李琳琳+嚴(yán)林+王海春+李成潔+冶成祥+謝永麗

摘要：采用單因素法和L25（55）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行簡單重復(fù)系列PCR（SSR-PCR）反應(yīng)體系優(yōu)化，并對引物退火溫度進(jìn)行篩選，以建立適宜枸杞棉蚜的SSR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。結(jié)果表明，枸杞棉蚜SSR-PCR的優(yōu)化體系總體積為25 μL，包括50 ng模板DNA，1.5U Taq DNA聚合酶，150 μmol/L Mg2+，300 μmol/L dNTPs，0.4 pmol/μL引物，優(yōu)化后的檢測體系更為經(jīng)濟(jì)有效；Ago66引物PCR適宜退火溫度為58 ℃。

關(guān)鍵詞：棉蚜；SSR；單因素試驗(yàn)；正交優(yōu)化

中圖分類號： S435.671文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0040-04

運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)研究蚜蟲已經(jīng)成為熱點(diǎn)問題[1]，棉蚜的分子生物學(xué)研究多集中于棉花型棉蚜和黃瓜型棉蚜，國內(nèi)學(xué)者孟玲等初步應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）研究黃瓜寄主和棉花寄主的棉蚜遺傳多樣性，奠定了一定的基礎(chǔ)[2-3]。鄒晨輝等采用簡單重復(fù)序列（SSR）初步研究了不同地理及季節(jié)的棉花型棉蚜遺傳多樣性[4-6]。國外學(xué)者Fuller等運(yùn)用SSR技術(shù)研究了歐洲、非洲、美洲、亞洲等地區(qū)多個(gè)國家的棉蚜遺傳多樣性，這些棉蚜原寄主涉及棉花、葫蘆科、棉花、茄子、馬鈴薯、辣椒、花椒、梨樹和柑橘樹[7-9]。枸杞是重要的藥用經(jīng)濟(jì)作物，棉蚜危害嚴(yán)重，國內(nèi)外尚缺少對原寄主是枸杞的棉蚜分子生物學(xué)方面的研究資料。

微衛(wèi)星DNA是短的堿基重復(fù)序列，最早在寄居蟹中被發(fā)現(xiàn)[10]，在真核生物中廣泛存在，由于點(diǎn)突變、不等交換、基因轉(zhuǎn)換等原因，使其變異速率高，因此具有高的多樣性及種特異性[11]。微衛(wèi)星分子標(biāo)記是基于PCR的第二代分子標(biāo)記技術(shù)[12]，具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、共顯性、所需DNA量少、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。正是由于微衛(wèi)星分子標(biāo)記是基于PCR的，因此優(yōu)化的PCR體系與擴(kuò)增條件是微衛(wèi)星分子標(biāo)記的前提條件。

單因素試驗(yàn)無法考慮到因素之間的交互作用，正交試驗(yàn)無法分析因素的影響趨勢，本研究綜合以上2種方法，彌補(bǔ)不足，以枸杞棉蚜為材料，對DNA用量、Taq聚合酶用量、Mg2+濃度、dNTPs濃度和引物濃度5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立枸杞棉蚜SSR-PCR試驗(yàn)的最佳反應(yīng)體系，并在此基礎(chǔ)上得到引物的最適退火溫度。本試驗(yàn)探討枸杞棉蚜種群遺傳多樣性研究中 SSR-PCR方法的一致性、可靠性和可重復(fù)性，為枸杞棉蚜種群遺傳多樣性分析、生物型鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料材料采于青海諾木洪紅枸杞栽培田，采集無翅棉蚜成蟲，樣品單頭分別放于盛有無水乙醇的1.5 mL離心管中浸泡，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑試驗(yàn)所用試劑10×PCR Buffer（無Mg2+）、dNTPs（2.5nmol/μL）、MgCl2（25.0nmol/μL）、Taq DNA 聚合酶（5.0 U/μL）等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。200 bp DNA Marker，購自TaKaRa公司。SSR引物采用Vanlerberghe-Masutti等于1999年設(shè)計(jì)的棉蚜微衛(wèi)星引物（表1）[13]，正交試驗(yàn)所用引物為Ago66，引物Ago59和Ago89為體系驗(yàn)證引物，均為生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1枸杞棉蚜總DNA提取及檢測采用楊子祥等的改進(jìn)SDS法[14]提取枸杞棉蚜基因組DNA，用核酸微量測定儀（德國Eppendorf公司BioSpectrometerbasic型）檢測DNA的濃度和質(zhì)量，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，將提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2因素設(shè)計(jì)方案本試驗(yàn)設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為25μL，其中含有80 ng模板DNA、2.5 U Taq酶、150 μmol/L Mg2+、250 μmol/L dNTPs、1.2 pmol/μL引物。為比較不同處理對SSR擴(kuò)增的影響，采用單因素體系優(yōu)化試驗(yàn)對影響擴(kuò)增的Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物分別設(shè)置5種梯度水平。即當(dāng)一種成分濃度梯度變化時(shí)，其他成分不變。其中DNA模板的梯度設(shè)計(jì)為20、40、60、80、100 ng；Taq酶的梯度設(shè)計(jì)為0.5、1、1.5、2、2.5 U；Mg2+的梯度設(shè)計(jì)為150、175、200、225、250 μmol/L；dNTPs的梯度設(shè)計(jì)為100、150、200、250、300 μmol/L；引物的梯度設(shè)計(jì)為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 pmol/μL。加ddH2O補(bǔ)足體積為25 μL。

1.2.3正交優(yōu)化設(shè)計(jì)為探討反應(yīng)因素間的互作效應(yīng)，PCR擴(kuò)增所設(shè)置因素的水平同單因素試驗(yàn)一致，采用L25（55）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。為提高試驗(yàn)準(zhǔn)確性，正交試驗(yàn)進(jìn)行1次重復(fù)檢驗(yàn)。

1.2.4SSR-PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，35次循環(huán)；72 ℃ 5 min。4 ℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測，用 DL200 Marker 作為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物，恒壓180 V電泳約1 h，經(jīng)固定、銀染、顯色和漂洗后，數(shù)碼相機(jī)拍照觀察。

參照何正文等的方法[15]，依據(jù)擴(kuò)增條帶的敏感性和特異性進(jìn)行計(jì)分，分?jǐn)?shù)越高表示擴(kuò)增帶的敏感性、特異性越好。

1.2.5PCR擴(kuò)增程序退火溫度的篩選在確定最佳反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，對引物Ago66的退火溫度在Tm值上下設(shè)置5個(gè)溫度梯度進(jìn)行篩選。

1.2.6SSR最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證 利用引物Ago59和Ago89驗(yàn)證此反應(yīng)體系的可行性及穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

2.1DNA提取

用改進(jìn)的十二烷基硫酸鈉（SDS）法提取的枸杞棉蚜DNA樣品濃度在 155～300 ng/mL，D260 nm/D280 nm值在1.65～1.88之間。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，點(diǎn)樣泳道均檢測出明亮清晰的DNA條帶，說明改進(jìn)的SDS法提取枸杞棉蚜的DNA質(zhì)量較高、完整、無降解，點(diǎn)樣孔有微量蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)（圖1）。結(jié)果表明，提取的DNA能夠滿足SSR-PCR試驗(yàn)要求。

2.2單因素優(yōu)化試驗(yàn)

以枸杞棉蚜為材料，進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)，5個(gè)因素對SSR-PCR試驗(yàn)影響見圖2。

單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，DNA濃度對擴(kuò)增影響不大，在設(shè)定的DNA濃度下均能擴(kuò)增出譜帶，隨DNA用量增加，擴(kuò)增產(chǎn)物增多，其中40 ng擴(kuò)增條帶最清晰；DNA濃度高于 60 ng/μL，擴(kuò)增產(chǎn)率高，但條帶模糊。

Taq DNA 聚合酶直接影響PCR擴(kuò)增效率，0.5 U反應(yīng)不能擴(kuò)增出目的條帶，含量高于2.5 U反應(yīng)時(shí)，反而抑制擴(kuò)增，使擴(kuò)增條帶彌散。

設(shè)定的Mg2+濃度不同，擴(kuò)增效果不同，150～250 μmol/L均能擴(kuò)增出目的條帶。Mg2+作為Taq酶的激活劑，濃度高于175 μmol/L時(shí)有非特異性擴(kuò)增，Mg2+濃度升高時(shí)，會(huì)使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物背景加深。

dNTPs是PCR擴(kuò)增中磷酸基團(tuán)的來源，低濃度易使其過早消耗，擴(kuò)增效果差，多為擴(kuò)增單鏈；高濃度的dNTPs，導(dǎo)致Taq酶錯(cuò)誤摻入，引起錯(cuò)配，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，濃度大于 300 μmol/L 時(shí)，過量的dNTPs會(huì)與聚合酶結(jié)合抑制PCR反應(yīng)。

引物作為PCR擴(kuò)增的原料，引物成功與模板DNA結(jié)合，便可擴(kuò)增出有效片段，0.3～0.6 pmol/μL引物模板均能與DNA模板有效結(jié)合，都能擴(kuò)增出條帶，引物模板濃度高于 0.7 pmol/μL，引物易與自身結(jié)合并擴(kuò)增，形成引物二聚體。

2.3正交優(yōu)化試驗(yàn)

由圖3可見，重復(fù)1中有5個(gè)組合沒有擴(kuò)出條帶，另有2個(gè)組合條帶很弱；重復(fù)2中有1個(gè)組合沒有擴(kuò)增條帶，說明正交試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的各個(gè)試驗(yàn)因素濃度梯度均沒有偏離最適范圍。依照評分標(biāo)準(zhǔn)，對各處理進(jìn)行等級評分，依據(jù)條帶強(qiáng)弱及雜帶多少，2次處理評分結(jié)果分別為7、6，6、6，4、4，6、2，6、8，6、6，7、5，5、3，2、2，6、6，8、6，1、3，1、3，2、4，6、6，6、7，1、1，6、3，1、6，4、6，5、6，1、4，6、5，5、6，1、1。其中處理14重復(fù)性好，分值均較高，對比單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇處理14作為最佳反應(yīng)體系（50 ng模板DNA，1.5 U Taq DNA聚合酶，150 μmoL/L Mg2+，300 μmol/L dNTPs，0.4 pmoL/μL引物）。

本研究首先根據(jù)電泳平均得分求出每個(gè)因素下各水平的和Ti，然后求出每個(gè)因素下各水平的均值ki；最后求出同一因素ki的極差R。R越大，影響越大。極差分析結(jié)果（表3）表明，各因素影響大小排序?yàn)閐NTPs>Mg2+>引物> Taq DNA聚合酶=DNA。因極差分析不能估計(jì)試驗(yàn)誤差，無法確定分析的精度，為了判斷各因素對棉蚜SSR-PCR反應(yīng)的影響是否顯著，筆者利用 SPSS 17.0對結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行方差分析，與極差分析結(jié)果一致，由Ⅲ型平方和比較可知，對擴(kuò)增的影響排序?yàn)閐NTPs>Mg2+>引物> Taq DNA聚合酶=DNA。dNTPs、Mg2+、引物對棉蚜SSR-PCR反應(yīng)的影響極顯著，Taq DNA聚合酶、DNA對棉蚜SSR-PCR反應(yīng)的影響顯著（表4）。

2.4PCR反應(yīng)退火溫度的篩選

退火溫度決定PCR的特異性，引物退火溫度在理論退火溫度基礎(chǔ)上進(jìn)行設(shè)置，共設(shè)置5個(gè)溫度梯度，依次為58、61、64、67、70 ℃。圖4結(jié)果表明，PCR試驗(yàn)不同退火溫度的條帶特異性和敏感度均比較好，泳道的背景顏色隨著退火溫度升高而加深，其中58 ℃的條帶特異性最優(yōu)。

2.5最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

利用獲得的最佳體系，用引物Ago53、Ago89對反應(yīng)體系的驗(yàn)證結(jié)果（圖5）表明，2對引物條帶清晰，重復(fù)性好。

3結(jié)論和討論

利用單因素試驗(yàn)結(jié)果分別分析5個(gè)因素對PCR反應(yīng)的影響趨勢，并利用正交優(yōu)化試驗(yàn)研究5個(gè)因素對PCR反應(yīng)的綜合影響。綜合單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)考慮到試劑成本，最終獲得枸杞棉蚜SSR-PCR最優(yōu)組合：枸杞棉蚜SSR-PCR的優(yōu)化體系總體積為25 μL，包括50 ng模板DNA、 1.5 U Taq DNA聚合酶、150 μmoL/L Mg2+、300 μmol/L dNTPs、0.4 pmoL/μL引物PCR；適宜擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s、58 ℃ 60 s、72 ℃ 30 s、35次循環(huán)，72 ℃ 5 min。

單因素試驗(yàn)表明，模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物濃度5個(gè)因素均具有促進(jìn)或抑制SSR-PCR擴(kuò)增的影響。同劉永剛等利用單因素研究的桃蚜SSR最優(yōu)反應(yīng)體系[16]相比，枸杞棉蚜SSR研究所用Taq酶及DNA的量較少，說明Taq DNA聚合酶及DNA對SSR-PCR影響較小，少量即可滿足枸杞棉蚜SSR-PCR，優(yōu)化后的體系更為經(jīng)濟(jì)。正交試驗(yàn)表明，5個(gè)因素的影響大小排序?yàn)閐NTPs>Mg2+>引物>Taq DNA 聚合酶=DNA。這一結(jié)果同謝家楠等研究的白背飛虱簡單重復(fù)序列區(qū)間（ISSR）反應(yīng)體系結(jié)果[17]基本一致，同張敏哲等研究的寬翅曲背蝗SSR反應(yīng)體系結(jié)果相比，影響因素大小排序完全相反[18]，這可能是由于材料物種的差異造成的。

dNTPs是影響枸杞棉蚜SSR-PCR的最主要因素，為擴(kuò)增時(shí)的4種核苷酸原料，低濃度使其過早消耗，擴(kuò)增效率低。高濃度的dNTPs導(dǎo)致Taq酶錯(cuò)誤摻入，引起錯(cuò)配，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，而濃度過高則會(huì)與 Taq DNA聚合酶競爭性結(jié)合Mg2+，使酶反應(yīng)活性降低，從而降低擴(kuò)增效率。單因素?cái)U(kuò)增表明，dNTPs濃度為300 μmol/L時(shí)，過量的dNTPs會(huì)與聚合酶結(jié)合而抑制PCR反應(yīng)；但是，由于存在5個(gè)因子的互作作用，在正交試驗(yàn)中，優(yōu)化的體系中dNTPs濃度為300 μmol/L。Mg2+是影響枸杞棉蚜SSR-PCR的主要因素，它作為Taq DNA 聚合酶的催化劑，當(dāng)濃度高于175 μmol/L時(shí)，能抑制Taq DNA 聚合酶的活性，有非特異性擴(kuò)增，Mg2+離子濃度升高時(shí)，會(huì)使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物背景加深。本研究單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)結(jié)果表明，150 μmol/L Mg2+是最適濃度。引物對 SSR-PCR影響也較大，單因素試驗(yàn)表明，作為結(jié)合模板DNA的原料的引物，引物濃度過高易產(chǎn)生引物二聚體或抑制擴(kuò)增，并且正交試驗(yàn)結(jié)果也表明，適合的引物濃度為0.4 pmoL/μL。本研究中Taq DNA 聚合酶、模板DNA、引物的退火溫度對SSR-PCR的影響較小，少量的Taq DNA 聚合酶、模板DNA和低的退火溫度即可獲得明亮清晰的特異性條帶。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊子祥，馮穎，陳曉鳴. 分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在蚜蟲研究中的應(yīng)用[J]. 西部林業(yè)科學(xué)，2005，34（4）：99-104.

[2]孟玲，李保平. 新疆棉蚜生物型的研究[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2001，13（1）：30-35.

[3]鄭彩玲. 棉蚜寄主專化性及其形成機(jī)制的研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007：47-59.

[4]鄒晨輝，楊效文，陳曉峰，等. 不同冬夏寄主棉蚜種群重復(fù)序列引物DNA多態(tài)性分析[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2000，6（6）：560-564.

[5]龔鵬，楊效文，張孝羲，等. 棉蚜（Aphis gossypii）種群寄主分化和季節(jié)分化的微衛(wèi)星引物PCR研究[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2001，21（5）：765-771.

[6]楊效文，張廣學(xué)，陳曉峰. 棉蚜微衛(wèi)星DNA的克隆及其多態(tài)性檢測[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2001，44（4）：586-589.

[7]Fuller S，Chavigny P，Lapchin L，et al. Variation in clonal diversity in glasshouse infestations of the aphid，Aphis gossypii Glover in southern France[J]. Molecular Ecology，1999，8（11）： 1867-1877.

[8]Carletto J，Lombaert E，Chavigny P，et al. Ecological specialization of the aphid Aphis gossypii Glover on cultivated host plants[J]. Molecular Ecology，2009，18（10）： 2198-2212.

[9]Thomas S，Boissot N，Vanlerberghe-Masutti F. What do spring migrants reveal about sex and host selection in the melon aphid？[J]. BMC Evolutionary Biology，2012，12（1）： 47.

[10]Skinner D，Beattie W，Blattner F，et al. The repeat sequence of a hermit crab satellite deoxyribonucleic acid is （-T-A-G-G—）n-（-A-T-C-C—）n[J]. Biochemistry，1974，13（19）： 3930-3937.

[11]彭建新，楊紅，洪華珠. 昆蟲分子遺傳學(xué)[M]. 武漢：華中師范大學(xué)出版社，2006：142.

[12]張羽. 分子標(biāo)記技術(shù)的產(chǎn)生與引物設(shè)計(jì)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：47-51.

[13]Vanlerberghe-Masutti F，Chavigny P，F(xiàn)uller S. Characterization of microsatellite loci in the aphid species Aphis gossypii Glover[J]. Molecular Ecology，1999，8（4）： 693-695.

[14]楊子祥，馮穎，陳曉鳴. 一種有效的蚜蟲基因組DNA提取方法[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2005，18（5）：641-643.

[15]何正文，劉運(yùn)生，陳立華，等. 正交設(shè)計(jì)直觀分析優(yōu)化PCR條件[J]. 湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，23（4）：403-404.

[16]劉永剛，漆永紅，趙麗娟，等. 桃蚜基因組DNA提取及SSR反應(yīng)體系優(yōu)化和應(yīng)用[J]. 植物保護(hù)，2009，35（4）：96-100.

[17]謝家楠，郭建軍，金道超. 白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)體系構(gòu)建的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化[J]. 植物保護(hù)，2014，40（2）：109-112.

[18]張敏哲，龐保平，周曉榕. 寬翅曲背蝗SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，34（3）：26-31.