、NY膜為70%，可見尼龍膜對(duì)目標(biāo)物的吸附性能較高。PTFE和GHP凈化效果均較好，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，本試驗(yàn)選取PTFE膜用于上機(jī)前的凈化。

2.4 色譜條件的選擇

番茄紅素在極性小的試劑中溶解性較好，考慮到低極性試劑對(duì)儀器管路的腐蝕較嚴(yán)重，選取乙腈和甲醇混合液作為流動(dòng)相，通過優(yōu)化確定流動(dòng)相的比例為乙腈：甲醇=95：5。色譜柱的溫度設(shè)為30℃，此溫度下番茄紅素比較穩(wěn)定，具有良好的保留、分離能力(圖2)。

2.5 線性范圍與檢出限

配制適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以番茄紅素溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)以其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)行線性回歸。番茄紅素溶液在5.00～200μg/mL線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.993。以3倍信噪比確定番茄紅素的檢出限為0.5μg/mL、以10倍信噪比確定番茄紅素的定量限為2μg/mL(圖2)。

圖2 番茄紅素保健品色譜

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

應(yīng)用優(yōu)化的前處理和色譜條件，對(duì)陽性樣品進(jìn)行3個(gè)添加水平的回收試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)6次。番茄紅素的添加水平分別是10.0、50.0和100μg/g，如表2所示，番茄紅素的回收率81%～96%、RSD為3.1%～5.9%。

表2 番茄紅素的回收率及精密度(n=6)

3 結(jié)論

本文采用液相色譜法建立了保健食品中的番茄紅素檢測(cè)的方法，采用沒食子酸叔丁酯(TBG)—二氯甲烷溶液超聲提取、聚四氟乙烯(PTFE)濾膜凈化、C18色譜柱分離的高效液相色譜法檢測(cè)。方法準(zhǔn)確度、回收率和精密度均較好，應(yīng)用于保健食品中番茄紅素的測(cè)定，取得了較好的效果。◇

[1]凌關(guān)庭，等.食品添加劑手冊(cè)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1997：590.

[2]成堅(jiān)，曾慶孝.番茄紅素的性質(zhì)及生理功能研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2000(2)：75-79.

[3]候純明，何美，周鑫.番茄紅素檢測(cè)方法的建立[J].食品科學(xué)，2007，28(5)：295-298.

[4]邸進(jìn)申，王燕燕，鄭輝杰，等.番茄紅素的層析分離[J].精細(xì)化工，2003，20(4)：215-217.

[5]張亮，坤生，呂曉玲，等.番茄紅素測(cè)定方法的研究[J].中國食品學(xué)報(bào)，2005(3)：75-78.

[6]姜雨，王獻(xiàn)任，董詩源，等.番茄紅素的研究及應(yīng)用[J].疾病控制雜志，2008，37(3)：307-312.

[7]裴玲，張海霞，張巖.沒食子酸及其衍生物抗氧化活性的理論研究[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)，2015(7)：27-33.

(責(zé)任編輯 李婷婷)

Determination on Lycopene in Health Foods by HPLC

LIU Ting-ting，CHENG Jia-li，ZHANG Xue-song，SHEN Shi，ZHUO Qin

(National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevetion，Beijing 100050，China)

High performance liquid chromatography (HPLC)method was developed for determination on lycopene in health foods.The samples were dissolved in gallic acid tert-butyl ester (TBG)dichloromethane solution and extracted by means of ultrasonic.The sample extract was cleaned up by polytetrafluoroethylene(PTFE)membrane.C18Column (250 mm× 4.6 mm，5 μm)was as chromatographic separation column，and the mixed solution of acetonitrile and methanol was as mobile phase under elution.The detection on lycopene was carried out by HPLC.The external standard method was used for quantitative analysis.The calibration curves for lycopene were indicated in the range of 5.0～200 μg/ mL，and the detection limit was 0.5 μg/mL.The recoveries of lycopene ranged from 81% to 96% with relative standard deviations 31%～59%.The method was simple and rapid to meet the requirement for determination on lycopene in health foods.

lycopene；health food；gallic acid tert-butyl ester；high performance liquid chromatography(HPLC)

十二五科技支撐項(xiàng)目“功能食品資源優(yōu)化及評(píng)價(jià)共性關(guān)鍵技術(shù)研究”(項(xiàng)目編號(hào)：2012BAD33B01)。

劉婷婷(1985— )，女，碩士，助理研究員，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生。

卓勤(1969— )，女，博士，研究員，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生。