應(yīng) 銳, 張朝輝, 段筱杉, 趙 雪, 侯 虎, 李八方

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紫菜中類(lèi)菌孢素氨基酸純化工藝的優(yōu)化及其抗紫外輻射作用研究

應(yīng) 銳, 張朝輝, 段筱杉, 趙 雪, 侯 虎, 李八方

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東青島 266023)

為了篩選純化紫菜類(lèi)菌孢素氨基酸(mycosporine-like amino acid, MAAs)的離子交換樹(shù)脂, 優(yōu)化純化工藝, 并研究純化后MAAs體外抗紫外輻射活性, 本研究通過(guò)靜態(tài)動(dòng)力學(xué)吸附及解析實(shí)驗(yàn), 篩選純化樹(shù)脂; 結(jié)合動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)吸附及解析單因素實(shí)驗(yàn)建立響應(yīng)面法對(duì)SA-2型陽(yáng)離子樹(shù)脂純化MAAs的二次多項(xiàng)式模型, 對(duì)MAAs的純化工藝進(jìn)行優(yōu)化; 通過(guò)建立大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的復(fù)合紫外線(xiàn)(UVA+UVB)損傷模型, 分析純化后MAAs樣品的體外抗輻射活性。結(jié)果表明: 靜態(tài)動(dòng)力學(xué)吸附及解析實(shí)驗(yàn)篩選出SA-2型陽(yáng)離子樹(shù)脂為純化MAAs的最佳樹(shù)脂, 吸附率和解析率分別為86.01%和56.63%; 吸附的最佳工藝條件為: 上樣液質(zhì)量濃度3 g/L、上樣流速1 mL/min、上樣液pH為6、洗脫液體積分?jǐn)?shù)為3%、洗脫流速為1.5 mL/min、洗脫液pH為6; 在此條件下吸附率為79.21%, 洗脫率為64.02%; 純化后的MAAs樣品能有效抑制紫外輻射而造成的損傷, 將菌種失活速度分別降低了39.10%和40.58%, 表現(xiàn)出顯著的抗紫外輻射活性。

壇紫菜; 類(lèi)菌孢素氨基酸; SA-2樹(shù)脂; 純化; 響應(yīng)面; 抗紫外輻射

類(lèi)菌孢素氨基酸(Mycosporine-like amino acids, MAAs)是一類(lèi)廣泛存在于藻類(lèi)、浮游植物及微生物中的多羥基酮類(lèi)化合物, 這類(lèi)物質(zhì)以環(huán)己烯酮為基本骨架, 通過(guò)連接不同種類(lèi)的氨基酸縮合而成。由于側(cè)鏈上所連接的活性基團(tuán)與共軛雙鍵的作用, 使得類(lèi)菌孢素氨基酸存在多種功能活性, 在320~360 nm波長(zhǎng)處具有較強(qiáng)的紫外線(xiàn)吸收作用, 基于這類(lèi)物質(zhì)對(duì)保護(hù)生命材料具有潛在的應(yīng)用價(jià)值, 近年來(lái)已引起人們的廣泛關(guān)注[1-4]。目前, 針對(duì)于這類(lèi)物質(zhì)的研究重點(diǎn)多聚焦于環(huán)境條件如溫度、光照、鹽度對(duì)藻類(lèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生并積累MAAs化合物的影響[4]。許志恒等也先后就從紫菜、江蘺等天然海藻中提取的類(lèi)菌孢素氨基酸化合物其結(jié)構(gòu)組成及抗氧化活性進(jìn)行研究[5-8]。

但是, 針對(duì)于海藻中提取的MAAs生物活性的研究大多存在樣品純化工藝復(fù)雜、純度較低等一系列問(wèn)題。為進(jìn)一步探究MAAs這類(lèi)天然活性物質(zhì)的藥效成分、作用機(jī)理并實(shí)現(xiàn)將其應(yīng)用于制藥及化妝品工業(yè)中, 類(lèi)菌孢素氨基酸純化技術(shù)的改進(jìn)與優(yōu)化已成為需解決的首要問(wèn)題[8-9]。目前, 針對(duì)這類(lèi)物質(zhì)多采用層析(硅膠柱層析、凝膠柱層析、大孔樹(shù)脂、離子交換樹(shù)脂層析等)等方法對(duì)其進(jìn)行純化分離[10-11]。而大孔樹(shù)脂、離子交換樹(shù)脂由于具有吸附量大、吸附率強(qiáng)、解析率高、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)成為純化使用的首選[11]。

本文在此基礎(chǔ)上, 選取類(lèi)菌孢素氨基酸含量較高的經(jīng)濟(jì)型海藻壇紫菜為原料, 提取其中的MAAs, 參考牛美英等提出的用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化類(lèi)菌孢素氨基酸的方法[7, 9], 選取5種純化效果較好的離子交換樹(shù)脂, 通過(guò)對(duì)比其吸附率及解析率, 選擇最佳純化樹(shù)脂, 并結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別對(duì)其吸附率、解析率建立Box-Behnken響應(yīng)面模型, 通過(guò)對(duì)比模型中各因素間交互關(guān)系, 優(yōu)化純化工藝[12-13]。并探究純化后的紫菜類(lèi)菌孢素氨基酸抗紫外輻射活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇紫菜()海南地區(qū)生產(chǎn)(購(gòu)于青島利群商廈); SA-2、001*7、201*7、D61、D152型離子交換樹(shù)脂(上海江萊生物科技有限公司); 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(取自中國(guó)海洋大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室); 無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氨水、Tris-HCl、氯化鈉均為分析純; 水為雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

粉碎機(jī)(天津泰斯特有限公司); HH-S4型恒溫水浴鍋(歐萊博科技有限公司); 攪拌器; 2-16型低溫高速離心機(jī)(Sigma); R1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鄭州長(zhǎng)城儀器有限公司); PHS-3S型pH計(jì)(雷磁-上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司); UV-2802型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Unico); BT100-2J蠕動(dòng)泵; Φ10 mm×20 cm玻璃層析柱(北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司); SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)(南京貝登生物有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 MAAs粗提液的制備

參考金寧寧等[6]的提取方法, 對(duì)紫菜中類(lèi)菌孢素氨基酸(MAAs)進(jìn)行提取, 操作流程如下: 烘干紫菜→粉碎研磨過(guò)篩→40℃乙醇提取2 h→超聲波輔助提取20 min→離心→減壓蒸餾→醇沉→冷凍穩(wěn)定→冷凍離心→減壓蒸餾→真空冷凍干燥→凍干粗品→樣品復(fù)溶→MAAs粗提液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制及粗提液質(zhì)量濃度的選擇

選取紫菜類(lèi)菌孢素氨基酸主要組分Porphyra- 334作為標(biāo)準(zhǔn)品。Porphyra-334的摩爾吸光系數(shù)334= 4.23×104mol/(L·cm), 依據(jù)朗伯比爾定律[14],可計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。應(yīng)用HPLC法測(cè)定該組分在紫菜類(lèi)菌孢素氨基酸中所占比例, 可計(jì)算求得類(lèi)菌孢素氨基酸的濃度[5], 采用UV-HPLC擬合法, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[6-7]。得到曲線(xiàn)方程為:= 20.889+0.008 47 (2=0.997 98)。根據(jù)方程, 分別計(jì)算并配制不同質(zhì)量濃度梯度的樣品粗提液。

1.3.3 MAAs純化樹(shù)脂的篩選

參考牛美英等[9]對(duì)多酚類(lèi)物質(zhì)的純化方法, 以靜態(tài)動(dòng)力學(xué)吸附實(shí)驗(yàn)為依據(jù), 繪制動(dòng)力學(xué)吸附及解析圖, 并分別以不同型號(hào)的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)樣品的吸附量、吸附率、解析量、解析率為指標(biāo), 篩選出效果最佳的樹(shù)脂作為進(jìn)一步純化所使用的樹(shù)脂。

1.3.4 純化樹(shù)脂的預(yù)處理

將篩選出的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂加入約4倍體積的雙蒸水浸泡24 h后, 洗滌處理。分別用1 mol/L的HCl動(dòng)態(tài)洗滌2 h, 用雙蒸水沖洗至中性; 再用1 mol/L的NaOH動(dòng)態(tài)洗滌2 h, 用雙蒸水沖洗至中性; 最后在使用樹(shù)脂前用1 mol/L的HCl將陽(yáng)離子交換樹(shù)脂浸泡、動(dòng)態(tài)洗滌2 h, 使樹(shù)脂轉(zhuǎn)為酸性。

1.3.5 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化MAAs樣品的單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)吸附條件優(yōu)化

1) 樣品質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

分別配制0.5~5 g/L的MAAs樣品粗提液, 保持上樣液pH為6, 上樣流速為1 mL/min。計(jì)算不同質(zhì)量濃度下樣品的吸附率。

2) 上樣液流速的吸附效果影響

配制3 g/L的MAAs樣品粗提液, 調(diào)節(jié)pH為6。分別以0.5 ~3 mL/min的上樣流速上柱樣品。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中上樣液每經(jīng)過(guò)0.5倍樹(shù)脂柱內(nèi)裝載體積(Bed Volume, BV)收集一次樣品, 定量檢測(cè)MAAs化合物含量, 從而計(jì)算吸附率。

3) 上樣液pH對(duì)吸附率的影響

選取質(zhì)量濃度為3 g/LMAAs粗提液, 分別調(diào)節(jié)上樣液的pH值從3到8, 以流速為1 mL/min的流速上柱, 通過(guò)計(jì)算流出液的濃度和體積, 計(jì)算吸附率。

1.3.5.2 動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)解析條件優(yōu)化

1) 洗脫液的質(zhì)量濃度對(duì)洗脫效果的影響

參考金寧寧等的純化方法[7], 選取NH3·H2O水溶液作為洗脫液, 分別配制體積分?jǐn)?shù)為1%~5%的NH3·H2O水溶液, 在固定洗脫液pH為6, 洗脫流速為1 mL/min, 洗脫體積為6 BV的條件下解析MAAs樣品, 計(jì)算不同體積分?jǐn)?shù)下洗脫液對(duì)洗脫率的影響。

2) 洗脫流速對(duì)洗脫效果的影響

在固定洗脫液體積分?jǐn)?shù)為3%、洗脫液pH為6、洗脫體積為6 BV的情況下, 分別將洗脫液以洗脫流速為0.5~3 mL/min上柱洗脫, 通過(guò)計(jì)算洗脫液的濃度, 計(jì)算洗脫率。

3) 洗脫液pH對(duì)洗脫效果的影響

固定洗脫液體積分?jǐn)?shù)為3%的NH3·H2O水溶液作為洗脫液, 洗脫流速為1.5 mL/min, 洗脫體積為6 BV的情況下, 調(diào)節(jié)洗脫液pH為2~8上柱洗脫, 通過(guò)計(jì)算洗脫液的濃度和體積, 計(jì)算洗脫率。

1.3.5.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化MAAs樣品純化工藝

采用Design-Expert8.0軟件設(shè)計(jì)MAAs樣品純化的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn), 應(yīng)用Box-Behnken分別建立SA-2型樹(shù)脂在不同條件下對(duì)吸附率和解析率影響的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚15-16]。分別以樣品的質(zhì)量濃度、上樣液流速、上樣液pH值這三個(gè)因素為自變量, 以上柱吸附率響應(yīng)值的高低為因變量, 分析各因素間的交互影響, 優(yōu)化吸附實(shí)驗(yàn)工藝。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。再分別以洗脫液質(zhì)量濃度、洗脫流速、洗脫液pH值這3個(gè)因素水平為自變量, 以解析率響應(yīng)值的高低為因變量, 分析各因素間的交互作用, 優(yōu)化解析實(shí)驗(yàn)工藝。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表2。分別根據(jù)吸附及解析實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面給出的最優(yōu)工藝組合進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn), 每組實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次, 取平均值進(jìn)行比較。

表1 吸附實(shí)驗(yàn)自變量因素編碼及水平

表2 解析實(shí)驗(yàn)自變量因素編碼及水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)采用Design-Expert 8.0設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ? 結(jié)合SPSS17.0軟件對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 MAAs抗紫外輻射實(shí)驗(yàn)

選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌兩種常用菌種, 將菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)處理。實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證樣品本身是否對(duì)其兩種菌種正常生長(zhǎng)有抑制作用, 再測(cè)定樣品體外抗輻射活性[17-18]。將一定濃度的MAAs樣品加入到已滅菌的生理鹽水中, 使用該生理鹽水作為稀釋液, 稀釋菌體濃度至106cfu/mL, 空白對(duì)照組使用不加樣品的生理鹽水稀釋菌體至相同濃度。吸取10 mL菌懸液在復(fù)合輻照光源下(UVA+ UVB, 離光源30 cm)分別照射0 s、30 s、1 min、2 min、5 min、10 min、20 min, 完成菌懸液的紫外損傷造模。隨后吸取菌懸液20mL涂布平板, 經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)3 d后, 平板計(jì)數(shù)測(cè)定活菌數(shù), 以輻照時(shí)間為橫坐標(biāo), 活菌個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制菌種存活曲線(xiàn)圖, 從而比較MAAs樣品體外抗紫外輻射效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選離子樹(shù)脂

圖1為不同型號(hào)樹(shù)脂靜態(tài)吸附及解析效果圖。由圖可知, 通過(guò)選取的SA-2、001*7、201*7、D61、D152 5種樹(shù)脂的靜態(tài)吸附及解析實(shí)驗(yàn), 綜合比較吸附及解析效果, 得到SA-2型陽(yáng)離子樹(shù)脂為樣品MAAs純化選用樹(shù)脂。靜態(tài)吸附量為16.43 mg/g± 0.32 mg/g、吸附率達(dá)86.01%±3.04%; 靜態(tài)解析量為9.06 mg/g±0.92mg/g、解析率為56.63%±1.02%。吸附及解析作用較其他類(lèi)型樹(shù)脂效果更佳。

2.2 SA-2型陽(yáng)離子樹(shù)脂動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)條件優(yōu)化

2.2.1 動(dòng)態(tài)吸附單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

對(duì)SA-2型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析純化紫菜類(lèi)菌孢素氨基酸進(jìn)行動(dòng)態(tài)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。在保持樣品上樣液體積為3BV, 上柱固定吸附時(shí)間為4 h的條件下, 研究上樣液質(zhì)量濃度、上樣流速、上樣液pH各因素對(duì)吸附率的影響。

當(dāng)樣品上樣液濃度達(dá)到3 g/L時(shí), 樹(shù)脂達(dá)到最大吸附率, 此后增大上樣液濃度, 吸附率不再增大并呈緩慢降低趨勢(shì)(圖2)。在選擇上樣液流速在0.5~3 mL/min范圍內(nèi), 隨上樣液流速的增大, 樣品的吸附率呈明顯的下降趨勢(shì)(圖3)。調(diào)節(jié)上樣液pH在3~8的范圍內(nèi), 隨上樣液pH的升高, 吸附率呈先增加后降低趨勢(shì)(圖4)。其中, 上樣液pH為6時(shí), 樣品吸附率最高。這可能是因?yàn)镸AAs樣品本身是一種偏弱酸性的酚類(lèi), 在弱酸性環(huán)境下易被吸附。

綜合考慮, 選擇上樣樣品濃度為 3 g/L的粗提液為響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn), 分別調(diào)節(jié)上樣流速為0.5、1、1.5 mL/min, 調(diào)節(jié)上樣液pH為5、6、7作為中心組合, 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 動(dòng)態(tài)解析實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

選擇NH3·H2O溶液作為洗脫液, 在保持洗脫體積為6BV的條件下, 研究洗脫液質(zhì)量濃度、洗脫流速、洗脫液pH各因素對(duì)洗脫率的影響。

在控制洗脫液質(zhì)量濃度為2%~4%的濃度范圍內(nèi), 隨洗脫液體積分?jǐn)?shù)的增加, 洗脫效果呈先增加后降低趨勢(shì)(圖5)。這可能是因?yàn)镸AAs樣品本身呈弱酸性, 易在弱酸性環(huán)境中與樹(shù)脂結(jié)合吸附, 使用弱堿性的洗脫液易將其解析, 而隨堿性增強(qiáng), 解析下的MAAs樣品在堿性環(huán)境中可發(fā)生部分降解[7], 所以出現(xiàn)解析率下降的情況。在控制洗脫流速為0.5~3 mL/min的范圍內(nèi), 隨洗脫流速的增加, 樣品的解析率呈明顯的下降趨勢(shì)(圖6)。調(diào)節(jié)洗脫液pH 在2~8的范圍內(nèi), 當(dāng)洗脫液的pH增大時(shí), 洗脫率呈先增加后降低趨勢(shì)(圖7)。

綜合考慮, 選擇洗脫液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的洗脫液作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)。保持洗脫液pH為5、6、7, 選擇洗脫流速范圍為 0.5~1.5 mL/min作為中心組合, 進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面模型的分析

在對(duì)SA-2型陽(yáng)離子樹(shù)脂純化MAAs樣品的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上, 采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)動(dòng)態(tài)吸附優(yōu)化實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 SA-2型陽(yáng)離子樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

對(duì)表3中SA-2樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附響應(yīng)面優(yōu)化數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析: 得到關(guān)于SA-2型陽(yáng)離子樹(shù)脂對(duì)MAAs樣品吸附率的二次多項(xiàng)式回歸模型方程為:(%)=78.76–0.095–0.22–2.41–0.13+0.45+0.70–1.702–1.332–4.032。

對(duì)動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行方差分析: 分析結(jié)果見(jiàn)表4, 由表可知, 模型=104.78>0.01, 模型<0.000 1,表明實(shí)驗(yàn)回歸模型極顯著;失擬=2.49<0.05(9.3), 失擬項(xiàng)=0.1993>0.05, 表示模型的失擬度不顯著, 模型矯正系數(shù)2Adj=0.983 2, 這說(shuō)明有98.32%的響應(yīng)值能用該模型來(lái)解釋, 僅有1.68%的變異無(wú)法解釋此模型。模型的復(fù)相關(guān)數(shù)2=0.992 6這進(jìn)一步說(shuō)明模型擬合優(yōu)度好。

表4 吸附實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析

注 : *差異顯著,<0.05; **差異極顯著,<0.01.下同

表5 吸附試驗(yàn)回歸模型各因素顯著性檢驗(yàn)

對(duì)動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)建立回歸模型并對(duì)其各因素的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn), 檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表可知, 模型中一次項(xiàng), 二次項(xiàng)2、2、2以及交互項(xiàng)對(duì)吸附率有極顯著影響, 其余各因素影響不顯著(>0.05)。根據(jù)模型數(shù)據(jù)分析可知, 三因素對(duì)吸附率的影響因素順序依次為:>>, 吸附優(yōu)化工藝為: 上樣液質(zhì)量濃度3 g/L、上樣流速為1.5 mL/min、上樣液pH為6。此時(shí), 吸附效率最佳, 吸附率達(dá)79.21%。模型優(yōu)化后回歸方程為:

(%)=–50.20800+4.26600+2.37450+43.68675

–0.26000+0.45000+1.39500

–1.700252–5.331002–4.032752

圖8為上樣流速與上樣液pH兩因素交互作用對(duì)吸附率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖。由圖可知, 曲面在上樣液質(zhì)量濃度一定的情況下, 對(duì)上樣流速與上樣液pH兩因素對(duì)吸附率的影響, 兩因素的作用因素極顯著(<0.01)。在上樣液pH一定的前提下, 上樣流速在0.51.5 mL/min范圍內(nèi)變化時(shí)樣品吸附率值隨上樣流速的增大呈增大趨勢(shì), 上樣流速為1.5 mL/min時(shí), 樣品吸附率達(dá)到最大值; 當(dāng)上樣流速控制一定時(shí), 隨著上樣液pH的增大, 樣品吸附率響應(yīng)值呈先增大后減小的趨勢(shì), 在pH為5~7范圍內(nèi), 取得最大值。通過(guò)吸附模型方程的逆矩陣得到吸附率最大預(yù)測(cè)值為78.76%, 在此條件下的最佳優(yōu)化工藝為: 上樣液質(zhì)量為3 g/L、上樣流速為1.5 mL/min、上樣液pH為6。使用該優(yōu)化條件下做驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn), 得到吸附率79.21%±1.02%。而這與預(yù)測(cè)值僅相差了0.45%,據(jù)此說(shuō)明該模型可信度高。

2.2.4 動(dòng)態(tài)解析實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面模型的分析

在對(duì)SA-2型陽(yáng)離子樹(shù)脂純化MAAs樣品的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上, 采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)解析響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚15]。綜合考察各因素間的相互影響并優(yōu)化純化解析工藝。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表6。

對(duì)表6中SA-2樹(shù)脂動(dòng)態(tài)解析響應(yīng)面優(yōu)化數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析: 得到關(guān)于SA-2型陽(yáng)離子樹(shù)脂對(duì)MAAs樣品吸附率的二次多項(xiàng)式回歸模型方程為:

(%) =62.76–4.88–2.56+2.85–2.82+0.32

+2.48–12.212–2.502–5.872

對(duì)動(dòng)態(tài)解析實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行方差分析: 分析結(jié)果見(jiàn)表7, 由表可知, 模型=25.12>0.01, 模型< 0.0002, 表明實(shí)驗(yàn)回歸模型極顯著;失擬=2.69<0.05(9.3),失擬項(xiàng)=0.1818>0.05, 表示模型的失擬度不顯著。模型矯正系數(shù)2Adj0.9322, 這說(shuō)明有93.22%的響應(yīng)值能用該模型來(lái)解釋, 僅有6.78%的變異無(wú)法解釋此模型。模型的復(fù)相關(guān)數(shù)2=0.9703, 這進(jìn)一步說(shuō)明模型擬合優(yōu)度好。

表6 SA-2型陽(yáng)離子樹(shù)脂動(dòng)態(tài)解析優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表7 解析實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析

注 : 復(fù)相關(guān)系數(shù)2=0.9703; 模型矯正系數(shù)2Adj=0.9322; 信噪比=14.739

表8為對(duì)解析模型進(jìn)行的顯著性檢驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表所示: 模型中一次項(xiàng)、二次項(xiàng)2、2、2以及交互相對(duì)解析率有極顯著影響。其余項(xiàng)的影響均不顯著。各因素對(duì)樣品解析率的影響順序?yàn)? 洗脫液pH>洗脫液流速>洗脫液質(zhì)量濃度。模型回歸方程為:

%=62.76–2.41+0.7–1.72–1.332–4.032

圖9為洗脫流速()和洗脫液pH()對(duì)解析率影響交互作用的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖所示, 在洗脫液質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為3%不變的情況下, 洗脫流速在0.5~1.5 mg/mL時(shí), 隨著洗脫流速的增大, 洗脫液對(duì)樣品MAAs的解析率呈下降趨勢(shì), 當(dāng)洗脫流速保持不變時(shí), 隨著洗脫液pH的增大, 樣品MAAs的解析率呈先增大后緩慢減小趨勢(shì)。

采用Design-Expert 8.0 軟件計(jì)算模型方程的逆矩陣, 得到樣品解析率的最大預(yù)測(cè)值為65.21%, 此時(shí)最佳工藝條件為: 洗脫液體積分?jǐn)?shù)為3%, 洗脫流速為1 g/L, 洗脫液pH為7。選取該工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn), 得到樣品MAAs的解析率為64.02%±1.27%, 與預(yù)測(cè)值相比, 相對(duì)誤差僅為1.19%。說(shuō)明該工藝條件下解析實(shí)驗(yàn)回歸模型有效。

2.3 MAAs化合物抗紫外輻射活性分析

實(shí)驗(yàn)選用大腸桿菌及金黃色葡萄球菌進(jìn)行紫外輻照模型, 實(shí)驗(yàn)前首先對(duì)MAAs樣品本身是否具有抑菌作用進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。

由表9統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知, 將MAAs樣品加入到生理鹽水中作為稀釋液涂布大腸桿菌、金黃色葡萄球菌中, 培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)活菌個(gè)數(shù)。與對(duì)照組相比活菌數(shù)無(wú)顯著性差異(>0.05)。說(shuō)明MAAs化合物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌本身均無(wú)顯著抑制作用, 可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖10為大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的存活曲線(xiàn)圖。由圖可知, 隨著紫外輻照時(shí)間的延長(zhǎng), 大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的存活率顯著降低。而添加了一定濃度MAAs的樣品組較空白對(duì)照組相比, 在相同輻照劑量的情況下, 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的存活率明顯高于空白對(duì)照組。例如: 以輻照時(shí)間10 min為例, MAAs樣品組較空白對(duì)照組而言, 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌種存活率分別提高了39.10%、40.58%。由此可知, 樣品MAAs可以有效抑制紫外輻射而造成的損傷, 延緩菌種的失活速度。這可能是由于類(lèi)菌孢素氨基酸這類(lèi)物質(zhì)在紫外中波長(zhǎng)段UVA (320~400 nm)處及中波長(zhǎng)段UVB (275~320 nm)處具有天然的紫外吸收作用, 從而有效的抵抗紫外線(xiàn)的輻射作用[17-18]。這與葉翠芳等人研究的類(lèi)孢菌素氨基酸具有抗紫外輻射活性作用結(jié)果相一致[19-20]。

表8 解析試驗(yàn)回歸模型各因素顯著性檢驗(yàn)

注 : *差異顯著,<0.05; **差異極顯著,<0.01

表9 MAAs對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌作用

注 :>0.05, 差異無(wú)顯著性

3 結(jié)論

(1) 本文通過(guò)靜態(tài)動(dòng)力學(xué)比較5種樹(shù)脂的吸附率解析率, 篩選出SA-2型陽(yáng)離子樹(shù)脂作為純化紫菜類(lèi)菌孢素氨基酸MAAs的最佳樹(shù)脂。

(2) 采用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)了SA-2型陽(yáng)離子樹(shù)脂純化MAAs的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)吸附于解析工藝模型并優(yōu)化了工藝條件, 對(duì)各因素間的交互影響作用建立二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型, 通過(guò)響應(yīng)面和等高線(xiàn)交互分析確定: 各因素對(duì)吸附率的影響因素順序?yàn)? 上樣液pH>上樣流速>上樣液質(zhì)量濃度; 吸附的最佳工藝條件為: 上樣液質(zhì)量濃度為3 g/L、上樣流速為1 mL/min、上樣液pH為6的條件下吸附率達(dá)79.21%。各因素對(duì)解析率的影響因素順序?yàn)? 洗脫液pH>洗脫流速>洗脫液體積分?jǐn)?shù); 解析最佳工藝條件為洗脫液體積分?jǐn)?shù)為3%的氨水、洗脫流速為1.5 mL/min、洗脫液pH為6, 在此條件下, 解析率可達(dá)64.02%。

(3) 經(jīng)SA-2樹(shù)脂純化后的MAAs樣品用于大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的體外抗紫外輻射實(shí)驗(yàn), 對(duì)比在相同輻射劑量處理后菌種的存活率可知, 紫菜中MAAs化合物能有效緩解因紫外線(xiàn)造成的損傷, 具有顯著的抵抗紫外輻射活性。

[1] Rastogi R P, Incharoensakdi A. UV radiation-induced biosynthesis, stability and antioxidant activity of mycosporine-like amino acids (MAAs) in a unicellular cyanobacteriumsp. CU2556[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2014, 130: 287-292.

[2] Ha S Y, La H S, Min J O, et al. Photoprotective function of mycosporine-like amino acids in a bipolar diatom (): evidence from ultraviolet radiation and stable isotope probing [J]. Diatom Research, 2014, 29(4): 399-409.

[3] Cui H X, Cheng F R, Xu D H, et al. The Optimization of the Extraction-Purification Process of the Total Anthocyanin from the Purple-Fleshed Sweet Potato[C]// Medicine and Biopharmaceutical: Proceedings of the 2015 International Conference. 2016: 963-971.

[4] Miyamoto K T, Komatsu M, Ikeda H. Discovery of gene cluster for mycosporine-like amino acid biosynthesis from Actinomycetales microorganisms and production of a novel mycosporine-like amino acid by heterologous expression[J]. Applied and environmental microbiology, 2014, 80(16): 5028-5036.

[5] 許志恒. 紫菜中抗紫外線(xiàn)活性物質(zhì)的提取及其性質(zhì)的研究[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2010. Xu Zhiheng. Extraction and characterization of anti-ultraviolet Substances fromAbstract[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué), 2010.

[6] 金寧寧, 張朝輝, 李八方, 等. 江蘺中類(lèi)菌孢素氨基酸(MAAs)分離純化及其成分分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2011, 35(12): 1829-1836. Jin Ningning, Zhang Zhaohui, Li Bafang, et al. Study on the isolation, purification and composition analysis of mycosporine-like amino acid(MAAs) in Gracilaria changii[J]. Journal of Fisheries of China, 2011, 35(12): 1829-1836.

[7] 金寧寧, 張朝輝, 李八方. 江蘺中類(lèi)菌孢素氨基酸 (MAAs)成分分析及提取研究[J]. 海洋科學(xué), 2012, 36(3): 74-80. Jin Ningning, Zhang Zhaohui, Li Bafang, et al.The constitutes and extraction analysis of mycosporine-like amino acid (MAAs) in the Gracilariaceae[J]. Marine Sciences, 2012, 36(3): 74-80.

[8] De la Coba F, Aguilera J, Figueroa F L, et al. Antioxidant activity of mycosporine-like amino acids isolated from three red macroalgae and one marine lichen[J]. Journal of Applied Phycology, 2009, 21(2): 161-169.

[9] 牛美英, 張朝輝, 高明, 等. 麒麟菜中類(lèi)菌孢素氨基酸(MAAs)提取工藝的優(yōu)化研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 創(chuàng)新版 (中), 2014 (7): 42-45. Niu Meiying, Zhang Zhaohui, Gao Ming, et al. Optimization the extraction process of mycosporine amino acids from[J]. Academic Periodical of Farm Products Processing, 2014 (7): 42-45.

[10] Shrikhande A J, Race E J, Wightman J L D, et al. Process for extraction, purification and enrichment of polyphenolic substances from whole grapes, grape seeds and grape pomace: U.S. Patent 6, 544, 581[P]. 2003-4-8.

[11] Zhao P, Qi C, Wang G, et al. Enrichment and purification of total flavonoids from cortex juglandis mandshuricae extracts and their suppressive effect on carbon tetrachloride-induced hepatic injury in Mice[J]. Journal of Chromatography B, 2015, 1007: 8-17.

[12] Maran J P, Manikandan S. Response surface modeling and optimization of process parameters for aqueous extraction of pigments from prickly pear () fruit[J]. Dyes and Pigments, 2012, 95(3): 465-472.

[13] 徐艷, 孫雪萍, 張秀國(guó), 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化香港巨牡蠣蛋白酶解工藝的研究[J]. 海洋科學(xué), 2015, 39(3): 42-47.Xu Yan, Sun Xueping, Zhang Xiuguo, et al. Improvement ofhydrolysis by response surface methodology [J]. Marine Sciences, 2015, 39(3): 42-47.

[14] 吳繼明, 徐春芝, 潘宗岱, 等. 朗伯-比爾定律在生化分析儀中的應(yīng)用[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 34(B12): 128. Wu Jiming, Xu Chunzhi, Pan Zongdai, et al [J]. The application of Lambert beer's law in the biochemical analyzer[J]. International Journal of Laboratory Medicine, 2013, 34(B12): 128.

[15] Silva E M, Rogez H, Larondelle Y. Optimization of extraction of phenolics from Inga edulis leaves using response surface methodology [J]. Separation and Purification Technology, 2007, 55(3): 381-387.

[16] 周孫林, 陳華新, 姜鵬, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化重組大腸桿菌生物合成別藻藍(lán)蛋白(holo-apcA)的發(fā)酵條件[J]. 海洋科學(xué), 2015, 39(4): 56-63.Zhou Sunlin, Chen Huaxin, Jiang Peng, et al. Optimization of fermentation conditions for production of Holo-α-allophycocyanin (holo-apcA) by recombinant Escherichia coli using response surface methodology[J]. Marine Sciences, 2015, 39(4): 56-63.

[17] 郭賡藝. 粒毛盤(pán)菌 YM404 黑色素的純化, 結(jié)構(gòu)及抗紫外輻射活性研究[D]. 合肥: 合肥工業(yè)大學(xué), 2013. Guo Gengyi. Purification, structure and anti-radiation activity of melanin from Lachnum YM404 [D]. 合肥: 合肥工業(yè)大學(xué), 2013.

[18] 王洪媛, 江曉路, 任虹, 等. 抗 UV-B輻射菌紫外吸收代謝產(chǎn)物分析及其抗紫外輻射活性研究[J]. 中國(guó)海洋藥物, 2006, 25(4): 1-5. Wang Hongyuan, Jiang Xiaolu, Ren Hong, et al. Analysis of the UV absorbing constituents of the metabolites from UV-B tolerance bacteria and study on its anti-ultraviolet mechanism[J].Chinese Journal of Marine Drugs, 2006, 25(4): 1-5.

[19] 杜寧, 高天翔, 繆錦來(lái), 等. 4 種南極冰藻中抗紫外輻射活性化合物類(lèi)菌胞素類(lèi)氨基酸(MAAs)的初步研究[J]. 中國(guó)海洋藥物, 2007, 26(4): 5-10. Du Ning, Gao Tianxiang, Liao Jinlai, et al. Preliminary study on the antiultraviolet irradiation active sub-stances of mycosporine-like amino acids from four kinds of Antarctic ice microalgae[J].Chinese Journal of Marine Drugs, 2007, 26(4): 5-10.

[20] 葉翠芳. 紫菜提取物及其抗紫外輻射活性的研究[D]. 廣州: 暨南大學(xué), 2012.Ye Cuifang. Studies on the anti-ultraviolet activity of Laver extracts[D]. 廣州: 暨南大學(xué), 2012.

Optimization of purification process ofmycosporine-like amino acid fromand study on its anti- ultraviolet activity

YING Rui, ZHANG Zhao-hui, DUAN Xiao-shan, ZHAO Xue, HOU Hu, LI Ba-fang

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266023, China)

Objective: To explore the optimal techniques in the separation of mycosporine-like amino acids (MAAs) inwith cation-exchange resins and the study on its anti-ultraviolet activity after purification.Method: In the screening cation-exchange resin through the static adsorption and desorption analytical experiment, response-surface methodology was employed to establish a mathematical regression model with the dynamic adsorption and desorption in the single-factor experiments for SA-2. The ultraviolet-radiation models (UVA and UVB) when compared with blank samples showed that the survival rates of the MAAs groups ofandincreased; this proved that the MAAs after purification had certain anti-ultraviolet activity.Result: SA-2 was found to be the most suitable resin for the mycosporine-like amino acid purification; the obtained adsorption and desorption rates were 86% and 56.63%, respectively. The optimum conditions for the purification were obtained when the sample containing 3 g/L MAAs at pH 6 was mounted onto a column at a flow rate of 1 mL/min; further, it was eluted with 3% ammoniumhydroxide to pH 6 at a flow rate of 1.0 mL/min. The purification process yielded an adsorption and desorption rate of 79.21% and 64.02%, respectively. After the purification of MAAs sample, it had significant resistance to the ultraviolet radiation and the deactivation rate for.and.decreased to 39.10% and 40.58%, respectively.

; mycosporine-like amino acids; SA-2 resin; purification; response surface; ultraviolet-resistant activity

TS201.2

A

1000-3096(2017)02-0071-10

10.11759/hykx20160811002

2016-08-11;

2016-11-26

國(guó)家自然科學(xué)基金(31272705); 海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201505022-5)

應(yīng)銳(1989-), 女, 研究生, 研究方向: 海洋活性物質(zhì), 電話(huà): 18765998051, Email: yingruiouc@163.com ; 張朝輝(1968-), 通信作者, 男, 副教授, 研究方向: 水產(chǎn)化學(xué)、海洋生物活性成分及水產(chǎn)品加工, Email: zhangzhh@ouc.edu.cn

Aug.11, 2016

[National Natural Science Foundation of China, No.31272705; Public Science and Technology Research Funds projects of ocean, No.201505022-5]

(本文編輯: 康亦兼)