李先偉， 左東澤， 沈媛媛， 郝 偉

(皖南醫(yī)學院藥理學教研室， 安徽 蕪湖 241002)

降鈣素基因相關肽對肺纖維化大鼠肺組織eIF3a、p27表達的影響*

李先偉△， 左東澤， 沈媛媛， 郝 偉

(皖南醫(yī)學院藥理學教研室， 安徽 蕪湖 241002)

目的：觀察降鈣素基因相關肽(CGRP)對肺纖維化大鼠肺組織真核翻譯起始因子3a(eIF3a)、p27表達的影響，探討CGRP在肺纖維化中的作用及機制。方法：雄性SD大鼠，體重180～220 g，隨機分為3組(n=8)：對照組、博萊霉素組、博萊霉素+辣椒素組。采用氣管內(nèi)注射博萊霉素(5 mg/kg)誘導肺纖維化大鼠模型。造模前4 d大鼠皮下注射辣椒素(Capsaicin)(50 mg/kg·d)，造模后第28天處死動物，頸動脈采血ELISA法測定血漿CGRP含量。細胞實驗分6組(n=9)：Control組，轉化生長因子-β1(TGF-β1)組，CGRP(1、10、100 nmol/L)組，CGRP8-37 1 μmol/L和CGRP 100 nmol/L組。細胞用CGRP和(或)CGRP8-37預處理1 h，再用TGF-β1(5 ng/ml)處理48 h。5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)法檢測細胞增殖。免疫組化、real-time PCR和(或)Western blot檢測eIF3a、p27、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、collagen Ⅰ mRNA及蛋白表達。結果：博萊霉素誘發(fā)肺纖維化動物肺組織eIF3a、α-SMA及Ⅰ膠原表達增高，CGRP及p27的表達明顯降低。外源性CGRP可劑量依賴性的抑制TGF-β1誘導的肺成纖維細胞增殖，明顯抑制eIF3a、α-SMA、Ⅰ膠原的表達，上調p27的表達，這些作用可以被CGRP阻斷劑CGRP8-37所取消。結論：CGRP在博萊霉素誘導的肺纖維化中起著重要作用，可能通過抑制eIF3a、上調p27的表達而抑制肺成纖維細胞的增殖，進而抑制肺纖維化的形成與發(fā)展。

降鈣素基因相關肽；肺纖維化；肺成纖維細胞；eIF3a；p27；大鼠

【DOI】 10.12047/j.cjap.5444.2017.01.004

肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)是由不同

致病因素(如遺傳、環(huán)境或繼發(fā)于其他肺部疾病等)所致的急、慢性肺疾病的共同結局，其病理特點是肺部彌漫性炎癥所致肺泡持續(xù)性損傷及細胞外基質的反復破壞、修復、重建和過度沉積[1]。其發(fā)病機制至今仍尚未完全闡明。真核翻譯起始因子3a(eIF3a)是真核翻譯起始因子(eukaryotic initiation factor, eIF)中最大的亞基，目前研究發(fā)現(xiàn)eIF3a可通過多種下游通路調控細胞周期從而影響細胞增殖，如eIF3a通過下調p27、上調核糖核苷酸還原酶M2(RRM2)及α-微管蛋白的表達而影響細胞周期中的G1、S和M期，進而調節(jié)一系列mRNA的翻譯，在細胞增殖中起著重要作用[2,3]。eIF3a調控細胞增殖的研究以往主要集中在腫瘤細胞，特別是肺癌細胞。而我們最新的研究發(fā)現(xiàn)eIF3a通過下調p27的表達而參與了肺成纖維細胞增殖的調控，與肺纖維化的形成有關[4,5]。

降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是由37個氨基酸組成的感覺神經(jīng)肽，包括α和β兩種亞型，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、心血管及肺血管床內(nèi)[6]。研究發(fā)現(xiàn)在二氧化硅和石棉誘導的肺損傷并發(fā)肺纖維化的患者中，肺組織CGRP 的表達明顯降低[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)CGRP通過上調p27的表達而抑制了低氧誘導的肺血管平滑肌細胞的增殖[8]。另外最新研究還發(fā)現(xiàn)CGRP通過ERK信號通路抑制eIF3a的表達進而調控博萊霉素誘導的肺纖維化[9]。CGRP是否通過抑制eIF3a的表達、上調p27的表達而參與肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展未見文獻報道。本研究以博萊霉素誘導的肺纖維化為模型，確證內(nèi)源性CGRP在肺纖維化中的作用，在培養(yǎng)的原代肺成纖維細胞上，探討CGRP抑制肺成纖維細胞增殖機制，以期能為肺纖維化發(fā)病機制提供新的實驗依據(jù)、尋找抗纖維化藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠，體重180～220 g，許可證號SCXK (滬) 2013-0006。博萊霉素(日本化藥株式會社)。轉化生長因子-β1(美國RD公司)；BrdU增殖檢測試劑盒(美國 Roche )；兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)多克隆抗體、小鼠抗大鼠collagen I 單克隆抗體(美國Abcam)；小鼠抗大鼠p27 單克隆抗體、兔抗大鼠eIF3a單克隆抗體(美國cell signaling)；小鼠抗大鼠GAPDH 單克隆抗體(美國Santa Cruz)。Masson染色試劑盒(南京凱基)。CGRP ELISA檢測試劑盒(美國Creative Diagnostics)。CGRP、 CGRP8-37(美國 Sigma)；Prime ScriptTMRT reagent Kit、Power SYBR Green PCR Master Mix(大連寶生物工程有限公司)，引物設計合成(上海生物)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型的制備 24只大鼠適應性喂養(yǎng)1周，按體重隨機分為3組(n=8)：對照組(Control)；博萊霉素組(Bleomycin, 5 mg/kg)；博萊霉素+辣椒素組(Bleomycin+Capsaicin)：造模前4 d大鼠皮下注射辣椒素(50 mg/kg·d)，用以耗竭內(nèi)源性CGRP。將大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于實驗臺，分離氣管，Bleomycin組和Bleomycin + Capsaicin組在環(huán)狀軟骨下0.5 cm處用1 ml注射器緩慢注入Bleomycin溶液(5 mg/kg)。迅速直立大鼠旋轉，使藥液均勻分布于兩肺。對照組注入等量的生理鹽水。造模后第28天處死動物進行病理學觀察及各指標檢測。

1.2.2 肺組織形態(tài)學觀察及Masson染色 動物處死后取大鼠左肺以4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋切片, HE染色。步驟如下：Mayer’s蘇木素溶液染色10 min(脫色搖床輕搖)；0.5%鹽酸水溶液分化10 s；75%酒精溶液分色30 s，自來水洗滌20 min；0.5%伊紅酒精溶液染色1 min；95%酒精溶液脫水30 s；100%無水乙醇溶液脫水5 min×3次；二甲苯溶液中透明5 min×2次；中性樹膠封片、干燥、拍照分析。肺組織Masson膠原染色按試劑盒說明書進行。

1.2.3 免疫組化檢測肺組織α-SMA蛋白表達 肺組織石蠟切片, 厚度約每片4 μm, 常規(guī)脫蠟至水, 抗原修復液修復20 min, 封閉液室溫封閉1 h, 抗α-SMA一抗 (1∶400) 4℃過夜, 二抗 (1∶400) 室溫孵育2 h, SABC 室溫孵育1 h, DAB 顯色, 蘇木素復染, 中性樹膠封片觀察。陽性細胞表達呈黃至棕黃色顆粒。

1.2.4 血漿CGRP濃度測定 腹主動脈采血4 ml 集于含10% Na2EDTA 40 μl和抑肽酶40 μl的試管中，3 500 r/min，4°C離心20 min，收集血漿，按CGRP ELISA檢測試劑盒說明書測定血漿中CGRP的濃度。

1.2.5 大鼠原代肺成纖維細胞的培養(yǎng)及細胞實驗分組 大鼠原代肺成纖維細胞的培養(yǎng)按文獻采用組織塊貼壁法制備肺成纖維細胞。結果顯示，所有貼壁良好的肺組織塊周圍均5～7內(nèi)有細胞長出，細胞形態(tài)為梭形成纖維樣細胞。細胞經(jīng)過傳代純化后第3代細胞經(jīng)波形蛋白細胞免疫組化染色鑒定為陽性，說明培養(yǎng)的細胞為肺成纖維細胞。因此細胞實驗用第3代培養(yǎng)的原代細胞。細胞實驗分6組(n=9)：(1)Control組；(2)TGF-β1組：細胞用TGF-β1(5 ng/ml)處理48 h；(3)+CGRP 1 nmol/L組：細胞用CGRP(1 nmol/L)預處理1 h，再用TGF-β1(5 ng/ml)處理48 h；(4)+CGRP 10 nmol/L組：細胞用CGRP(10 nmol/L)預處理1 h，再用TGF-β1(5 ng/ml)處理48 h；(5)+CGRP 100 nmol/L組：細胞用CGRP(100 nmol/L)預處理1 h，再用TGF-β1(5 ng/ml)處理48 h；(6)+CGRP8-37 1 μmol/L和CGRP 100 nmol/L組：細胞用CGRP8-37(1 μmol/L)和CGRP(100 nmol/L)預處理1 h，再用TGF-β1(5 ng/ml)處理48 h。

1.2.6 BrdU法測定細胞增殖 細胞以6×103cells/well的密度種于96孔板，貼壁后用1% FBS的DMEM高糖培基處理24 h。細胞分別根據(jù)細胞實驗設計進行處理，處理結束時，每孔加入10 μl BrdU，正常培養(yǎng)條件下孵育4 h，固定液室溫孵育30 min，室溫孵育BrdU抗體90 min，PBS洗滌5 min×3，加入200 μl 底物，室溫反應15 min，每孔加入1 mol/L硫酸 25 μl，2 min之內(nèi)在450 nmol/L波長下用酶標儀檢測光密度值(OD值)。

1.2.7 real Time PCR檢測CGRP、eIF3a 、p27、α-SMA、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ mRNA的表達 用Trizol等試劑提取組織或細胞總RNA后，按逆轉錄試劑盒操作步驟進行RT反應。所得cDNA在實時熒光定量PCR儀(7500 Real Time PCR System, Applied Biosystem)上進行反應。按照說明，使用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，以2 μl cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參照，PCR擴增基因片段。引物如表1：

Tab. 1 Primer seguence

1.2.8 Western blot檢測eIF3a、p27、α-SMA、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達 低溫提取組織或細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣50 μg蛋白，12% SDS-PAGE分離樣品，轉膜，封閉，分別滴加GAPDH(1∶2 000)、eIF3a (1∶1 000)、p27 (1∶1 000)、α-SMA (1∶1 000)、 collagen I (1∶1 000) 一抗4℃過夜。洗膜, 相應二抗 (1∶2 000) 室溫孵育1 h。洗膜后將高靈敏的LunimataTMCrescendo發(fā)光劑加到膜的正面，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)進行拍照用，Image J 1.43(National Institutes of Health)軟件進行灰度值分析并比較各組蛋白表達差異。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 Capsaicin對博萊霉素誘導的肺纖維化大鼠肺組織結構的影響

HE染色發(fā)現(xiàn)Control組肺組織結構清晰，肺泡結構完整，無明顯炎癥細胞浸潤，成纖維細胞未見增生。相比之下，Bleomycin組肺組織肺泡壁厚度明顯增加、細胞外基質明顯增厚、肺間隔明顯增寬、大量炎癥細胞浸潤，成纖維細胞增生明顯，而Capsaicin + Bleomycin組的這一病理變化進一步加重(圖1)。以上結果表明當用辣椒素預先耗竭內(nèi)源性CGRP后可以加重博萊霉素誘導的肺纖維化。

Fig. 1 Effect of capsaicin on lung histology in bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats (HE ×100)

2.2 Capsaicin對博萊霉素誘導的肺纖維化大鼠肺組織α-SMA表達的影響

real time PCR、Western blot及免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，Bleomycin組肺組織α-SMA mRNA和蛋白表達水平明顯增高，而辣椒素預處理組α-SMA mRNA和蛋白表達水平進一步增高(P<0.01，圖2、圖3，表2)。以上結果表明當用辣椒素預先耗竭內(nèi)源性CGRP后可以加重博萊霉素誘導的α-SMA表達。

Fig. 2 Effect of capsaicin on α-SMA expression in lung tissue of bleomycin-induced pulmonary fibrosis rats (arrows indicated α-SMA positive staining) (Immunohistochemisty ×100)

2.3 Capsaicin對博萊霉素誘導的肺纖維化肺組織膠原表達的影響

與Control組相比，Bleomycin處理組Ⅰ型膠原mRNA及蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，而辣椒素預處理組Ⅰ型膠原mRNA及蛋白的表達進一步增高(P<0.05，圖3，表2)。Masson染色發(fā)現(xiàn)Control組肺組織肺泡間隔可見少量膠原纖維，Bleomycin組肺泡間隔可見大量膠原纖維增生，而Capsaicin+Bleomycin組膠原纖維的表達進一步增高(圖4)。以上結果表明當用辣椒素預先耗竭內(nèi)源性CGRP后可以加重博萊霉素誘導的肺組織膠原沉積。

Fig. 3 Effect of capsaicin on α-SMA and collagen Ⅰprotein expression in lung tissue of bleomycin-induced pulmonary fibrosis rats by Western blot CON: Control; BLM: Bleomycin; CAP: Capsaicin; α-SMA: α-smooth muscle actin

Groupα-SMAmRNAα-SMAproteincollagenⅠmRNAcollagenⅠproteinCON1.01±0.130.98±0.091.11±0.140.99±0.11BLM2.77±0.21**1.78±0.15**3.44±0.45**2.41±0.32**BLM+CAP3.76±0.48#2.45±0.32#4.77±0.53#3.42±0.38#

CON: Control; BLM: Bleomycin; CAP: Capsaicin; α-SMA: α-smooth muscle actin

**P<0.01vscontrol;##P<0.05vsbleomycin

Fig. 4 Effect of capsaicin on collagen accumulation in bleomycin-induced pulmonary fibrosis rats (Masson ×100)

2.4 Capsaicin對博萊霉素誘導的肺纖維化大鼠CGRP表達的影響

ELISA和real time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，Bleomycin組血漿及肺組織CGRP的表達顯著降低(P<0.01)，而用辣椒素預先耗竭內(nèi)源性CGRP后能夠進一步降低血漿及肺組織CGRP的表達(P<0.05，表3)。

GroupCGRP(pg/ml)α-CGRPmRNAβ-CGRPmRNACON45.38±7.281.01±0.131.04±0.21BLM32.08±4.74**0.55±0.27**0.58±0.24**BLM+CAP20.46±5.35#0.38±0.22#0.39±0.33#

CON: Control; BLM: Bleomycin; CAP: Capsaicin; CGRP: Calcitonin gene-related peptide

**P<0.01vscontrol;##P<0.05vsbleomycin

2.5 Capsaicin對博萊霉素誘導肺纖維化大鼠肺組織eIF3a、p27表達的影響

real time PCR和Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，Bleomycin處理組eIF3a表達水平明顯增高，p2表達水平明顯降低(P<0.01)。而用辣椒素預先耗竭內(nèi)源性CGRP后能夠進一步增加eIF3a的表達、降低p27的表達(P<0.05，圖5，表4)。以上結果表明當用辣椒素預先耗竭內(nèi)源性CGRP后，肺組織eIF3a的表達進一步上調而p27的表達進一步下調。

Fig. 5 Effect of capsaicin on eIF3a and p27 protein expression in lung tissue of bleomycin-induced pulmonary fibrosis rats by Western blot CON: Control; BLM: Bleomycin; CAP: Capsaicin; eIF3a: Eukaryotic translation initiation factor 3a

GroupIF3amRNAeIF3aproteinp27mRNAp27proteinCON0.97±0.091.08±0.101.01±0.041.04±0.12BLM1.87±0.23**2.32±0.22**0.58±0.05**0.55±0.09**BLM+CAP2.43±0.31#3.11±0.29#0.41±0.11#0.38±0.08#

CON: Control; BLM: Bleomycin; CAP: Capsaicin; eIF3a: Eukaryotic translation initiation factor 3a

**P<0.01vscontrol;##P<0.05vsbleomycin

2.6 CGRP對TGF-β1誘導的大鼠原代肺成纖維細胞eIF3a、p27表達的影響

real time PCR和Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能明顯促進肺成纖維細胞eIF3a的表達、降低p27的表達(P<0.01)，CGRP可劑量依賴性的抑制TGF-β1所誘導的eIF3a的表達、促進TGF-β1誘導的p27的表達，而CGRP的抑制劑CGRP8-37可取消此作用(圖6、圖7，表5)。

2.7 CGRP對TGF-β1誘導的大鼠原代肺成纖維細胞α-SMA、Ⅰ型膠原表達的影響

real time PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能明顯促進肺成纖維細胞α-SMA及Ⅰ型膠原的表達(P<0.01vsControl)，CGRP (1, 10, 100 nmol/L)可劑量依賴性的抑制TGF-β1所誘導的α-SMA和Ⅰ型膠原的表達，而CGRP的抑制劑CGRP8-37可以取消此作用(圖8、圖9，表6)。

Fig. 6 Effect of CGRP on TGF-β1-induced the expression of eIF3a in cultured pulmonary fibroblasts

Fig. 7 Effect of CGRP on TGF-β1-induced the expression of p27 in cultured pulmonary fibroblasts

GroupBrdUincorporationeIF3amRNAeIF3aproteinp27mRNAp27proteinControl0.19±0.070.95±0.091.02±0.111.04±0.121.05±0.14TGF-β1(5ng/ml)1.12±0.17**2.96±0.35**3.97±0.41**0.26±0.06**0.38±0.05**+CGRP(1nmol/L)0.72±0.13#2.13±0.22#3.02±0.33#0.49±0.08#0.53±0.07#+CGRP(10nmol/L)0.64±0.15##1.94±0.20##2.63±0.29##0.56±0.11##0.62±0.05##+CGRP(100nmol/L)0.53±0.11##1.64±0.18##2.22±0.23##0.67±0.07##0.75±0.06##+CGRP(100nmol/L)&CGRP8-37(1μmol/L)0.91±0.20△△2.89±0.31△△3.68±0.36△△0.29±0.06△△0.41±0.08△△

CGRP8-37: CGRP receptor inhibitor; TGF-β1: Tumor grouth factor β1

**P<0.01vscontrol;##P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1;#△△P<0.01vsCGRP (100 nmol/L)

Groupα-SMAmRNAα-SMAproteincollagenⅠmRNAcollagenⅠproteinControl1.01±0.111.00±0.141.05±0.120.98±0.14TGF-β1(5ng/ml)4.51±0.61**3.89±0.52**5.24±0.71**4.03±0.55**+CGRP(1nmol/L)3.23±0.34#2.98±0.41#3.51±0.53#2.99±0.42#+CGRP(10nmol/L)2.94±0.37##2.54±0.37##3.15±0.48##2.61±0.38##+CGRP(100nmol/L)2.64±0.29##2.11±0.32##2.86±0.37##2.37±0.31##+CGRP(100nmol/L)&CGRP8-37(1μmol/L)4.08±0.72△△3.65±0.51△△4.87±0.69△△3.85±0.42△△

CGRP8-37: CGRP receptor inhibitor

**P<0.01vscontrol;##P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1;#△△P<0.01vsCGRP (100 nmol/L)

Fig. 8 Effect of CGRP on TGF-β1-induced expression of α-SMA in cultured pulmonary fibroblasts

Fig. 9 Effect of CGRP on TGF-β1-induced expression of type I collagen in cultured pulmonary fibroblasts

3 討論

博萊霉素(bleomycin)是一種細胞毒性抗惡性腫瘤藥物，該藥的毒副作用之一是引起肺纖維化。動物實驗已證實，博萊霉素所致肺纖維化病理組織學改變與人類肺纖維化非常相似，普遍作為研究肺纖維化的模型[10]。本研究進一步證明博萊霉素造模28 d后肺組織肺泡壁厚度明顯增加、大量炎癥細胞浸潤，成纖維細胞明顯增生、細胞外基質明顯增厚、膠原和α-SMA表達明顯增加。最近研究發(fā)現(xiàn)在CO2和石棉誘導的肺損傷并發(fā)肺纖維化的患者中，肺組織CGRP的表達明顯降低[7]。而在博萊霉素誘導肺纖維化大鼠模型中發(fā)現(xiàn)肺組織CGRP的表達明顯降低，用capsaicin耗竭內(nèi)源性CGRR后能明顯加重博萊霉素誘導的肺纖維化。本研究結果表明CGRP參與了肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

肺纖維化過程中，細胞因子或炎性因子誘導成纖維細胞增殖的機制尚未完全闡明。文獻報道，真核翻譯起始因子(如eIF2α、eIF4E等)參與了不同組織成纖維細胞增殖的調控，如過表達eIF4E能夠促進大鼠胚胎成纖維細胞的增殖[11,12]。近年來的研究表明eIF3的多個亞基在腫瘤細胞中存在異常表達，與腫瘤細胞的增殖、侵襲、分化及預后相關[2]。eIF3a是eIF3中最大的亞基，于1976年從兔網(wǎng)狀細胞中分離得到，分子量為170 kD[13]。研究表明抑制eIF3a可下調p27的表達，抑制cyclin-CDK復合物磷酸化，使細胞生長停滯在G1期，從而抑制細胞增殖[14]。p27作為一種CDKI，能夠通過多種方式調控細胞周期，其結果是抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。p27對細胞周期的控制主要是通過與cyclin E/CDK2的相互作用而使得細胞周期阻滯于G1/S[15]。最新的研究發(fā)現(xiàn)eIF3a通過下調p27的表達而參與了肺成纖維細胞增殖的調控，與肺纖維化的形成有關[5]。本研究發(fā)生在博萊霉素誘導發(fā)肺纖維化大鼠模型中，eIF3a的表達明顯升高而p27表達顯著降低，當用capsaicin耗竭內(nèi)源性CGRR后，肺組織eIF3a的表達進一步上調而p27表達進一步降低。而外源性CGRP能夠劑量依賴性抑制TGF-β1誘導肺成纖維細胞eIF3a的表達，上調p27的表達，而CGRP的抑制劑CGRP8-37可取消此作用。這些結果提示，CGRP可能通過抑制eIF3a，進而上調p27的表達，從而抑制了肺纖維化的形成。

綜上所述， CGRP在博萊霉素誘導的肺纖維化中起著重要作用，其可能通過抑制eIF3a、上調p27的表達而抑制肺成纖維細胞的增殖，進而抑制肺纖維化的形成與發(fā)展。

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Effects of calcitonin gene-related peptide on eIF3a and p27 expression in bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats

LI Xian-wei△, ZUO Dong-ze, SHEN Yuan-yuan, HAO Wei

(Department of Pharmacology, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China)

Objective: To observe the effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on eukaryotic translation initiation factor 3a (eIF3a) and p27 expression in bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats and its possible mechanism. Methods: Twenty-four male SD rats weighing 180～220 g were randomly divided into three groups (n=8): control group, bleomycin group, bleomycin plus capsaicin group. Bleomycin (5 mg/kg) was used to induce pulmonary fibrosis rat model. Rats were given capsaicin (50 mg/kg·d) by subcutaneous injections 4 days before to deplete endogenous CGRP. At the end of experiments, blood samples were collected from carotid artery to determinate the plasma levels of CGRP by ELISA. The cells were divided into 6 groups as follows: control group, transforming growth factor-β1 (TGF-β1) group, +CGRP (1, 10, 100 nmol/L) group, +CGRP 100 nmol/L and CGRP8-37 1 μmol/L group respectively(n=9). TGF-β1 (5 ng/ml) stimulated proliferation of pulmonary fibroblasts and proliferation was measured by BrdU marking. The expression levels of eIF3a, p27, α-smooth muscle actin (α-SMA) and collagen Ⅰ were detected by immunohistochemisty, real-time PCR or Western blot. Results: The expressions of eIF3a, α-SMA, and collagen I were increased and the expression of p27 was decreasing in pulmonary fibrosis rats induced by bleomycin. Exogenous application of CGRP significantly inhibited TGF-β1-induced proliferation and differentiation of pulmonary fibroblasts and the expressions of α-SMA, collagen I and eIF3a, and upregulated the expression of p27. All these effects of CGRP were abolished in the presence of CGRP8-37. Conclusion: These results suggest that endogenous CGRP is related to the development of pulmonary fibrosis induced by bleomycin, and the inhibitory effect of CGRP on proliferation of lung fibroblasts involves the eIF3a/p27 signaling pathway.

calcitonin gene-related peptide; pulmonary fibrosis; pulmonary fibroblasts; eIF3a; p27; rat

安徽省自然科學基金資助項目(1408085QH168)

2016-04-07 【修回日期】2016-10-12

R966

A

1000-6834(2017)01-016-06

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