夏小婷，賈 媛，趙 明，熊 雄，黨瑞華，藍(lán)賢勇，黃永震，陳 宏，雷初朝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 宜昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北 宜昌 443000；3. 宜昌市畜牧技術(shù)推廣站，湖北 宜昌 443000)

夷陵黃牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性研究

夏小婷1，賈 媛1，趙 明2，熊 雄3，黨瑞華1，藍(lán)賢勇1，黃永震1，陳 宏1，雷初朝1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 宜昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北 宜昌 443000；3. 宜昌市畜牧技術(shù)推廣站，湖北 宜昌 443000)

【目的】為了探究夷陵黃牛的母系起源與遺傳多樣性?！痉椒ā坎捎肞CR擴(kuò)增、測(cè)序及生物信息學(xué)方法?！窘Y(jié)果】在27頭夷陵黃牛mtDNA D-loop區(qū)共檢測(cè)到54個(gè)變異位點(diǎn)，界定了13個(gè)mtDNA單倍型，單倍型多樣度為0.7720，平均核苷酸多樣度為0.0228，表明夷陵黃牛具有比較豐富的遺傳多樣性。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示夷陵黃牛具有普通牛和瘤牛兩大母系起源?！窘Y(jié)論】夷陵黃牛受瘤牛的影響大，屬于中國(guó)南方黃牛，具有普通牛與瘤牛的種質(zhì)特征。

夷陵黃牛；mtDNA D-loop；遺傳多樣性；起源

牛的馴化進(jìn)程促進(jìn)了人類農(nóng)業(yè)社會(huì)歷史的發(fā)展。中國(guó)黃牛根據(jù)體態(tài)特征可分為有峰、低峰、無(wú)峰三種，按照地理分布分為北方的蒙古組(北方黃牛)、黃河中下游和淮河流域的黃淮組(中原黃牛)、南方長(zhǎng)江和珠江流域的長(zhǎng)珠組(南方黃牛)三組[1,2]。目前，對(duì)我國(guó)地方黃牛品種的起源、進(jìn)化和遺傳多樣性，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)做了大量的研究工作，在Y染色體分子遺傳多態(tài)性[3,4]、血液蛋白多態(tài)性[5]及線粒體DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(mtDNA RFLP)[1]等多個(gè)層面的研究結(jié)果均支持我國(guó)黃牛多元起源的觀點(diǎn)，普通牛(Bos taurus)主要影響北方黃牛，瘤牛(Bos indicus)由南向北主要影響南方黃牛，而中原地區(qū)的黃牛同時(shí)受到普通牛和瘤牛的影響。

線粒體DNA控制區(qū)(D-loop區(qū))一直是研究家畜母系遺傳的熱點(diǎn)。高等動(dòng)物的線粒體DNA(mtDNA)是共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈DNA分子，其遺傳過(guò)程嚴(yán)格遵守單性母性遺傳方式，且mtDNA的變異主要來(lái)源于突變而非重組，可以真實(shí)地反映家畜的母系起源，在家畜的品種起源、遺傳分化和親緣關(guān)系等方面得到了廣泛的應(yīng)用[6-9]。Lei等[10]對(duì)我國(guó)28個(gè)地方黃牛品種的線粒體D-loop序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)mtDNA在不同牛種間存在豐富的遺傳多樣性，揭示我國(guó)黃牛主要為普通牛和瘤牛起源。

湖北宜昌市古稱夷陵，位于湖北省西南部，地處長(zhǎng)江上游與中游交界處。夷陵黃牛是宜昌地區(qū)特有的地方黃牛群體，其形成過(guò)程可追溯到夏商時(shí)期[11]。夷陵黃牛體質(zhì)粗壯，結(jié)構(gòu)勻稱，耐粗飼，屬肉役兼用型，自古以來(lái)就是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要役力。由于夷陵黃牛是近年才發(fā)現(xiàn)的地方黃牛群體，其遺傳多樣性研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)夷陵黃牛mtDNA D-loop區(qū)全序列進(jìn)行分析，以探究夷陵黃牛的母系遺傳多樣性，為夷陵黃牛的保種和開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集27頭湖北夷陵黃牛耳組織樣本，用75%酒精保存，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增測(cè)序

利用酚-氯仿法提取基因組DNA。線粒體DNA D-loop全序列采用雷初朝等[13]設(shè)計(jì)的引物，正鏈序列為：5′- CTGCAGTCTCACCATCAACC-3′; 反鏈序列為:5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，59℃退火60 s，72℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。采用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將符合測(cè)序要求的PCR產(chǎn)物送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析方法

利用DNASTAR中的SeqMan程序進(jìn)行同源序列比對(duì)，并進(jìn)行人工校正，以確保所測(cè)序列的可靠性。用DNASP 5.0統(tǒng)計(jì)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)、單倍型數(shù)量、單倍型多樣度、核苷酸多樣度、平均核苷酸差異等。用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 夷陵黃牛mtDNA D-loop區(qū)核苷酸變異與單倍型多樣性

對(duì)27頭夷陵黃牛D-loop區(qū)全序列的分析表明，21頭黃牛 D-loop區(qū)長(zhǎng)度為910 bp，5頭黃牛D-loop區(qū)長(zhǎng)度為911 bp，1頭黃牛D-loop區(qū)長(zhǎng)度為912 bp，這是由于D-loop區(qū)存在堿基的插入與缺失引起的。共發(fā)現(xiàn)27頭夷陵黃牛D-loop區(qū)全序列的變異位點(diǎn)為54個(gè)，占核苷酸總數(shù)的5.93%，其中轉(zhuǎn)換53個(gè)(C/T轉(zhuǎn)換33個(gè)，A/G轉(zhuǎn)換20個(gè))，顛換1個(gè)(C/G顛換)。A、T、C、G的含量分別為33.3%、28.3%、24.8%、13.6%，C+G平均含量為38.4%。利用DNASP 5.0軟件比對(duì)分析27頭夷陵黃牛mtDNA D-loop序列，共發(fā)現(xiàn)13種單倍型(圖1)，其中7個(gè)屬于普通牛單倍型，6個(gè)屬于瘤牛單倍型。在這13個(gè)單倍型中，有13個(gè)個(gè)體屬于YL2單倍型，占48.1%。平均核苷酸差異(k)為20.6895，單倍型多樣度(Hd)為0.7720，平均核苷酸多樣度(Pi)為0.0228。根據(jù)Tajima's D值1.8162(P>0.05)可知，所有的變異在進(jìn)化過(guò)程中均遵循中性進(jìn)化模型。

圖1 夷陵黃牛13個(gè)mtDNA D-loop單倍型及其多態(tài)位點(diǎn)

參考Loftus等[6]發(fā)表的瘤牛序列(No. L27733)定義變異類型。

“.”代表與第一條序列相同，“*”代表堿基的插入/缺失。

2.2 夷陵黃牛系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

為了研究各單倍型間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，根據(jù)GenBank發(fā)布的歐洲普通牛(No.V00654)和印度瘤牛(No.L27733)作為參考序列，用MEGA5.0軟件對(duì)夷陵黃牛的13個(gè)單倍型構(gòu)建鄰接樹(shù)(圖2)。結(jié)果表明，夷陵黃牛明顯分為普通牛和瘤牛兩大分支，說(shuō)明夷陵黃牛是普通牛和瘤牛的混合母系起源。

圖2 基于夷陵黃牛13個(gè)mtDNA D-loop單倍型構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹(shù)

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)有關(guān)地方黃牛品種mtDNA D-loop區(qū)序列的核苷酸變異分析的報(bào)道較多[1, 7, 8, 10, 12-19]，但有關(guān)夷陵黃牛mtDNA D-loop區(qū)序列遺傳多樣性研究尚屬空白。本研究通過(guò)對(duì)夷陵黃牛27個(gè)個(gè)體mtDNA D-loop區(qū)910-912 bp序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，堿基A、T、C、G的平均百分比為33.3%、28.3%、24.8%和13.6%，說(shuō)明其富含A、T堿基；共有54個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生突變，其中轉(zhuǎn)換53個(gè)、顛換1個(gè)。核苷酸多樣度(Pi)和單倍型多樣度(Hd)是衡量群體遺傳變異的重要指標(biāo)。雷初朝等[12]通過(guò)分析中國(guó)8個(gè)黃牛品種mtDNA D-loop區(qū)序列的遺傳多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)其Pi值為0.0055～0.0539；蔡欣[17]分析中國(guó)17個(gè)黃牛品種的Pi值為0.0268。本研究發(fā)現(xiàn)夷陵黃牛的平均Pi值為0.0228，表明夷陵黃牛的mtDNA具有比較豐富的遺傳多樣性。本研究發(fā)現(xiàn)夷陵黃牛平均單倍型多樣度為0.7720，與蔡欣[17]研究的中國(guó)17個(gè)黃牛品種的平均單倍型多樣度(0.919)相比要低一些，這可能與宜昌地處環(huán)境封閉、不具備大量引進(jìn)外地家畜的條件有關(guān)[11]。在27個(gè)夷陵黃牛個(gè)體中，9個(gè)普通牛起源的個(gè)體(占33.33%)共享7個(gè)單倍型，18個(gè)瘤牛起源的個(gè)體(占66.67%)共享6個(gè)單倍型，表明夷陵黃牛受瘤牛的影響更大。周艷等[18]對(duì)中國(guó)部分南方黃牛mtDNA D-loop區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，在40個(gè)黃牛個(gè)體中，14個(gè)普通牛起源的個(gè)體共享11個(gè)單倍型，26個(gè)瘤牛起源的個(gè)體共享6個(gè)單倍型，表明南方黃牛受瘤牛的影響更大?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)夷陵黃牛mtDNA遺傳多樣性比較豐富，更偏向于南方黃牛，具有普通牛和瘤牛兩大母系起源，且具有普通牛與瘤牛的種質(zhì)特征。

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Genetic Diversity of Mitochondrial DNA D-oop Region in Yiling Cattle

XIA Xiao-ting1, JIA Yuan1, ZHAO Ming2, XIONG Xiong3, DANG Rui-hua1, LAN Xian-yong1, HUANG Yong-zhen1, CHEN Hong1, LEI Chu-zhao1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China; 2.AnimalDiseasePreventionandControlCenterofYichang,Yichang,Hubei443000,China; 3.PopularizationandServiceStationofAnimalScienceandTechnologyofYichang,Yichang,Hubei443000,China)

[Objective] To analyze the maternal origin and genetic diversity of Yiling cattle. [Method] Using PCR, sequencing and bioinformatics methods. [Result] The complete mitochondrial DNA D-loop sequences from 27 individuals of Yiling cattle revealed that 54 mutation sites and 13 haplotypes were found, haplotype diversity was 0.7720 and nucleotide diversity was 0.0228, showing rather abundant mitochondrial genetic diversity in Yiling cattle. Phylogenetic analysis showed that the maternal origins of Yiling cattle were fromBostaurusandBosindicus. [Conclusion] Yiling cattle, which was mainly affected byBosindicus, belongs to Southern cattle type of China, with the germplasm characteristics of bothBosTaurusandBosindicus.

Yiling cattle；mitochondrial DNA D-loop；genetic diversity；origin

2016-11-20 接收日期：2016-12-05

國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-38)資助。

夏小婷(1991-)，女，山東威海人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳資源研究。

*通訊作者：雷初朝(1968-)，男，湖南常寧人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事牛遺傳資源研究。

S823

A

1001-9111(2017)01-0004-04