潘曉莉，李代禧，魏冬青

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胰島素活性結(jié)構(gòu)在水合離子液體中的穩(wěn)定性

潘曉莉1，李代禧1，魏冬青2

（1上海理工大學(xué)食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093；2上海交通大學(xué)微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

離子液體以其獨特的、可修飾的分子結(jié)構(gòu)以及優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)被應(yīng)用于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性研究。采用分子動力學(xué)模擬方法及微量熱法，研究熱敏性蛋白藥物胰島素在不同水質(zhì)量分數(shù)下水合離子液體中活性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并深入分析離子液體與胰島素之間的相互作用及水分子與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，當水質(zhì)量分數(shù)低于25.00%時，胰島蛋白的熱變性溫度能保持在68℃以上。且通過模擬分析得出，含水量25.00%的水合離子液體體系中，大量陰、陽離子在胰島蛋白表面聚集，并通過較強的靜電相互作用吸附在其表面，從而對蛋白質(zhì)的活性結(jié)構(gòu)展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定效果。結(jié)合宏觀實驗研究及微觀動力學(xué)計算闡釋了不同水含量的離子液體穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用機理，并為離子液體對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用研究提供了一種新的分析方法。

離子液體；胰島素；水質(zhì)量分數(shù)；蛋白質(zhì)穩(wěn)定性；分子模擬；微量熱法

引 言

離子液體作為一種新型“綠色溶劑”，具有液相存在的溫度范圍寬、溶解范圍廣、蒸氣壓極低以及熱穩(wěn)定性好等特點，并被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性研究[1-2]。離子液體有很多種，其中咪唑類離子液體在蛋白質(zhì)的溶解及穩(wěn)定的應(yīng)用中有著獨特的優(yōu)勢[3]。親水性離子液體能與水完全互溶，而且在離子液體中加入少量的水能較好地保持純離子液體的基本特性[4-5]。有研究表明，添加25%左右的水分既能維持離子液體的溶劑環(huán)境，又不會改變體系中蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)[6]。Fujita[4]小組也用實驗證實了這一觀點，他們用圓二色譜法研究溶解在含水30%的膽堿磷酸二氫鹽（[chol][dhp]）中細胞色素C（Cyt C）的結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)Cyt C的本體構(gòu)象并沒有發(fā)生改變；相反地，在含水80%的[chol][dhp]中，Cyt C的基本性質(zhì)發(fā)生了較大的變化。這表明含水量較少的水合離子液體對蛋白質(zhì)的活性結(jié)構(gòu)同樣具有一定的穩(wěn)定效果。

據(jù)文獻[7-8]報道，1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽（[Amim][Cl]）及1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽（[Emim][OAC]）對蛋白質(zhì)的溶解有著顯著的效果，而關(guān)于這兩種離子液體對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性影響的相關(guān)研究卻鮮有報道。鑒于此，本文選擇不同水質(zhì)量分數(shù)的水合[Amim][Cl]和水合[Emim][OAC]作為溶劑，以典型的熱敏性蛋白藥物胰島素[9]作為模型蛋白，采用分子動力學(xué)模擬方法[10]（molecular dynamic, MD），從分子層面上探究水合離子液體中的水質(zhì)量分數(shù)與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性之間的關(guān)系及其作用機理。并通過微量熱法[11]（microcalorimetry）分析在不同水質(zhì)量分數(shù)的水合[Emim][OAC]中熱敏性蛋白藥物胰島素?zé)岱€(wěn)定性的變化，以期為功能性離子液體對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定研究提供一定的指導(dǎo)作用。

1 實驗材料和方法

1.1 試劑與儀器

豬胰島素，白色晶體，徐州萬邦金橋制藥有限公司，市售分析純；[Emim][OAC]，淡黃色液體，中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，純度大于97%；納瓦級高靈敏差示掃描量熱儀（Nano-DSC），美國TA Instrument。

1.2 實驗方法

首先配制水質(zhì)量分數(shù)分別為16.67%、20.00%、25.00%、33.33%和50.00%的5種水合[Emim][OAC]溶液。然后準確稱量一定量的豬胰島素粉末，溶解于不同含水量的水合離子液體中，使胰島素濃度為0.30 mmol·L-1。在參比池和樣品池中均注入水合離子液體，掃描溫度范圍為25～100℃，升溫速率為1℃·min-1。掃描結(jié)束清洗后，分別將水合離子液體和溶有胰島素的水合離子液體注入?yún)⒈瘸睾蜆悠烦?，采用相同的條件進行升溫掃描。采用TA NanoAnalyze 3.4.0軟件進行數(shù)據(jù)記錄和處理，DSC曲線的峰值點所對應(yīng)的溫度為蛋白質(zhì)的熱變性溫度（值）。

1.3 分子動力學(xué)模擬

1.3.1 分子結(jié)構(gòu)的準備 分子動力學(xué)研究選用兩種親水性咪唑類離子液體：[Amim][Cl]及[Emim][OAC]。離子液體的初始分子結(jié)構(gòu)（見圖1）均取自于Chemical數(shù)據(jù)庫，并利用Gaussian 09軟件包在HF/6-31G*方法下進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到最終的離子液體結(jié)構(gòu)[12]。

胰島素的初始結(jié)構(gòu)來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB ID:3inc[13]，見圖2），它由A、B兩條肽鏈共51個氨基酸組成，通過兩個二硫鍵共價鍵合形成單體結(jié)構(gòu)，是一種典型的球狀蛋白質(zhì)。

1.3.2 模擬過程 分子動力學(xué)模擬方法采用Gromacs 5.0.5[14]軟件包，其中胰島素選用Amber99sb-ildn[15]分子力場，離子液體選用Amber[16]通用分子力場，水分子選用Tip4p[17]模型。在本次模擬中，時間步長設(shè)定為2 fs，范德華相互作用和靜電相互作用的截斷均設(shè)為1.0 nm，并采用粒子網(wǎng)格埃瓦德統(tǒng)計方法(particle mesh Ewald, PME)[18]修正靜電相互作用力，以LINCS[19]算法約束成鍵相互作用。

建立6 nm×6 nm×6 nm的周期性體系，分別添加不同數(shù)目的離子液體和水分子，構(gòu)建水質(zhì)量分數(shù)為0.00%、10.00%、16.67%、20.00%、25.00%、33.33%和50.00%共7個不同的溶液體系，所有體系均用Na+平衡其凈電荷，其組成如表1所示。采用最速下降法[20]進行體系能量最小化，接著采用Berendsen[21]方法控制體系的壓力，velocity-rescale[22]方法控制體系溫度為300 K，在NPT系綜下進行10 ns的限制性分子動力學(xué)模擬，然后在相同系綜下進行150 ns的常規(guī)分子動力學(xué)模擬，得到穩(wěn)定的胰島蛋白-水合離子液體混合溶液。選取最后10 ns的模擬軌跡用于數(shù)據(jù)分析。

表1 不同水質(zhì)量分數(shù)下各體系的詳細組成

2 結(jié)果與討論

2.1 胰島素的結(jié)構(gòu)差異性分析

均方根偏差[23](root mean square deviation, RMSD)可以反映特定構(gòu)象與初始結(jié)構(gòu)的相似程度，其值越低，表明特定構(gòu)象與初始結(jié)構(gòu)的差異性越小[24]。通過計算各體系中胰島素的RMSD值（見圖3）表征不同水質(zhì)量分數(shù)的水合離子液體對胰島素活性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性影響。從圖中可以看出，在水合[Amim][Cl]和水合[Emim][OAC]中，當體系中水的質(zhì)量分數(shù)小于或等于20.00%時，胰島素的RMSD值均保持在0.1左右，這表明與純離子液體相比，加入少量水的離子液體仍能穩(wěn)定胰島蛋白的分子結(jié)構(gòu)。隨著體系中水分子的持續(xù)加入，胰島素的RMSD值略有升高，但當水質(zhì)量分數(shù)大于25.00%時，該值的升高幅度隨著水質(zhì)量分數(shù)的增大明顯上升，但仍低于純水體系中胰島素的RMSD值（0.42 nm）。這表明水分含量的大幅度增加明顯降低了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，但含水量較高的離子液體對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性效果仍優(yōu)于純水體系，這也從另一方面表明在一定程度上增加離子液體的含量有利于提高蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

2.2 胰島素的熱穩(wěn)定性分析

為了深入分析體系中的水分含量對胰島蛋白活性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性影響，采用Nano-DSC測量不同水質(zhì)量分數(shù)的水合[Emim][OAC]中胰島素的值，以表征不同含水量的離子液體體系中蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性變化，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，當體系中水的質(zhì)量分數(shù)小于或等于25.00%時，胰島蛋白的值均保持在68℃以上，說明此時體系中蛋白質(zhì)仍保持較高的熱穩(wěn)定性。隨著體系中水含量持續(xù)增多，胰島蛋白的值呈較大程度的降低趨勢，說明此時蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性隨之大幅度降低。這與圖3得到的趨勢一致，進一步表明離子液體中水含量的增加降低了胰島素的穩(wěn)定性，且說明25.00%左右含水量的水合離子液體仍對蛋白質(zhì)的活性結(jié)構(gòu)具有良好的保護作用。

2.3 離子液體與胰島素之間的相互作用

離子液體通過與胰島素之間的相互作用吸附在其表面，抑制胰島蛋白的伸展或聚集，穩(wěn)定其活性結(jié)構(gòu)。圖5描述了不同水質(zhì)量分數(shù)下，兩種離子液體和胰島素之間的相互作用能。從中可以看出，隨著體系中水分含量的增加，水合[Amim][Cl]和水合[Emim][OAC]中離子液體與胰島素之間的相互作用能逐漸減弱。且當水質(zhì)量分數(shù)大于25.00%時，二者之間的相互作用減弱的幅度增大。這可能是因為當離子液體中水的質(zhì)量分數(shù)較大時，體系中離子液體的濃度較低，胰島素表面吸附的陰、陽離子較少，導(dǎo)致離子液體和胰島蛋白之間的相互作用能較小，離子液體對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用也減弱。圖6描述了不同水分含量的離子液體體系中，胰島素表面與陰、陽離子之間的徑向分布函數(shù)，第1個峰的峰面積表征胰島素表面吸附的離子液體數(shù)目。從圖中可以看出，在水合[Amim][Cl]和水合[Emim][OAC]中，當水質(zhì)量分數(shù)小于或等于25.00%時，第1個峰的峰面積并未發(fā)生較大的變化。說明離子液體中水含量較低時，胰島素表面吸附了一定數(shù)量的陰、陽離子以維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。隨著體系中水質(zhì)量分數(shù)的增大，特別是當水含量大于或等于33.33%時，第1個峰的峰面積呈大幅度降低趨勢，這表明此時胰島素表面吸附的離子液體大幅度減少，二者之間的相互作用能也較大程度地降低（見圖5），進一步驗證水質(zhì)量分數(shù)較大的水合離子液體體系對蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定效果較差。

接觸數(shù)是指分子間發(fā)生相互作用的原子接觸個數(shù)，該參數(shù)被用來表征兩分子之間相互作用的強弱[25]。為了進一步闡釋離子液體與胰島素之間的相互作用強度對胰島蛋白活性結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，分別計算了0.35 nm范圍內(nèi)[26]胰島素與陰離子和陽離子之間的接觸數(shù)（如圖7）。

從圖7可以看出，隨著體系中水的質(zhì)量分數(shù)持續(xù)增加，水合[Amim][Cl]和水合[Emim][OAC]中胰島素與陰、陽離子之間的接觸數(shù)均呈降低趨勢。表明體系中胰島蛋白與離子液體之間的相互作用強度隨著水分含量的增加持續(xù)降低，這與圖5得到的結(jié)果一致。當體系中水的質(zhì)量分數(shù)小于或等于20.00%時，胰島素與離子液體之間的接觸數(shù)呈較小幅度的降低趨勢，蛋白質(zhì)表面仍吸附較多的陰、陽離子形成一個較為完整的離子液體保護層，從而穩(wěn)定胰島蛋白的活性結(jié)構(gòu)。當水質(zhì)量分數(shù)大于25.00%時，胰島素與離子液體之間的接觸數(shù)大幅度降低。這是因為當體系中水分含量較大，離子液體濃度較低時，陰、陽離子幾乎以孤立的粒子狀態(tài)分散在水中，只余留少量的陰、陽離子吸附在蛋白質(zhì)的表面。此時體系中胰島蛋白與離子液體之間的相互作用能也隨之大幅度降低（見圖5）。說明胰島素與離子液體之間的相互作用強度較大程度地影響蛋白質(zhì)的活性結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

(a) between N3 atom on the [Amim]+and the surface of insulin in hy-[Amim][Cl]; (b) between Cl-and the surface of insulin in hy-[Amim][Cl]; (c) between N8 atom on the [Emim]+and the surface of insulin in hy-[Emim][OAC]; (d) between C1 atom on the [OAC]-and the surface of insulin in hy-[Emim][OAC]

2.4 水分子與胰島素之間的相互作用

水分子在穩(wěn)定生物大分子的活性結(jié)構(gòu)方面起著關(guān)鍵性作用[27]。為了分析體系中水分子的含量與胰島素穩(wěn)定性之間的關(guān)系，統(tǒng)計了距離胰島素表面0.35 nm范圍內(nèi)水分子的吸附數(shù)目，并展示于圖8中。并分析不同水質(zhì)量分數(shù)下，體系中胰島素內(nèi)部及胰島素與水分子之間的氫鍵數(shù)目，結(jié)果如圖9所示。

由圖8得出，在水合[Amim][Cl]和水合[Emim][OAC]體系中，隨著體系中水含量的持續(xù)增加，越來越多的水分子在胰島素表面聚集。當水質(zhì)量分數(shù)小于或等于25.00%時，胰島素表面吸附的水分子數(shù)目以較小幅度呈上升趨勢。結(jié)合圖9來看，此時體系中胰島蛋白內(nèi)部的氫鍵數(shù)目均大于32（胰島素初始結(jié)構(gòu)的內(nèi)部氫鍵數(shù)目為36），表明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)仍較為完整。這是因為當水質(zhì)量分數(shù)低于25.00%時，較多的離子液體聚集在胰島蛋白表面形成保護層，從而穩(wěn)定胰島蛋白的二級結(jié)構(gòu)。從圖8還可以看出，當水質(zhì)量分數(shù)大于25.00%時，體系中胰島蛋白表面吸附的水分子數(shù)目大幅度增加。此時，胰島蛋白與水分子之間的氫鍵數(shù)目大幅度上漲，相反地，胰島素的內(nèi)部氫鍵卻呈現(xiàn)出一定程度的降低趨勢（見圖9）。這是因為當體系中胰島素表面被水分子大面積覆蓋[見圖8(b)A, B, C, D]，而水分子對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用極其有限[28]，使得離子液體含量較低的水合離子液體體系中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性逐漸降低。

A, B, C and D were shown by the PyMOL software. A and B represent the water molecules adsorbed onto the surface of insulin in the system of hydrated [Amim][Cl] at water mass fractions as 33.33% and 50.00% respectively; C and D represent the water molecules adsorbed onto the surface of insulin in the system of hydrated [Emim][OAC] at water mass fractions as 33.33% and 50.00% respectively; The linear model part represents the molecular structure insulin; The spherical model part represents the molecular structure of water

3 結(jié) 論

離子液體對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用機制十分復(fù)雜，陰陽離子的特性、蛋白質(zhì)的種類[29]以及離子液體的濃度均會影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定效果。本文利用分子動力學(xué)模擬方法及差示掃描量熱法，從分子間相互作用及熱力學(xué)性質(zhì)方面研究離子液體中的水分含量與胰島蛋白活性結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性之間的關(guān)系。結(jié)果表明：當水合離子液體中的水質(zhì)量分數(shù)小于25.00%時，胰島蛋白能保持較高的熱穩(wěn)定性。此時，體系中仍有較多離子液體主要通過靜電相互作用緊密吸附和覆蓋在胰島素表面，形成保護層包裹住蛋白質(zhì)，進而對胰島蛋白的活性結(jié)構(gòu)展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定效果。

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Bioactive structural stability of insulin in hydrated ionic liquids

PAN Xiaoli1, LI Daixi1, WEI Dongqing2

(1Institute of Food Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China;2State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Ionic liquids, which have unique, modulated molecular structure and excellent physicochemical properties, are applied to study the structural stability of protein. In the present study, insulin was selected as a heat sensitive protein medicine in order to investigate the bioactive structural stability of protein in ionic liquids with different mass fractions of water by using molecular dynamics simulation and microcalorimetry. In order to analyze thoroughly the relationship between the content of water molecules and the protein stability, the interaction energy between the ionic liquids and the insulin was calculated. Finally, the experimental results show that the thermal denaturation temperature of insulin is more than 68℃ when the mass fraction of water is less than 25.00%. Moreover, in the hydrated ionic liquids at the water content as 25.00%, a large number of cations and anions are adsorbed on the surface of insulin owing on the strong electrostatic interaction between the insulin and the ions, which reveals the stabilizing effect of hydrated ionic liquids. Generally, macroscopic experimental study and microscopic dynamics calculation, as attempted by this research, provide a new analytical method to interpret the stabilization mechanism of ionic liquids with different water content for protein.

ionic liquids; insulin; mass fraction of water; stability of protein; molecular simulation; microcalorimetry

10.11949/j.issn.0438-1157.20161499

O 6-39

A

0438—1157（2017）05—2035—07

李代禧。

潘曉莉（1991—），女，碩士研究生。

上海市重點學(xué)科項目(T0503, P0502)；上海市“創(chuàng)新行動計劃”國際科技合作項目(12430702000)；上海市自然科學(xué)基金項目(12ZR1420400)；上海市聯(lián)盟計劃項目 (11XSY23)。

2016-10-26收到初稿，2016-12-21收到修改稿。

2016-10-26.

Prof. LI Daixi,dxli75@126.com

supported by the Leading Academic Discipline Project of Shanghai (T0503, P0502), “Innovation Action Plan” International Science and Technology Cooperation Project of Shanghai (12430702000), the Natural Science Foundation of Shanghai (12ZR1420400) and Alliance Program of Shanghai (11XSY23).