楊敬亭,楊蘇文,金位棟,劉 雷,閆玉紅,毛啟迪(.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院,江西 南昌 33003；2.環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評估國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 0002；3.湖泊水污染治理與生態(tài)修復(fù)技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,北京 0002)

三種典型淡水藻EOM組成特征及胞外氨基酸釋放規(guī)律

楊敬亭1,2,3,楊蘇文2,3*,金位棟2,3,劉 雷1,閆玉紅2,3,毛啟迪1,2,3(1.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院,江西 南昌 330031；2.環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評估國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100012；3.湖泊水污染治理與生態(tài)修復(fù)技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,北京 100012)

通過對比分析了藻類EOM的類型和組成,探討了藻類胞外氨基酸的釋放規(guī)律.選取典型淡水藻銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、四尾柵藻(Scenedesmus quadricauda)、喙頭舟形藻(Navicula rhynchocephala)為研究對象,采用三維熒光光譜-平行因子分析法(EEMs-PARAFAC)、柱前衍生高效液相色譜(HPLC)分析3種藻在生長穩(wěn)定期EOM特征與胞外游離氨基酸、結(jié)合氨基酸的含量組成等差異.結(jié)果表明,藻類均可將無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮釋放到水體中;3種藻EOM中總色氨酸與總酪氨酸熒光強(qiáng)度關(guān)系分別為銅綠微囊藻＞四尾柵藻＞喙頭舟形藻、喙頭舟形藻＞四尾柵藻＞銅綠微囊藻;藻胞外氨基酸中組氨酸、丙氨酸、甘氨酸及絲氨酸含量均較高,蘇氨酸、精氨酸、酪氨酸含量均較低;3種藻 c(DFAAs)/c(DCAAs)的比值均較低,釋放的氨基酸多數(shù)以蛋白質(zhì)和多肽的形式存在;銅綠微囊藻胞外有機(jī)物(EOM)中ρ(DON)、ρ(TDAAs)及氨基酸對水體中DON貢獻(xiàn)量均為最高,分別為1.31mg/L、5.35mg/L、69.08%,因此藍(lán)藻水華暴發(fā)可能會(huì)增加水體的氨基酸濃度,加重水體有機(jī)氮負(fù)荷.

有機(jī)氮；胞外有機(jī)物；氨基酸；貢獻(xiàn)

藻類生長過程中代謝產(chǎn)生的總?cè)芙獍被?TDAAs)是水體溶解性有機(jī)氮(DON)的重要組成成分[1-2],是湖泊生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)質(zhì)的重要來源[1,3].氨基酸及其礦化產(chǎn)物具有很高生物活性,可被藻類循環(huán)利用[4],為藻類水華持續(xù)暴發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)[5-6].目前國內(nèi)外對藻類來源的氨基酸物質(zhì)已開展了部分研究,藻類TDAAs來源于胞內(nèi)有機(jī)質(zhì)(IOM)組分和胞外有機(jī)質(zhì)(EOM)代謝兩種途徑[7].現(xiàn)有研究多以藻類IOM中氨基酸的組成和特征為主,IOM 中氨基酸及肽類物質(zhì)分子量主要位于 70～1000Da區(qū)段[8];其中賴氨酸、甘氨酸和精氨酸含量最高[9];且氨基酸總量及單體含量在藻生長適應(yīng)期到指數(shù)期是不斷積累的[10].胞外代謝研究相對較少,胞外氨基酸同樣以大分子蛋白質(zhì),及小分子多肽及游離氨基酸形式存在;但其蛋白質(zhì)及游離氨基酸組成與含量卻與IOM中存在顯著的差異[9,11];且不同藻類不同生長期其含量與組成均會(huì)明顯變化[12].胞外氨基酸僅定性研究其特性,其含量及組成研究相對缺乏.姚昕等[13]使用熒光光譜法對胞外氨基酸研究發(fā)現(xiàn),色氨酸含量顯著高于酪氨酸;而徐金隆等[14]與 Henderson等[15]卻得到相反的結(jié)論,表明以熒光光譜法判斷藻源性氨基酸的類型和強(qiáng)度具有不確定性,導(dǎo)致對湖泊DON來源的認(rèn)識存在差異.因此開展藻類生長期胞外氨基酸代謝規(guī)律研究,對探究藻類對湖泊水體DON的貢獻(xiàn)具有重要意義.

藻類胞外氨基酸是EOM的重要組成部分可分為溶解游離氨基酸(DFAAs)和溶解結(jié)合氨基酸(DCAAs)兩種形式[4,16-17].藻類代謝氨基酸直接釋放到水體中的為DFAAs,利用多肽和蛋白質(zhì)類物質(zhì)在水體中通過水解等方式釋放的氨基酸為DCAAs.研究發(fā)現(xiàn)DFAAs比DCAAs更容易被生物利用[17];此外發(fā)現(xiàn)海洋甲藻在水華暴發(fā)時(shí)可吸收硅藻代謝的 DFAAs、DCAAs作為氮源[4].目前對湖泊水華爆發(fā)優(yōu)勢藻與非優(yōu)勢藻代謝DFAAs與DCAAs的含量和特征及其與代謝蛋白質(zhì)之間的關(guān)系,及藻間差異性對比研究較為缺乏.值得注意的是,現(xiàn)有藻代謝氨基酸的研究多采用三維熒光光譜–平行因子分析(EEMs-PARAFAC)法[15,18].該方法僅能定性表征類色氨酸和類酪氨酸的變化,用此 2種氨基酸表征藻類EOM中18種氨基酸的含量與特征,可能導(dǎo)致藻類代謝氨基酸和蛋白質(zhì)對水體DON的貢獻(xiàn)被低估.

本研究以淡水典型水華優(yōu)勢藻銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa,藍(lán)藻)、四季常見典型藻四尾柵藻(Scenedesmus quadricauda,綠藻)、喙頭舟形藻(Navicula rhynchocephala,硅藻)為研究對象,采用三維熒光光譜結(jié)合高效液相色譜方法,定性、定量研究3種藻穩(wěn)定期EOM特征、游離氨基酸與水解氨基酸代謝規(guī)律的藻間差異,考察藻代謝總蛋白質(zhì)、水解蛋白質(zhì)、ρ(TOC)、ρ(DTN)等的變化特征,分析藻類代謝氨基酸代謝規(guī)律,以期為準(zhǔn)確闡述湖泊氮素循環(huán)特征、藻類內(nèi)源有機(jī)質(zhì)污染的深入認(rèn)識及水華控制提供科學(xué)參考.

1 材料與方法

1.1 藻的培養(yǎng)與EOM提取

本實(shí)驗(yàn)選取的銅綠微囊藻、四尾柵藻、喙頭舟形藻,均由中國環(huán)境科學(xué)研究院湖泊基地藻種庫提供.采用序批式培養(yǎng),向裝有 500mL培養(yǎng)基的1L三角瓶中分別接種少量處于對數(shù)生長期的3種純藻種,置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),期間不再補(bǔ)充培養(yǎng)液,銅綠微囊藻及四尾柵藻采用 M11培養(yǎng)基,喙頭舟形藻采用 D1培養(yǎng)基.恒溫培養(yǎng)箱中光照強(qiáng)度為 500～1000lx,溫度為(25±1)℃,光暗比為 12h:12h.每種藻各設(shè) 3個(gè)平行實(shí)驗(yàn).將不接種藻的培養(yǎng)基作空白對照,置于培養(yǎng)箱中.

使用血球計(jì)數(shù)板對藻生長情況進(jìn)行觀察.銅綠微囊藻、四尾柵藻及喙頭舟形藻分別在培養(yǎng)13d, 26d及37d后到達(dá)穩(wěn)定期,其藻密度平均為1.1×108,9.2×107和 1.7×107cells/mL.選取處于生長穩(wěn)定期(銅綠微囊藻17d、四尾柵藻30d、喙頭舟形藻41d)的3種藻懸濁液120mL,采用離心過濾法提取EOM[17].選取3種藻的懸濁液,離心機(jī)轉(zhuǎn)速在4000r/min下離心20min后,取上清液用0.45μm聚醚砜膜過濾,濾液中所含有機(jī)物即為藻EOM,保存在-20℃下,待測.

1.2 EOM濾液基本參數(shù)測定

含有EOM的濾液水質(zhì)基本參數(shù)的測定方法如下:溶解性有機(jī)碳(DOC)采用 TOC測試儀(TOC-VCPH,島津,日本)測定;硝態(tài)氮(NO3--N)、亞硝態(tài)氮(NO2--N)和氨氮(NH4+-N)分別采用紫外分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法以及納氏試劑分光光度法測定,溶解性總氮(DTN)采用堿性-過硫酸鉀消解分光光度法測定[20-21],分光光度法均采用紫外-可見分光光度計(jì)(UV-1700,島津,日本)測定;DON的質(zhì)量濃度采用 DTN減去無機(jī)氮的差減法獲得[22],其分析誤差為DTN、NO3--N、NO2--N、NH4+-N的方差總和.蛋白質(zhì)含量采用考馬斯分光光度法測定.

1.3 EOM三維熒光光譜及平行因子分析

三維熒光光譜(3DEEM)采用熒光分光光度計(jì)(F-7000,日立,日本),掃描參數(shù):激發(fā)波長(Ex)掃描范圍為 200～400nm,發(fā)射波長(Em)掃描范圍為250～500nm,掃描間隔均為5nm,狹縫寬度為5nm,光電倍增管(PMT)電壓為 400V,掃描速度為1200nm/min.分別利用各自培養(yǎng)基的三維熒光光譜圖校正拉曼散射,然后將瑞利散射影響的區(qū)域數(shù)據(jù)置零,繪制熒光光譜圖.

將3種藻27(3×9)個(gè)穩(wěn)定期EOM樣品編號,與發(fā)射波長和激發(fā)波長組合成三維數(shù)據(jù)矩陣(41×51×27),對其進(jìn)行PARAFAC分析.比較各組分殘差值的大小,用折分法判斷2～7組分中的有效組分,最終確定了3組分模型最合適.

1.4 EOM中氨基酸的測定

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線:將天冬氨酸(ASP)、谷氨酸(GLU)、絲氨酸(SER)、組氨酸(HIS)、甘氨酸(GLY)、蘇氨酸(THR)、精氨酸(ARG)、丙氨酸(ALA)、酪氨酸(TRP)、胱氨酸(CYS)、纈氨酸(VAL)、蛋氨酸(MET)、色氨酸(TRP)、苯丙氨酸(PHE)、異亮氨酸(ILE)、亮氨酸(LEU)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶于0.1mol/L HCl中,配制成0、0.5、1、5、10、20μmol/L混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液.氨基酸含量測定采用OPA柱前衍生高效液相色譜法.使用高效液相色譜儀(Agilent 1260,安捷倫,美國)配備熒光檢測器(Aglient G1314BFLD)測定.色譜柱分析條件:ZORBAX Eclipse Plus C18柱(2.1×150mm, 3.5μm,安捷倫),柱溫38℃;流量0.42mL/min;流動(dòng)相A,0.01mol/L Na2HPO4,0.01mol/L Na2B4O7,pH 8.2,流動(dòng)相 B,乙腈:水:甲酸(45:45:10,v/v/v);梯度洗脫程序:0、0.5、20、20.1、23.5、23.6、25min時(shí),流動(dòng)相B占總流動(dòng)相體積的比例為2%、2%、57%、100%、100%.采用熒光檢測器檢測,Em= 450nm,Ex=340nm.該方法檢測限0.3μmol/L,定量限1μmol/L.

DFAAs測定,取30mL EOM提取液真空冷凍干燥,樣品干燥成白的或淡黃色粉末,加 1mL 0.1mol/L HCl后過0.22μm濾膜后,用上述方法測定氨基酸濃度,游離氨基酸摩爾濃度為游離氨基酸單體濃度之和,用c(DFAAs)表示.TDAAs測定,取30mL EOM提取液真空冷凍干燥,樣品干燥成白的或淡黃色粉末;將樣品轉(zhuǎn)移至水解管,加2mL 6mol/L HCl和100μL 12mmol/L的抗壞血酸水溶液,充氮?dú)?min,移入110℃恒溫箱中水解22h;冷卻至室溫后,用 6mol/L NaOH溶液中和,定容至5mL,過 0.22μm濾膜后,同樣采用上述方法測定水解氨基酸.色氨酸采用堿水解——熒光分光光度法測定[23],水解氨基酸摩爾濃度為水解氨基酸單體濃度總和,用 c(TDAAs)表示.結(jié)合氨基酸單體濃度及c(DCAAs)均采用水解氨基酸單體濃度及 c(TDAAs)減去對應(yīng)游離氨基酸單體及c(DFAAs)的差減法獲得.

1.5 數(shù)據(jù)分析

本研究PARAFAC應(yīng)用MATLAB 2014a結(jié)合 N-way工具箱分析,各組分熒光圖使用MATLAB 2014a繪制;數(shù)據(jù)圖表均采用 Excel 2013、Origin 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)、分析和繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 3種藻氮吸收與代謝特征差異

由圖 1可見,銅綠微囊藻濾液中氮主要以NO3-為主,DON的含量占19.61%;四尾柵藻DON占總氮量的絕大部分,為 57.60%;喙頭舟形藻濾液中氮主要以 NO3-的形式存在,DON含量極低,僅占 2.27%.3種藻穩(wěn)定期濾液與空白相比其DTN濃度均有大幅度降低,主要是由于藻對NO3-吸收轉(zhuǎn)化,使 NO3-濃度降低;且均產(chǎn)生了一定量DON,說明藻類均可利用無機(jī)氮源生長繁殖并代謝一定量的有機(jī)氮,這與古勵(lì)等[20]研究結(jié)果相同.四尾柵藻對 DTN利用最多,說明四尾柵藻對氮的吸收代謝能力要遠(yuǎn)強(qiáng)于另外兩種藻,與劉蓮等[24]研究結(jié)果相同.NO3-作為培養(yǎng)基的唯一氮源,藻在代謝過程均產(chǎn)生 NH4+,與 Berman等[25]研究結(jié)果相同,可能是由于 DON被藻細(xì)胞利用和部分分解而產(chǎn)生.

EOM在培養(yǎng)液中 DOC、DON形式表達(dá),DOC、DON之間的比例關(guān)系是有機(jī)質(zhì)的重要特征之一,反映有機(jī)質(zhì)的來源、組成等特征[2,26].3種藻穩(wěn)定期均代謝產(chǎn)生大量 DOC,銅綠微囊藻EOM中DOC濃度最高,喙頭舟形藻最低.銅綠微囊藻、四尾柵藻EOM中DOC/DON分別為7.59、10.44, 喙頭舟形藻的 DOC/DON=23.67,說明喙頭舟形藻代謝產(chǎn)物組成與另外兩種藻有明顯的差異,其主要以糖類有機(jī)物為主,含氮有機(jī)物質(zhì)較少,Watt等[27]研究同樣發(fā)現(xiàn)硅藻EOM主要是多糖,蛋白質(zhì)及氨基酸代謝釋放量較小.對于胞外蛋白質(zhì),四尾柵藻含量最高,銅綠微囊藻含量最低.

圖1 3種藻穩(wěn)定期水質(zhì)特征Fig.1 Water quality characteristics for the three algaes in algous growth stationary phase

2.2 藻類EOM熒光組分特征

三維熒光光譜能定性分析EOM組成特征及色氨酸與酪氨酸物質(zhì)[18].3種藻穩(wěn)定期EOM三維熒光圖譜如圖 2所示,3種藻均含有熒光峰B(Ex/Em=275/325),銅綠微囊藻含有較強(qiáng)的熒光峰A(Ex/Em=225/330),四尾柵藻與喙頭舟形藻均以較強(qiáng)的B峰為主.先前研究發(fā)現(xiàn),熒光峰A與熒光峰B屬于類蛋白物質(zhì)產(chǎn)生的熒光峰[18,28],說明3種藻EOM中主要為類蛋白組分.四尾柵藻熒光光譜中含有熒光峰C(Ex/Em=270/440),該熒光峰被認(rèn)為是類腐殖質(zhì)產(chǎn)生[29],說明四尾柵藻代謝會(huì)產(chǎn)生有少量的類腐殖質(zhì).

圖2 3種藻EOM的三維熒光光譜圖Fig.2 EEMs contours of EOM produced by three algaes

根據(jù)PARAFAC模型識別出藻類EOM中3個(gè)熒光組分(圖3,表1).其中包含2個(gè)類蛋白組分C1,C2:組分 C1存在兩個(gè) Ex/Em 峰,分別為225/330,275/330,反應(yīng)的是類色氨酸形成的熒光峰;組分C2的Ex/Em在275/315處存在單峰,代表類酪氨酸物質(zhì).C1,C2通常被認(rèn)為是生物及微生物代謝產(chǎn)生的[18,30],本研究證明了這個(gè)觀點(diǎn).同時(shí)包含一個(gè)類腐殖質(zhì)組分(C3), Ex/Em= 250/440,該組分曾被認(rèn)為由人類活動(dòng)外源輸入[4],后研究發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻代謝過程同樣可以產(chǎn)生[18,31],本研究證明藍(lán)、綠、硅藻在生長代謝過程均可產(chǎn)生該熒光組分.

圖3 平行因子模型得到的3組分(C1,C2,C3)熒光光譜圖Fig.3 EEMs contours of the three components (C1, C2, C3) identified by the PARAFAC

表1 平行因子分析得出的3種熒光組分與先前研究的比較Table 1 Three components identified by PARAFAC analysis in this study and their comparison with previously identified components

圖4 3種藻熒光組分強(qiáng)度差異Fig.4 The difference of fluorescence intensity scores in the three algaes

不同藻穩(wěn)定期EOM各熒光組分存在較大差異(表1,圖4).銅綠微囊藻對水體貢獻(xiàn)最多的類色氨酸物質(zhì),是四尾柵藻的14.2倍,而喙頭舟形藻幾乎不產(chǎn)生類色氨酸物質(zhì).喙頭舟形藻貢獻(xiàn)了最多的類酪氨酸物質(zhì),分別為銅綠微囊藻和四尾柵藻的1.7倍和6.9倍.采用∑P(∑P=C1+C2)代表類蛋白物質(zhì)[38],銅綠微囊藻代謝產(chǎn)生了最多的類蛋白物質(zhì),∑P=74.5A.U,四尾柵藻及喙頭舟形藻的EOM中∑P含量相等,均為11.7A.U.銅綠微囊藻EOM 中類色氨酸物質(zhì)遠(yuǎn)多于類酪氨酸物質(zhì),其余 2種藻代謝產(chǎn)物中類酪氨酸物質(zhì)占有絕對優(yōu)勢,說明原核藻類的穩(wěn)定期代謝過程會(huì)產(chǎn)生更多的類色氨酸物質(zhì),而真核藻類則會(huì)產(chǎn)生更多的類酪氨酸物質(zhì).

2.3 藻類EOM氨基酸濃度特征差異

由圖5、圖6可見,銅綠微囊藻、四尾柵藻、喙頭舟形藻胞外游離氨基酸單體濃度分別為0.011～0.124μmol/L 、 0.006～0.099μmol/L 、0.009～0.116μmol/L.銅綠微囊藻游離氨基酸單體中,精氨酸濃度最高,四尾柵藻與喙頭舟形藻為甘氨酸濃度最高;3種藻游離氨基酸單體均為色氨酸濃度最低.銅綠微囊藻代謝EOM中c(DFAAs)最高,為 0.94 μmol/L;四尾柵藻代謝 EOM 中c(DFAAs)量最低,為0.55μmol/L.銅綠微囊藻、四尾柵藻、喙頭舟形藻胞外結(jié)合氨基酸單體濃度分別 為 0.08～9.09μmol/L、 0.19～4.02μmol/L、0.12～1.78μmol/L.銅綠微囊藻與四尾柵藻結(jié)合氨基酸單體均為組氨酸濃度最高,蘇氨酸濃度最低;喙頭舟形藻為甘氨酸濃度最高,精氨酸濃度最低.銅綠微囊藻代謝的 EOM中 c(DCAAs)最高,為43.48μmol/L;喙頭舟形藻代謝的 EOM 中c(DCAAs)量最低,為8.51μmol/L.

圖5 藻DFAAs與TDAAs液相色譜Fig.5 Algous DFAAs and TDAAs detected by high performance liquid chromatography

圖6 3種藻EOM中總色氨酸單體濃度Fig.6 The concentration of total tryptophan in EOM produced by the three algaes

銅綠微囊藻 EOM中DFAAs與DCAAs含量均最高.這可能與藍(lán)藻無法準(zhǔn)確調(diào)節(jié)每種氨基酸的合成以滿足蛋白質(zhì)合成的需要,過量氨基酸以DFAAs與DCAAs 2種形式分泌到胞外等機(jī)制有關(guān)[39].也可能與銅綠微囊藻穩(wěn)定期藻類部分死亡[15],胞內(nèi)高濃度蛋白質(zhì)及氨基酸釋放到胞外水體有關(guān).組氨酸、丙氨酸、甘氨酸及絲氨酸,4種氨基酸單體總量在3種藻EOM中含量均較高,而蘇氨酸、精氨酸、酪氨酸3種氨基酸單體含量均較低.Dotson等[40]研究發(fā)現(xiàn)自然水體中甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸含量較高,組氨酸穩(wěn)定性較差在水體中含量較低,據(jù)此推測藻類是水體中氨基酸的主要貢獻(xiàn)者,藻類水華的暴發(fā)是湖泊水體中氨基酸的主要來源.

本研究通過EEMs-PARAFAC與HPLC法得到的3種藻EOM中總色氨酸與總酪氨酸含量關(guān)系均相同,分別為銅綠微囊藻＞四尾柵藻＞喙頭舟形藻,喙頭舟形藻＞四尾柵藻＞銅綠微囊藻.說明EEMs-PARAFAC法能定性表示EOM中的色氨酸與酪氨酸,但其無法得出2種氨基酸的含量.

3種藻穩(wěn)定期EOM中c(DFAAs)/c(DCAAs)的比值均較低,僅占 2.9%～11.88%,與 Zhang等[4]研究結(jié)果相近.Myklestad[41]研究發(fā)現(xiàn),多肽、蛋白質(zhì)是藻類有機(jī)質(zhì)的重要組成,占 25%～50%; DCAAs是由多肽、蛋白質(zhì)肽鍵斷裂產(chǎn)生,DCAAs濃度會(huì)遠(yuǎn)高于DFAAs.喙頭舟形藻代謝EOM中c(DFAAs)/c(DCAAs)值最高,表明該藻代謝的TDAAs中以游離氨基酸形式存在多,而銅綠微囊藻代謝的TDAAs多以蛋白質(zhì)和多肽的形式存在.

圖7 3種藻c(DFAAs)與c(DCAAs)比值Fig.7 The ratio of c(DFAAs) and c(DCAAs) from the three algaes

3 討論

藻類代謝產(chǎn)生的氨基酸是水體中DON的重要來源[6],氨基酸主要以DFAAs和DCAAs的形式存在水體中.研究表明,水體DFAAs對DON貢獻(xiàn)率較低,僅為0.03%～3.35%[4],DCAAs貢獻(xiàn)率相對較高,分別為 1.6%～18.12%.本研究表明,藻EOM中DFAAs對DOC和DON貢獻(xiàn)率僅為1.45%～4.47%,DCAAs貢獻(xiàn)分別為 51.85% ～70.33%(表2),與 DCAAs貢獻(xiàn)率遠(yuǎn)高于 DFAAs的結(jié)論一致.結(jié)合前述 DCAAs的分析結(jié)果說明藻類貢獻(xiàn)的氨基酸主要來自多肽及蛋白質(zhì)的水解.藻EOM中TDAAs對DON的貢獻(xiàn)率為49.76%～69.42%,表明藻類釋放的DON主要是多肽及蛋白質(zhì)物質(zhì).藻DFAAs、DCAAs對DON的貢獻(xiàn)均大于對 DOC的貢獻(xiàn),可能與藻類代謝產(chǎn)物含有較多糖類物質(zhì)[18],氨基酸及蛋白質(zhì)并不是DOC的最主要貢獻(xiàn)者有關(guān).

3種藻中,銅綠微囊藻TDAAs對DON貢獻(xiàn)最高,為 69.08%.四尾柵藻及喙頭舟形藻貢獻(xiàn)率較銅綠微囊藻低,可能與綠藻和硅藻代謝蛋白質(zhì)中含有較多的脂肪族特性的蛋白類物質(zhì)有關(guān)[42].脂肪族氨基酸之間的肽鍵較難水解[43],如絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等脂肪族氨基酸在四尾柵藻和喙頭舟形藻水解產(chǎn)物中含量較少.四尾柵藻及喙頭舟形藻 ρ(DCAAs)/ρ(蛋白質(zhì))分別為 0.23、0.14,表明了該兩種藻水解不完全,而銅綠微囊藻 ρ(DCAAs)/ρ(蛋白質(zhì))=1.05,表明其蛋白質(zhì)易水解.研究表明,水華藍(lán)藻相比于其他藻類對有機(jī)氮的吸收能力強(qiáng),在有機(jī)氮濃度較高的環(huán)境中能更好地生長[25].因此藍(lán)藻氨基酸的代謝,不但使水體 DON濃度升高,其代謝釋放氨基酸類物質(zhì)可供藍(lán)藻生長,造成水體氮素的不良循環(huán).

表2 藻氨基酸對DON的貢獻(xiàn)Table 2 The contribution of DON from algous amino acids

4 結(jié)論

4.1 3種藻在代謝過程中 DTN濃度均降低,均可利用無機(jī)氮源代謝產(chǎn)生DON.

4.2 EEMs-PARAFAC和HPLC測得的3種藻EOM 總色氨酸含量:銅綠微囊藻＞四尾柵藻＞喙頭舟形藻;總酪氨酸含量:喙頭舟形藻＞四尾柵藻＞銅綠微囊藻.

4.3 3種藻胞外氨基酸單體中組氨酸、丙氨酸、甘氨酸及絲氨酸含量較高,蘇氨酸、精氨酸、酪氨酸含量均較低.

4.4 3種藻穩(wěn)定期EOM中c(DFAAs)/c(DCAAs)僅占 2.9%～11.88%,表明藻代謝氨基酸更多以蛋白質(zhì)和多肽的形式存在,游離氨基酸較少,但水解后氨基酸含量較高.

4.5 3種藻中,銅綠微囊藻EOM的ρ(DON)、ρ(TDAAs)及氨基酸對DON貢獻(xiàn)量最高,分別為1.31mg/L、5.35mg/L、69.08%,藍(lán)藻水華暴發(fā)能顯著增加水體的氨基酸濃度,加重水體有機(jī)氮負(fù)荷.

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EOM characteristics and release of extracellular amino acids in three typical freshwater algaes.

YANG Jing-ting1,2,3, YANG Su-wen2,3*, JIN Wei-dong2,3, LIU Lei1, YAN Yu-hong2,3, MAO Qi-di1,2,3(1.School of Resources Environment and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China；2.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Beijing 100012, China；3.State Engineering Laboratory for Lake Pollution Control and Ecological Rehabilitating Technique, Beijing 100012, China). China Environmental Science, 2017,37(5)：1879～1888

The release of extracellular amino acids from algae was studied through comparative analysis of the type and composition of EOM in algae. Typical freshwater algae species, including Microcystis aeruginosa, Scenedesmus quadricauda and Navicula rhynchocephala were selected to explore the difference of the characteristic of EOM, and the quantity and composition of extracellular free amino acid and bound amino acids in algaes of stable phase, by excitation-emission matrix spectroscopy combined with parallel factor analysis (EEMs-PARAFAC) and pre-column high performance liquid chromatography (HPLC). Results showed that inorganic nitrogen can be transformed to organic nitrogen in algaes and sequentially to be released into water. The fluorescence intensity of total tryptophan and of total tyrosine in EOM was Microcystis aeruginosa ＞ Scenedesmus quadricauda ＞ Navicula rhynchocephala, and Navicula rhynchocephala ＞ Scenedesmus quadricauda ＞ Microcystis aeruginosa, respectively. The concentration of histidine, phenylalanine, glycine, and serine were higher than that of threonine, arginine and tyrosine. All of the ratios of c(DFAAs)/c(DCAAs) for the three algaes were low. Most of the amino acids existed as proteins and peptides. The ρ(DON), ρ(TDAAs) and amino acids of the Microcystis aeruginosa were the major contributor to the DON in the water body, and they are 1.31mg/L, 5.35mg/L, 69.08%, respectively. Therefore cyanobacteria bloom may release lots of amino acids into water and may increase organic nitrogen load in freshwater ecosystem.

organic nitrogen；extracellular organic matter；amino acids；contribution

X52

A

1000-6923(2017)05-1879-10

楊敬亭(1991-),男,山東濰坊人,碩士研究生,主要從事湖泊富營養(yǎng)化研究.

2016-09-19

國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2012ZX07102-004)

* 責(zé)任作者, 研究員, yangsw@craes.org.cn