侯賦園　楊光忠　徐婧

摘要：指出了超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)防御氧化損傷的一種十分重要的金屬酶，作為超氧陰離子自由基的專一清除劑，在疾病的治療、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等方面具有廣泛的應(yīng)用。以大豆為實驗材料，對其中的SOD酶提取流程進行了優(yōu)化，然后利用改良的鄰苯三酚自氧化法測定了所提取的SOD酶的活性，建立了最適合大豆的SOD酶提取流程。最后對九個不同產(chǎn)地大豆SOD酶活性進行了比較，結(jié)果顯示：來自黑龍江的大豆酶活力最高，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：超氧化物歧化酶；改良的鄰苯三酚自氧化法；大豆

中圖分類號：Q554.6

文獻標識碼：A文章編號：16749944（2017）8023204

1引言

SOD是生物體內(nèi)一種非常重要的金屬酶，廣泛存在于各種生物體中。同時也是一種重要的抗氧化劑，它的作用底物是超氧陰離子·O2-，催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，從而清除·O2-自由基[1，2]。目前SOD已在多個領(lǐng)域中被應(yīng)用，比如醫(yī)療保健[3]、食品工業(yè)[4]、以及植物抗逆[5]等。植物來源SOD的分離純化[6～8]主要工藝流程為：植物-精制-超濾濃縮-冷凍干燥-產(chǎn)品。SOD的活性測定方法一般分直接測定法和間接測定法[9-11]。常見的直接測定方法有EPR法、脈沖輻解法、超氧化鉀法等。常見的間接測定方法有黃嘌呤氧化酶法、細胞色素法、鄰苯三酚自氧化法、微量鄰苯三酚自氧化法、黃嘌呤氧化酶-NBT法、NBT光還原法等。鄰苯三酚自氧化法的主要原理為：在堿性條件下，鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)，并產(chǎn)生·O2，在SOD存在下，自氧化反應(yīng)受到抑制。該法所用試劑和儀器比較普通，測試方便，靈敏度高，是目前應(yīng)用最廣泛的一種測試方法，但對溫度、pH值、鄰苯三酚濃度、SOD待測液存放時間等諸因素比較敏感，因此測定時要嚴格控制這些因素[12～14]。

筆者提取了大豆中的SOD酶，然后利用改良的鄰苯三酚自氧化法對大豆的SOD酶活性進行了測定，對測定過程中的各個條件進行了探索，建立了大豆SOD酶測定最佳方法，并對不同產(chǎn)地大豆的SOD活性進行了比較，使SOD在規(guī)模化生產(chǎn)的同時更具針對性。

2材料與方法

2.1材料和儀器

本實驗所使用的大豆樣品來源于9個產(chǎn)地，分別為：廣東（廣州）、北京、江蘇（動臺）、黑龍江（佳木斯）、黑龍江（牡丹江）、福建（廈門）、廣西（柳州）、湖北（武漢）、湖南（長沙）。對應(yīng)的編號分別為1～9。

實驗材料：Tris base（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級純）；其余試劑均為分析純。A液：稱取1.2114 g Tris和37.2 mg EDTA·2Na溶于62.4 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液中，用蒸餾水定容至100mL。B液：4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液。

實驗儀器：紫外可見分光光度計（UEG1008016，上海美譜達儀器有限公司）；微型酸度計（PHSJ-3F，上海精科）；高速離心機（TGL-20M，長沙平凡儀器儀表有限公司）；超純水系統(tǒng)（Aquaplore3S，頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）。

2.2SOD酶提取與處理

2.2.1粗酶液的提取

將大豆種子洗凈淋干，于pH值為7.8的PBS緩沖液中浸泡10 h。清洗后加入4℃三倍體積的預(yù)冷緩沖液，在冰上勻漿。勻漿后加入一定量的緩沖液，在超聲波清洗機中超聲，使細胞破碎，得到粗酶液。

2.2.2SOD粗酶液的處理

熱變性：分別取一定體積的粗酶液，放入60℃的水浴鍋中分別保溫10、15、20 min，在5000 r/min、4℃的離心條件下離心15 min去除沉淀，測定上清液中酶活力及蛋白含量，篩選熱變性的最佳時間。

丙酮沉淀：取一定體積的酶液，置于冰浴中，緩慢加入-20℃預(yù)冷的丙酮，攪拌10 min，4℃下靜置5 h，待其自然沉淀后， 4℃、5000 r/min離心15 min棄去上清液，收集沉淀，用緩沖液溶解沉淀，4℃、5000 r/min離心15 min后測定上清液酶活力和蛋白含量。

2.3酶活性與濃度的測定

2.3.1酶活力的測定

鄰苯三酚自氧化速率測定嚴格控制在25℃進行。于15 mL比色管中用微量移液器依次加入A液2.35 mL，蒸餾水2.015 mL，B液0.35 mL。加入B液后立即混合并傾入比色皿，于325 nm處測吸光值，共測4次，即取開始后30s和90s時的吸光值，二者之差即為鄰苯三酚自氧化速率△A325。本試驗確定△A325值為0.060。測定樣液和SOD酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率時樣品的加入順序如表1所示，分別加入一定量樣液或酶液使鄰苯三酚自氧化速率約為0.5倍A325，即△A′325為0.030。

2.3.2蛋白質(zhì)濃度的測定

采用紫外分光光度法測蛋白質(zhì)濃度，利用在280 nm及260 nm下的光吸收值計算蛋白質(zhì)的濃度，公式如下：

蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45×A280-0.74×A260

式中：A280是蛋白質(zhì)溶液在280 nm下測得的光吸收值；A260是蛋白質(zhì)溶液在260 nm下測得的光吸收值。

2.3.3SOD的定性分析

采用紫外分光光度法：分離后的酶液與Cu/Zn-SOD標品分別在200～400 nm處進行紫外光譜掃描，根據(jù)樣品與標品的紫外圖譜比較，對提取物質(zhì)進行定性，同時根據(jù)其最大吸收峰的波長來判斷SOD的類型。

2.4SOD酶提取條件的優(yōu)化

2.4.1超聲時間的優(yōu)化

分別對勻漿超聲波處理1 min，2 min，3 min，4 min，5 min后，使用紫外分光光度法測定蛋白的濃度，并用改良的鄰苯三酚自氧化方法測定酶的活力。

2.4.2熱變性時間的優(yōu)化

取三份100 mL粗酶液，60℃條件下對其進行熱處理，時間分別為10 min、15 min、20 min，邊加熱邊用玻璃棒輕輕攪拌，加熱完成后，迅速放入4℃冰浴冷卻30 min，然后在5000 r/min、4℃下離心15 min，取上清液，分別測酶活和蛋白質(zhì)含量。

2.4.3丙酮用量的優(yōu)化

取熱變性以后的酶液，置入4℃冰浴中，分別加入1.0倍、1.5倍、2.0倍體積的-20℃預(yù)冷丙酮進行沉淀。丙酮要緩慢加入，并用玻璃棒輕輕攪拌，以防止丙酮局部過量以及溶液產(chǎn)生大量的熱量而使蛋白質(zhì)變性。

2.5不同產(chǎn)地大豆的SOD酶的提取與比較

利用上述提取方法對全國9個產(chǎn)地的大豆進行SOD酶的提取及酶活的測定。

3.2.3丙酮加入量對酶活的影響

檢測結(jié)果如表3，當丙酮加入量為1.5倍時酶活收率與比活力最高，因此本實驗將丙酮加入量定為1.5倍體積。

3.3SOD活性的測定優(yōu)化

3.3.1A液pH值對鄰苯三酚自氧化速率的影響

檢測結(jié)果如表4所示。從表中數(shù)據(jù)可以看出，鄰苯三酚自氧化速率隨pH的升高而增大，在pH值在8～8.4范圍內(nèi)，曲線幾乎不變，斜率較低，pH變化對鄰苯三酚自氧化速率的影響不大。當pH值超出此范圍時，曲線斜率變大，微小的pH變化都會顯著影響鄰苯三酚自氧化速率。本實驗A液最佳PH值定為8.2。

3.3.2鄰苯三酚加入量對測量的影響

4討論及結(jié)論

大豆樣品經(jīng)粗提取和熱變性、丙酮沉淀后的蛋白質(zhì)紫外光譜如圖1（b）所示。由圖1可以看出Cu/Zn-SOD標準品圖1（a）與樣品圖譜的走勢、峰形及出峰位置基本一致，可確定提取物質(zhì)為SOD。圖形的差異是由于Cu/Zn-SOD的來源不同，標準品來源于牛血細胞，出峰位置在258 nm處，而待測樣品來源于大豆，出峰位置在260 nm。

SOD的測活方法有很多，在這些方法中，鄰苯三酚自氧化法儀器簡單、測試方便，因而是使用較普遍的一種方法。目前采用的鄰苯三酚測活方法有兩種，一種是經(jīng)典的鄰苯三酚自氧化法，另一種是改進的微量鄰苯三酚自氧化法。本文SOD活性的測定采用后者，該方法以修改的Marldund方法廣泛用于食品中SOD活性測定，方法靈敏，操作簡易，易于推廣。

超聲波實驗的結(jié)果顯示，最佳的超聲波時間是4 min。因為在一定的條件下，超聲波時間過短不能使細胞破碎，因而其中的酶不能完全溶出；因為大多數(shù)酶也是蛋白質(zhì)，如果超聲波時間過長就會破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，酶也就會失去活力。故超聲波時間應(yīng)該嚴格控制。熱變性試驗可以去除一定量的雜質(zhì)蛋白，熱變性的過程中不需要接觸有機溶劑，在節(jié)省成本的同時，減少了對環(huán)境和人體的危害，增加了工作的安全性，所以熱變性法是去除雜蛋白的一種高效、簡便、安全的方法。丙酮沉淀方法的優(yōu)勢在于丙酮本身為易揮發(fā)的有機溶劑，離心除去上清后沉淀，避免了透析等一系列的繁瑣步驟，可以直接干燥而得到最終的產(chǎn)物；但同時也有一定的弊端，即會給環(huán)境帶來污染。

本文對9個不同產(chǎn)地的大豆SOD酶進行了提取、蛋白量的測定、酶活力的測定。結(jié)果顯示：各個產(chǎn)地大豆SOD酶活性有一定的差異，但總體呈現(xiàn)一種趨勢，即從我國南部到北部，大豆SOD酶的活力逐漸升高，來自黑龍江大豆中的SOD酶活性最高，更適合進行大規(guī)模的生產(chǎn)，并可做進一步的開發(fā)、應(yīng)用研究。

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