馬婷玉+李明+吳燕燕+段修冉+潘麗萍

摘要：采用常規(guī)壓片法進(jìn)行穿心蓮染色體制片方法及其染色體數(shù)量和核型分析的研究。結(jié)果表明，08：00—8：30取材較佳，以0.10%秋水仙素溶液作為預(yù)處理液，預(yù)處理2 h，在1.0 mol/L鹽酸溶液中于60 ℃恒溫解離8 min，低滲 15 min 后，卡寶品紅溶液染色25 min壓片鏡檢，所得穿心蓮染色體制片效果良好。穿心蓮體細(xì)胞染色體數(shù)量為2n=2x=48。首次報(bào)道了穿心蓮核型公式為2n=2x=48=14m+22sm+12st，其中中部染色體（m）為7對，近中部著色點(diǎn)染色體（sm）為11對，近端部著色點(diǎn)染色體（st）為6對，核型不對稱系數(shù)為67.61%，核型屬3B型。

關(guān)鍵詞：穿心蓮；染色體；制片技術(shù)；核型分析

中圖分類號： S567.21+9.02文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0033-04

穿心蓮[Andrographis paniculata （Burm.F.） Nees]屬爵床科穿心蓮屬一年生草本植物，具有抗病毒、抗腫瘤等作用，在國內(nèi)外有廣闊的市場和開發(fā)前景。我國穿心蓮最早在廣東省和福建省南部引種栽培，目前主產(chǎn)地為廣東、廣西、海南、福建等?。▍^(qū)）[1]。穿心蓮主要以田間栽培為主，我國野生資源較少，而在穿心蓮長期人工栽培生產(chǎn)中存在品種退化、產(chǎn)量和質(zhì)量下降等問題，亟須進(jìn)行新品種選育研究[2-3]。

目前，國內(nèi)外對穿心蓮的研究主要為種質(zhì)資源調(diào)查與質(zhì)量評價(jià)[2-3]、組織培養(yǎng)與栽培[4-5]、藥用成分分析[6]、分子標(biāo)記技術(shù)[7]等，對穿心蓮細(xì)胞遺傳學(xué)方面的研究較少。本研究進(jìn)行染色體制片方法優(yōu)化及核型分析，旨在為穿心蓮遺傳資源保護(hù)、優(yōu)良種質(zhì)選育和利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試穿心蓮[Andrographis paniculata （Burm.F.） Nees]種子由廣東省清遠(yuǎn)市穿心蓮中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）基地提供，染色體憑證玻片存放于廣東藥科大學(xué)中藥資源系植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。

1.2方法

1.2.1種子萌發(fā)試驗(yàn)參照李玲梅等的方法[8]，擇顆粒飽滿的穿心蓮種子，用清水沖洗后用0.1% KMnO4溶液浸泡 30 min 取出，用無菌水沖洗，置于鋪好的裝有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，在 25 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，胚根長至0.5～0.8 cm時(shí)切取根尖。

1.2.2不同取材時(shí)間的有絲分裂中期分裂相數(shù)比較于07：30—11：00每隔30 min取穿心蓮胚根根尖，以0.05%秋水仙素處理3 h，并對不同視野下單位面積內(nèi)的中期分裂相進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確定穿心蓮胚根根尖的中期分裂高峰期和適宜的取材時(shí)間。

1.2.3預(yù)處理與固定取穿心蓮胚根根尖區(qū)域，置于4種預(yù)處理液中進(jìn)行不同時(shí)間預(yù)處理：（1）0.05%秋水仙素溶液；（2）0.10%秋水仙素溶液；（3）0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液；（4）0.10%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羥基喹啉混合溶液（體積比1 ∶1）分別在避光條件下處理1、2、3 h。取出經(jīng)預(yù)處理的根尖，用蒸餾水沖洗2～3次，然后轉(zhuǎn)入卡諾固定液（無水乙醇 ∶冰醋酸體積比=3 ∶1）中固定24 h。

1.2.4解離取固定后的根尖，于60 ℃恒溫水浴中用 1.0 mol/L HCl解離5、8、9、10、11、15 min，取出經(jīng)解離的根尖，沖洗2～3次后轉(zhuǎn)移至蒸餾水中，室溫下低滲處理15 min，然后經(jīng)85%乙醇處理2～3 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5染色與壓片取出根尖，只保留分生區(qū)，置于清潔的載玻片上，滴加2滴20%卡寶品紅溶液，染色25 min，吸去染液，滴加稀甘油，采用常規(guī)壓片法制片。

1.2.6染色體核型分析常規(guī)法壓片后，選取分散較好的染色體裝片于ZEISS Axioplan 2顯微鏡，在AxioVision 4.6圖像分析系統(tǒng)下鏡檢與拍照，采用MetaSystems Ikaros軟件系統(tǒng)進(jìn)行染色體長臂和短臂測量，并進(jìn)行染色體配對和核型分析。

篩選出最佳染色體制片方法，從最優(yōu)的染色體制片中選取50個(gè)以上可準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的根尖有絲分裂中期相細(xì)胞，其中85%以上的細(xì)胞具有恒定一致的染色體數(shù)，即可認(rèn)為是穿心蓮的染色體數(shù)[9-10]。核型取5個(gè)典型中期細(xì)胞的平均值，參照Kuo等提出的方法[11]計(jì)算染色體相對長度指數(shù)（I.R.L）；根據(jù)Levan等提出的方法[12]進(jìn)行染色體類型分析；參照Stebbins提出的方法[13]進(jìn)行染色體核型分析和相關(guān)參數(shù)計(jì)算；核型不對稱系數(shù)（As.K）按Arano提出的方法[14]計(jì)算。

2結(jié)果與分析

2.1不同取材時(shí)間對穿心蓮根尖細(xì)胞中期分裂相的影響

表1結(jié)果顯示，穿心蓮有絲分裂中期分裂相高峰期在 08：00—08：30，可觀察到約24%～28%的中期細(xì)胞；其他時(shí)間也能觀察到中期分裂相細(xì)胞，但所占比例較小，說明穿心蓮根尖細(xì)胞分裂有周期性，因此08：00—08：30的穿心蓮根尖細(xì)胞處于有絲分裂中期的比例較高，該時(shí)間點(diǎn)適于取材。

2.2不同預(yù)處理方法對染色體制片的影響

由表2和圖1可知，隨處理時(shí)間延長，同一預(yù)處理單位視野中的中期分裂相數(shù)量隨處理時(shí)間先增加后減少，染色體長度逐漸聚縮，說明預(yù)處理液對染色體長度的影響隨時(shí)間延長而加劇。其中，以 0.10% 秋水仙素處理2 h后處于中期分裂相的細(xì)胞數(shù)量最多，染色體聚縮適中，分辨程度清晰，適合作核型分析（表2、圖1-a）；材料經(jīng)0.10%秋水仙素、0.002 mol/L 8-羥基喹啉1 ∶1混合液處理2 h后，染色體呈點(diǎn)狀，形態(tài)模糊（圖1-b）；經(jīng)0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理2 h后，染色體聚縮不足，大部分有拖尾現(xiàn)象（圖1-c）；而經(jīng)0.05%秋水仙素處理2 h后，染色體雖然較為分散，但有部分拖尾現(xiàn)象，因觀察到較多中期分裂相細(xì)胞，只適合用于計(jì)數(shù)（圖1-d）。4種預(yù)處理液的整體效果為010%秋水仙素溶液>0.05%秋水仙素溶液>0.10%秋水仙素、0.002 mol/L 8-羥基喹啉1 ∶1混合液>0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液。比較40×10倍視野中中期分裂相細(xì)胞平均數(shù)量和染色體的聚縮程度發(fā)現(xiàn)，0.10%秋水仙素溶液預(yù)處理2 h可得到理想的穿心蓮染色體制片效果。

2.3不同解離時(shí)間對染色體制片的影響

由表3、圖1可知，1.0 mol/L鹽酸溶液60 ℃恒溫水浴中解離8 min細(xì)胞胞壁完全脫落，壓片時(shí)細(xì)胞分散性最好；解離時(shí)間過短的胚根根尖軟化程度不夠，細(xì)胞排列較緊密，染色體過度聚集，壓片時(shí)不易使細(xì)胞處于同一平面上，給后期鏡檢和計(jì)數(shù)帶來困難（圖1-e）；解離時(shí)間過長的細(xì)胞，過度軟化不易染色，且細(xì)胞易破裂，染色體分散過度，不利于統(tǒng)計(jì)，影響核型分析的精確度（圖1-f）。

2.4染色體數(shù)量分析

通過統(tǒng)計(jì)50個(gè)有效的穿心蓮中期分裂相細(xì)胞，其染色體數(shù)量有46、47、48條，其中86%的細(xì)胞具恒定一致的染色體數(shù)48條，根據(jù)李懋學(xué)等提出的標(biāo)準(zhǔn)[10]，確定穿心蓮的染色體數(shù)量為48條，將48條染色體配對成24對，核型和核型模式見圖2、圖3。

2.5染色體相對長度及核型分析

對5個(gè)有效細(xì)胞的核型進(jìn)行分析，取平均值，穿心蓮染色體分為4組：1～4號為長染色體（L），5～7號為中長染色體（M2），8～21號為中短染色體（M1），22～24號為短染色體（S）；其中1、2、4、5、6、7、10號為中部著絲粒染色體（m），3、8、11、13、14、15、16、17、18、19、24號為近中部著絲粒染色體（sm），9、12、20、21、22、23號為近端部著絲粒染色體（st），詳見表4。核型公式為2n=2x=14m+22sm+12st，染色體相對長度在2.959%～7.101%之間，平均相對長度為4.17%，染色體長度比為2.40，臂比大于2 ∶1的染色體占66.7%，按照STEBBINS的核型分類標(biāo)準(zhǔn)，穿心蓮的核型屬3B型，是不對稱性較高的染色體組，核型不對稱系數(shù)為67.61%，染色體核型分析參數(shù)見表4。

3結(jié)論與討論

植物中具有分生能力的部位都可作為觀察細(xì)胞染色體的材料，如根尖、莖尖、愈傷、嫩葉、花粉母細(xì)胞等[15]。不同植物的分裂旺盛部位應(yīng)視植物自身生長特性而定，在選取材料時(shí)間的對照試驗(yàn)中，因外界環(huán)境、植物自身生長調(diào)控等因素影響，取材時(shí)間也不同，如翠蘆莉（Ruellia brittoniana Leonard）和大花蘆莉（Ruellia elegans Poir.）的幼根于8：00—10：00取材中期分裂相細(xì)胞最多[16]；木薯（Plumbago auriculata）嫩葉在08：30—10：00取材效果最佳[17]。為保證植物細(xì)胞處于較旺盛的中期分裂相，本研究選08：00—8：30取穿心蓮胚根根尖，可能是因?yàn)榇┬纳彿N子根尖在該時(shí)間段分裂較旺盛。

要獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，合適的預(yù)處理濃度和處理時(shí)間是制片的關(guān)鍵。有學(xué)者認(rèn)為小染色體植物的染色體用秋水仙素溶液作預(yù)處理效果較佳[18]。李懋學(xué)等提出了多種小染色體植物的制片方法，如大豆（Glycine max）、水稻（Oryza sativa）等宜用0.002 mol/L 8-羥基喹啉水溶液作預(yù)處理液[10]。本試驗(yàn)對比不同預(yù)處理液和處理時(shí)間的制片效果后認(rèn)為，選用穿透力較強(qiáng)的0.10%秋水仙素溶液處理2 h后，穿心蓮染色體聚縮程度適中，著絲粒位置適中，而處理3 h的染色體過度收縮，很難進(jìn)行染色體的形態(tài)分析。0.05%秋水仙素溶液可能是因濃度較低而影響其穿透力，只適合用于計(jì)數(shù)不適合作核型分析。而使用0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液預(yù)處理穿心蓮根尖細(xì)胞，得到的染色體聚縮程度不足，染色體形態(tài)有拖尾不易分辨，推斷其原因?yàn)榇┬纳彽娜旧w較小（1～4 μm），但是細(xì)胞壁較厚且細(xì)胞質(zhì)較濃，當(dāng)使用0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液預(yù)處理時(shí)，難以有效穿透較厚的細(xì)胞壁。0.1%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液（體積比1 ∶1）混合液處理下染色體聚縮過度，其可能原因是2種預(yù)處理液對紡錘絲的抑制效果不同，而造成抑制作用疊加使染色體過度聚縮。解離常用酶解法和酸解法，酶解法成本較高且混合酶液濃度視不同植物而定，酸解法通常在60 ℃鹽酸中恒溫水浴，成本低且易操作。最終本試驗(yàn)確定8：00—8：30為較宜的取材時(shí)間，穿心蓮根尖以0.10%秋水仙素溶液預(yù)處理2 h，卡諾氏液固定24 h，1.0 mol/L 鹽酸溶液60 ℃下解離8 min后低滲 15 min，卡寶品紅染色25 min，顯微鏡視野內(nèi)觀察到較清晰的穿心蓮染色體。

穿心蓮染色體數(shù)量目前國內(nèi)外僅有陳愛葵等報(bào)道，為 2n=12，關(guān)于所用廣東省云浮市栽培種穿心蓮的來源有待于進(jìn)一步探討[19]。陳瑞陽報(bào)道采自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所的穿心蓮染色體為2n=50[20]。本研究中采自廣東省清遠(yuǎn)市的穿心蓮染色體數(shù)量經(jīng)過反復(fù)統(tǒng)計(jì)和驗(yàn)證后，確定為2n=48，與陳瑞陽的結(jié)果[20]略有差異。自然環(huán)境和氣候條件可能是造成植物形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)差異的主要原因，從而使染色體數(shù)量存在一定差異。在一定的生存環(huán)境中，植物的染色體是恒定的，但生存環(huán)境的差異會增加物種的遺傳多樣性。

在染色體核型方面，穿心蓮的核型不對稱系數(shù)為 67.61%，核型分類為3B型，Stebbins認(rèn)為系統(tǒng)演化中較原始的植物通常具有較對稱的核型，而較進(jìn)化或特化的植物往往出現(xiàn)不對稱的核型，核型不對稱系數(shù)越大，染色體長短臂越不對稱，其進(jìn)化程度越高[13]。按Stebbins提出的核型分類標(biāo)準(zhǔn)，穿心蓮在爵床科穿心蓮屬植物的系統(tǒng)演化中進(jìn)化程度較高。

本研究確定了穿心蓮的染色體數(shù)量，并對其進(jìn)行了核型分析，為進(jìn)一步研究穿心蓮屬植物的進(jìn)化、植物分類、遺傳育種、優(yōu)良品種選育提供了細(xì)胞學(xué)資料。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社，2002：204-205.

[2]陳元生，羅戰(zhàn)勇，郭尚志，等. 穿心蓮種質(zhì)資源的評價(jià)與利用初報(bào)[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，12（1）：5-7.

[3]鄧喬華，徐友陽，李淑苑，等. 影響穿心蓮藥材質(zhì)量因素的調(diào)查和研究[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009，23（5）：5-7.

[4]賀紅，黃昌杰，劉昌輝，等. 穿心蓮不同外植體離體培養(yǎng)的研究[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21（6）：470-472.

[5]黃海波，徐鴻華. 穿心蓮規(guī)范化栽培技術(shù)[M]. 廣州：廣東科技出版社，2010：2-9.

[6]曾令杰，梁暉，林蔚蘭. 穿心蓮生長過程中內(nèi)酯類成分的積累動態(tài)及其相關(guān)性研究[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2007，24（6）：464-467.

[7]陳蓉，王曉云，宋毓寧，等. 基于SRAP和SNP分子標(biāo)記的國內(nèi)穿心蓮遺傳多樣性分析[J]. 中國中藥雜志，2014，39（23）：4559-4565.

[8]李玲梅，李明. 不同處理方法對穿心蓮種子萌發(fā)影響的初步研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，27（4）：371-374.

[9]李國珍. 染色體及其研究方法[M]. 北京：科學(xué)出版社，1985：23-35.

[10]李懋學(xué)，張贊平. 作物染色體及其研究技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：1-40.

[11]Kuo S T，Wang T T，Huang T C. Karyotype analysis of some Formosan gymnosperms[J]. Taiwania，1972，17（1）：66-80.

[12]Levan A，F(xiàn)redga K，Sandberg A A.Nomenclacture forcentromeric position on chromosomes [J]. Hereditas，1964，52（2）：197-201.

[13]Stebbins G L. Chromosome evolution in hingher plants[M]. London：Edward Arnoldy Ltd，1971：85-104.

[14]Arano H L.Cytological studies in subfamily Carduoideae（Compositae） of Japan Ⅸ[J]. Botanical Magazine （Tokyo），1963，76：32-39.

[15]趙晨宇. 藍(lán)花丹染色體核型分析研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013：13-14.

[16]蔡文燕，周桃鳳. 翠蘆莉與大花蘆莉染色體核型分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（5）：134-137.

[17]張健，郭軍輝，陳雄庭，等. 木薯葉片染色體制片技術(shù)研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2012，33（1）：20-23.

[18]劉永安，馮海生，陳志國，等. 植物染色體核型分析常用方法概述[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（1）：98-102.

[19]陳愛葵，沈育君，廖紅云. 穿心蓮的染色體核型分析初報(bào)[J]. 廣東第二師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，22（2）：57-58.

[20]陳瑞陽. 中國主要經(jīng)濟(jì)植物基因組染色體圖譜（第五冊）[M]. 北京：科學(xué)出版社，2005：4-5.