吳映捷,呂新美,閆兵兵,胡 鯤,楊先樂

上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,國家水生動物病原庫,上海 201306

響應(yīng)面法優(yōu)化酶輔助提取廢棄煙葉中煙堿

吳映捷,呂新美,閆兵兵,胡 鯤,楊先樂*

上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,國家水生動物病原庫,上海 201306

為了從廢棄煙葉高效提取煙堿，本文利用響應(yīng)面法對在廢棄煙葉中煙堿的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。以煙堿的得率為評價指標(biāo)，設(shè)計酶解時間、酶解溫度，pH值及提取時間4因素3水平的實驗?zāi)Ｐ?，采用Design Expert 8.0.6分析軟件對煙堿的提取條件進(jìn)行優(yōu)化研究。優(yōu)選出最佳提取工藝為：酶解時間2.0 h，酶解溫度48.50℃，酶用量2.10%，pH4.00。測定煙堿的得率為3.320%，與預(yù)測值3.32836%偏差較小，為廢棄煙葉的煙堿提取提供理論依據(jù)。

煙堿;廢棄煙葉;響應(yīng)面法

煙草(Nicotiana tabacum L)是最廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物之一。我國有世界最大的煙草生產(chǎn)和消費(fèi)國量，煙草年產(chǎn)量占到世界總產(chǎn)量的40%左右，煙堿（Nicotine，Nic）是煙草中最主要的生物堿[1]。臨床醫(yī)學(xué)上有重要使用價值，嚴(yán)家川的研究發(fā)現(xiàn)其可以激活α7煙堿型膽堿能受體及減少促炎癥細(xì)胞因子合成及釋放，減輕炎癥反應(yīng)，改善疾病預(yù)后。給Alzheimer's癥患者使用煙堿透皮貼劑可以使患者認(rèn)知功能得到改善[2]。凌麗研究表明煙堿具有強(qiáng)抗炎作用，可以不依賴迷走神經(jīng)完整性獨立發(fā)揮作用[3]。張敏恒等經(jīng)過研究表明煙堿也是農(nóng)用殺蟲劑的重要成分，對昆蟲具有拒食、忌避、細(xì)胞凋亡和生殖毒性等作用可用于魚類寄生蟲防治，還能改善水質(zhì)，清塘、療效徹底的特點，無耐藥性且殘留低，且原料廣，成本低，使用方便[4]。

現(xiàn)有的煙堿提取方法有溶劑萃取法[5]、蒸餾法[6]、離子交換法及超臨界CO2提取法等[7-9]。對于生物堿類化合物，一般根據(jù)極性和水溶性選擇提取方法，煙堿可溶于水，一般選擇水作為提取溶劑。陳小東等采用單寧酸作沉淀劑，超聲提取法來提取廢次煙葉中煙堿。用水做為提取溶劑，用單寧酸來行沉淀反應(yīng)，煙堿的提取率達(dá)1.06%[10]。曾淼洋等用減壓內(nèi)部沸騰法提取，實驗乙醇濃度為70%，提取溫度為50℃及操作壓強(qiáng)為0.019 MPa時，內(nèi)部沸騰過程4 min完成，煙堿提取率1.15%[11]。黃飛也以微波輔助的方法提取煙堿，觀察了浸泡時間、微波功率、固液比、微波時間等條件對煙堿提取率的影響。微波輔助提取法提取煙堿最佳條件是：功率為800 W，輻射時間是7 min，浸泡時間為4 h，固液比1:7，該優(yōu)化條件下，煙堿提取率能達(dá)到98.68%[12]。陳麗金用微波輔助的方法提取煙堿，發(fā)現(xiàn)微波對煙堿的提取有促進(jìn)的作用。微波輔助提取的最佳工藝條件是微波功率為300 W，波時間為1 min，液固比為25:1，此工藝比未經(jīng)微波處理的提法的提取率增加約11倍[13]?，F(xiàn)在用于工業(yè)生產(chǎn)的主要為溶劑萃取法和蒸餾法，但是這些方法效率低下，而離子交換法和超臨界CO2提取法雖然得率較高但是成本又難以控制，現(xiàn)有技術(shù)在提取效率和生產(chǎn)成本上難以達(dá)到平衡。酶解輔助提取法是指在傳統(tǒng)溶劑法的基礎(chǔ)上，利用生物酶降解細(xì)胞間質(zhì)中的成分，破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，通過降低細(xì)胞的滲透阻力促進(jìn)有效成分的溶出[14]。具有工藝簡單、得率高的優(yōu)點，可以用于工業(yè)大量生產(chǎn)。依據(jù)單因素提取實驗結(jié)果，選取對提取有影響的酶解溫度、酶解時間、酶用量和pH值四個因素，以煙堿得率為指標(biāo)，采用中心組合設(shè)計－響應(yīng)面法確定最佳提取工藝，并且具有試驗次數(shù)少、精度高的優(yōu)點，以期為廢棄煙葉提取工業(yè)化提取提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

廢棄煙葉由江西省贛州市漁業(yè)局提供，去掉老化病變部分，洗凈，烘干，粉碎，過篩備用。實驗中所用試劑均為分析純。煙堿標(biāo)準(zhǔn)品購于美國Sigma公司（純度≧98%），纖維素酶，諾維信公司，酶活力為20000 U/g。

HH-4S數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司)；UV751型紫外－可見光分光光度計（瑞利儀器分析有限公司產(chǎn)品）、AB104-S電子分析天平

1.2 實驗方法

1.2.1 煙堿含量的測定 將煙堿標(biāo)準(zhǔn)液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL注入60 mL分液漏斗中，加檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液2 mL于分液漏斗、再加入2 mL甲基橙溶液，將分液漏斗中的溶液混合均勻，加入三氯甲烷5 mL，萃取時間2 min，靜置分層，取三氯甲烷的分層加入比色皿中，測波長在420 nm處吸光度。煙堿溶液吸光度作縱坐標(biāo)，煙堿量為橫坐標(biāo)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。煙葉中總煙堿含量按照《YC/T160-2002煙草及煙草制品總植物堿的測定連續(xù)流動法》測其中總煙堿含量[15]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 最佳酶解時間的篩選 稱取過篩后的煙葉10.00 g，以1:10的料液比加入100 mL水，選擇了酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h作為考察因素，固定酶解溫度選定為50℃，酶用量1.5%，pH值5，所得提取液過濾，放冷，得供試品溶液，測定，計算煙堿提取量；

1.2.2.2 最佳酶解溫度的篩選 稱取過篩后的煙葉10.00 g，以1:10的料液比加入100 mL水，選擇了酶解溫度40、45、50、55、60、65℃作為考察因素，固定酶解時間1.0 h，酶用量1.5%，pH值5，所得提取液過濾，放冷，得供試品溶液，測定，計算煙堿提取量；

1.2.2.3 最佳酶用量的篩選 稱取過篩后的煙葉10.00 g，以1:10的料液比加入100 mL水，選擇了酶用量0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%作為考察因素，固定酶解時間1.0 h，酶解溫度50℃，pH值5，所得提取液過濾，放冷，得供試品溶液，測定，計算煙堿提取量；

1.2.2.4 最佳pH值的篩選 稱取過篩后的煙葉10.00 g，以1:10的料液比加入100 mL水，選擇了pH值3.5、4、4.5、5、5.5、6作為考察因素。固定酶解時間1.0 h，酶解溫度50℃，酶用量1.5%，所得提取液過濾，放冷，得供試品溶液，測定，計算煙堿提取量。

1.2.2.5 煙堿含量的測定

煙堿的得率（mg/g）=C×V×n/m

C為根據(jù)煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算出的所測樣品中煙堿濃度（mg/mL），V為提取液定容體積（mL），n為稀釋倍數(shù)，m為煙葉的質(zhì)量（g）。

2 響應(yīng)面實驗設(shè)計

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

以吸光度為縱坐標(biāo)，煙堿提取量為橫坐標(biāo)作圖，作出回歸方程y=0.117x-0.031，R2=0.9927。

2.2 煙堿提取單因素實驗

2.2.1 酶解時間對煙堿得率的影響

圖1 煙堿提取量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Nicotine amount

圖2 酶解時間對提取效果的影響Fig.2 Effect of enzyme time on yield of Nicotine

由圖2可知，煙堿的得率隨酶解時間的增加而升高，酶解時間2 h后，隨著酶解時間的延長，煙堿得率增勢趨于平緩。原因為隨著時間增長，酶活力可以得到充分發(fā)揮，酶解反應(yīng)進(jìn)行得較完全，提取液中煙堿含量便不再明顯增加。

2.2.2 酶解溫度對煙堿得率的影響

煙堿的提取率隨酶解溫度升高而增加，當(dāng)溫度為50℃時，到達(dá)峰值，酶解溫度繼續(xù)升高，煙堿的提取率開始減少。隨著溫度的升高，底物分子的熱能增加，酶解反應(yīng)的速率增加，提取率增大，但當(dāng)溫度繼續(xù)升高，導(dǎo)致酶活性降低，酶解反應(yīng)受抑制，因此溫度升高得率降低。

2.2.3 酶用量對煙堿得率的影響

圖3 酶解溫度對提取效果的影響Fig.3 Effect of enzyme temperature on yield of Nicotine

圖4 酶用量對提取效果的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on yield of Nicotine

煙堿的提取率隨酶用量的增加不斷升高，當(dāng)酶用量到2%時，酶量再增加，煙堿的提取率沒有明顯變化。這可能是由于當(dāng)酶用量低于最佳值時，酶解進(jìn)行得不完全，煙堿釋放出的量較少，提取率低，當(dāng)達(dá)到最佳值時，酶解反應(yīng)則較徹底，此時如再繼續(xù)增加酶用量，酶解反應(yīng)進(jìn)行的程度沒有太大的變化。

2.2.4 pH值對煙堿得率的影響

圖5 pH值對提取效果的影響Fig.5 Effect of pH on yield of Nicotine

試驗結(jié)果表明，煙堿得率隨著酶解pH值的增大先增大后減小。原因可能是纖維素酶受到pH值的影響較大。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗分析

2.3.1 響應(yīng)面實驗因素水平的選擇 在單因素實驗的基礎(chǔ)上對A（酶解時間）、B（酶解溫度）、C（酶用量）和D（pH值）為考察因素，進(jìn)行響應(yīng)面試驗，使用Design-expert 8.0.6 trial軟件，以煙堿含量為指標(biāo)，設(shè)計4因素3水平（共29個試驗點、5個中心點）的響應(yīng)面試驗，每組試驗重復(fù)3次，取其平均值，其因素水平如表1所示。

表1 Response surface試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in Response surface test

2.3.2 建立模型方程與顯著性檢驗 對結(jié)果進(jìn)行多元化回歸擬合分析得到4個因素與煙堿得率之間二次回歸模擬方程

得率=3.24+0.050A-0.38B-0.025C-0.075D-0.021AB+0.028AC+0.038A D+0.012BC+0.16BD-0.13C D-0.021A2-0.67B2-0.044C2-0.42D2

二次回歸模擬方程其中一次項和二次項都有顯著性影響因素，所以實驗各因子對響應(yīng)值的影響并不是線性關(guān)系。

表2 Response surface中心組合方案及響應(yīng)值Table 2 Response surface central combination project and response values

該回歸模型檢驗極為顯著，P＜0.0001。失擬項P=0.2661，說明方程的擬合性較好。R2=0.9921說明模型相關(guān)度好。校正決定系數(shù)R2adg=0.9599說明模型能較好地反映酶解時間，酶解溫度，酶用量，pH與煙堿得率之間的關(guān)系。變異系數(shù)CV值表達(dá)的是每個平均值偏離的狀況，本實驗CV=0.025%＜0.1%，說明實驗的重復(fù)性好。從F值的分析結(jié)果可以看出，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對煙堿得率的影響大小的順序為:酶解溫度（F=531.13）、酶解時間(F=9.29)、酶用量(F=2.38)，pH值(F=0.011)。根據(jù)表3中P值可知，一次項A、B對煙堿得率的影響極顯著，交互項中AB對煙堿得率的影響極顯著，BD、CD對煙堿得率的有顯著影響，AC對煙堿得率的影響顯著，二次項B2、D2對煙堿得率有極顯著影響,。響應(yīng)面方程極顯著地表示了Y與A、B、C、D的關(guān)系[16]

響應(yīng)面是響應(yīng)值對試驗因子所構(gòu)成三維空間曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上能清楚看出最佳條件及各參數(shù)之間的交互作用。兩因素交互作用對煙堿得率影響的響應(yīng)曲面見圖6。A圖為等高線，B圖為其相對應(yīng)的響應(yīng)曲面圖。利用三維圖(圖6)綜合反映了各變量之間的交互關(guān)系，響應(yīng)曲面圖形越陡峭，即其交互作用越顯著，圖形平穩(wěn)則說明交互作用比較微弱。圖6可知，酶用量和酶解時間交互作用最強(qiáng)，酶解溫度和pH交互作用最弱。酶解時間和酶解溫度對得率的影響最為顯著，在酶解時間1.5 h，酶用量2%時，當(dāng)酶解時間一定時，煙堿得率隨溫度得增加先升高后降低，當(dāng)酶解溫度一定時，得率隨溫度的增加先快速升高再趨于平穩(wěn)。

2.4 最佳工藝條件的確定及驗證

圖6 各兩因素交互作用對煙堿影響Fig.6 The interactive effects of two factors on yield of Nicotine

3 討論與小結(jié)

本實驗采用纖維素酶法從廢棄煙葉中提取煙堿，分解纖維素時能起到生物催化作用，能降低反應(yīng)的活化能，使分解作用完全高效地進(jìn)行。所以本實驗采用纖維素酶催化提取得到煙堿提取得率高，實際應(yīng)用時操作簡單、反應(yīng)得到產(chǎn)物的活性成分保存好、反應(yīng)安全無毒，不會有溶劑殘留的問題[17]。通過單因素實驗分析和響應(yīng)面法可于較準(zhǔn)確地得出了最佳提取工藝，數(shù)據(jù)較為可靠，有良好的重復(fù)性[18]。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)曲面分析對煙堿的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并得到回歸方程。試驗首先考察了酶解時間、酶解溫度 酶用量、pH等4組單因素水平對煙堿的影響，進(jìn)行了響應(yīng)面試驗設(shè)計，結(jié)果表明，各影響因素對煙堿得率的影響程度大小依次為酶解溫度、酶解時間、酶用量、pH。三維(3d)響應(yīng)面回歸方程的一個重要組成部分,可以直觀地闡述了兩個變量之間的交互作用,并確定最優(yōu)水平,酶解溫度和pH交互作用最強(qiáng)，酶解時間和酶用量的交互作用最弱，確定其最佳提取工藝條件并結(jié)合實際確定為得出影響煙堿的最佳提取工藝條件為：酶解時間2.00 h，酶解溫度48.50℃，酶用量2.10%，pH值為4。根據(jù)優(yōu)化條件進(jìn)行三組平行實驗，取平均值為3.320 mg/g，與預(yù)測值相差較小。得到回歸方程與實際的情況擬合較好，進(jìn)一步驗證了該模型的可行性。實驗結(jié)果說明該回歸方程可以較好預(yù)測實驗結(jié)果。因此，選擇響應(yīng)曲面法來優(yōu)化煙堿的提取工藝是可行的[18-20]。

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Optimization of Nicotine Extracted from Abandoned Tobacco with Response Surface Method

WU Ying-jie,LV Xin-mei,YAN Bing-bing,HU Kun,YANG Xian-le*
College of Fisheries and Life Science/Shanghai Ocean University,NationalAquaticAnimal Pathogens,Shanghai 201306,China

To optimize the conditions for purification of Nicotine in abandoned Tobacco.Response surface method was used to design the test models with four factors including enzyme time,enzyme temperature,enzyme dosage,ultrasonic time at three levels based on the single factor experiment and the yield of Nicotine was used as the evaluation index to optimize purification process of Nicotine.The optimum extraction condition were as follows:enzymolysis time was 2.00 h, enzymolysis temperature was 48.50℃,cellulose enzyme amount was 2.10%,pH was 4.00.Under this condition,the yield was up to 3.320%,the relative error was smaller compared to the predicted value 3.32836%.The optimum extraction conditions were simple and stable and they were served as a reference for industrial large scale production.

Nicotine;abandoned tobacco;response surface method

S572

:A

:1000-2324(2017)02-0203-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2017.02.008

2016-10-12

:2016-11-05

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(2011AA10A216);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費(fèi)(201203085)

吳映捷(1992-),女,在讀碩士生,研究方向為中草藥殺滅寄生蟲作用.E-mail:wuyingjie0615@sina.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:xlyang@shou.edu.cn