汪志文 黃瑜 張海艷 湯菊芬 簡(jiǎn)紀(jì)常 魯義善

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088）

尼羅羅非魚NITR基因的克隆鑒定與組織表達(dá)分析

汪志文 黃瑜 張海艷 湯菊芬 簡(jiǎn)紀(jì)常 魯義善

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088）

從尼羅羅非魚脾臟組織中克隆獲得新型免疫受體（NITR，Novel immune-type receptor）基因的編碼區(qū)序列（GenBank登錄號(hào)：KX989509；命名為On-NITR），該基因cDNA全長(zhǎng)1 119 bp，ORF為1 026 bp，可編碼341個(gè)氨基酸，理論分子量為 37.38 kD，等電點(diǎn)為8.28。通過(guò)NCBI BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)羅非魚NITR與其他已報(bào)道的物種NITR氨基酸序列相似度為27%-46%。氨基酸序列分析顯示：On-NITR具有1個(gè)信號(hào)肽區(qū)域、2個(gè)胞外Ig-domain區(qū)、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，以及1個(gè)胞質(zhì)尾區(qū)，該胞質(zhì)尾區(qū)含有NITR典型的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）和一個(gè)ITIM類似基序itim，且具有較高的保守性。熒光定量PCR分析顯示，On-NITR在健康尼羅羅非魚組織中均有表達(dá)，在腸道、皮膚、肝臟表達(dá)水平較高，在胸腺、鰓、脾臟、心臟、腦組織中的表達(dá)量較低，在頭腎組織中的表達(dá)量最低。

尼羅羅非魚；NITR蛋白；基因克隆；組織表達(dá)分析

免疫球蛋白基因超家族（IgSF）是一類分子結(jié)構(gòu)中含有類似免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域（Ig 結(jié)構(gòu)域）、不依賴Ca2+的細(xì)胞黏附分子。IgSF的所有成員都有3個(gè)共同保守區(qū)域：免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（Ig）、跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane）和胞質(zhì)尾區(qū)（Cytoplasmicregion）。IgSF的蛋白功能主要體現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中，負(fù)責(zé)參與相關(guān)免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。在先天性免疫和獲得性免疫受體中的IgSF有很多類型，如免疫球蛋白（Ig）和 T細(xì)胞抗原受體（TCR）、自然殺傷細(xì)胞受體和細(xì)胞黏附分子等［1-3］。NITRs作為IgSF家族中的一員，在相關(guān)結(jié)構(gòu)上高度保守。主要包括1-2個(gè)胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域（1個(gè)IgV和1個(gè)Ig（V / C2）域）、1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)含有1-2個(gè)免疫受體酪氨酸抑基序（ITIMs）的胞質(zhì)尾區(qū)。在功能研究上，斑馬魚ITIM在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的表達(dá)驗(yàn)證了ITIM在體外具有調(diào)節(jié)免疫抑制信號(hào)功能［4，5］；斑點(diǎn)叉尾鮰NITR［6］的發(fā)現(xiàn)確定了它的免疫生物學(xué)功能，并有11種不同類型的NITR基因在斑點(diǎn)叉尾鮰上被鑒定出來(lái)，這些不同類型的NITR基因在胞外Ig結(jié)構(gòu)域、連接區(qū)（Joining regions）、跨膜結(jié)構(gòu)域和ITIM的數(shù)量上展現(xiàn)出多樣性的特征。目前NITR已在7種硬骨魚類中被鑒定發(fā)現(xiàn)：河豚（Spheroides nephelus）［7，8］，斑馬魚（Danio rerio）［9］，斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［6］，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［10］、鯉（Cyprinus carpio）［11］、日本比目魚（Paralichthys olivac-eus）［12］和 青 鳉（Oryzias latipes）［13］。但是迄今為止NITR及其同系物并沒(méi)有在哺乳動(dòng)物中被鑒定發(fā)現(xiàn)［14］。

近年來(lái)，針對(duì)NITRs的功能及其在進(jìn)化過(guò)程中作用的研究正成為熱點(diǎn)。Shen等［15］在鯰魚NK-like細(xì)胞中檢測(cè)到NITR，但是NITRs的特定細(xì)胞譜系并不確定。另外，NITR的特異性結(jié)合配體現(xiàn)在也不清楚，但是可以確定它們能與某些異體細(xì)胞表面上的靶位結(jié)合［16］。Rojo等［17］發(fā)現(xiàn)斑馬魚對(duì)鰻利斯頓氏菌發(fā)生免疫應(yīng)答后的NITR在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生上調(diào)，并推測(cè)NITR在免疫方面有著重要作用。Litman 等［14］發(fā)現(xiàn)NITRs的整體結(jié)構(gòu)和胞質(zhì)信號(hào)與哺乳動(dòng)物的自然殺傷性細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIRs）類似，推測(cè)NITR可能是先天性免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程中重要的組成階段。

羅非魚作為世界上廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚類，同時(shí)也是我國(guó)南方重要的養(yǎng)殖魚類之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［20］。鑒于NITR在硬骨魚類中的免疫功能中的特殊地位，本研究對(duì)羅非魚NITR分子進(jìn)行了克隆鑒定，并對(duì)該基因及其氨基酸序列特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；同時(shí)研究了該基因在羅非魚健康組織中的表達(dá)情況，旨在為進(jìn)一步研究羅非魚NITR分子生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用健康尼羅羅非魚購(gòu)自湛江市東風(fēng)市場(chǎng)，體質(zhì)量規(guī)格約100±10 g/尾；克隆載體pMD18-T Vector購(gòu)自TaKaRa公司（大連）；Easy Taq酶、Ex Taq酶來(lái)自北京全式金公司；PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚Total RNA的提取和cDNA的合成 實(shí)驗(yàn)用羅非魚在實(shí)驗(yàn)室條件下（28±2）℃暫養(yǎng)4周后，取健康尼羅羅非魚脾臟組織10-20 mg，再按照北京全式金TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒說(shuō)明書提取羅非魚脾臟的Total RNA。將提取的羅非魚脾臟Total RNA按照北京全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說(shuō)明方法反轉(zhuǎn)成cDNA第一鏈。

1.2.2 羅非魚NITR基因全長(zhǎng)的克隆 依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室羅非魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的NITR分子，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)羅非魚NITR基因克隆引物On-NITR-1F、On-NITR-1026R（表1），然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件參照北京全式金2×EasyTaq PCR SuperMix說(shuō)明書進(jìn)行，之后電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將目的條帶切膠回收后與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α中，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定后，將陽(yáng)性克隆送廣州生工測(cè)序。

1.2.3 羅非魚NITR基因的生物信息學(xué)分析 陽(yáng)性克隆的測(cè)序結(jié)果用DNAMAN Version 6軟件進(jìn)行拼接，從而獲得On-NITR cDNA全長(zhǎng)序列。通過(guò)NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行On-NITR序列比對(duì)分析；通過(guò)ORF Finder（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/）進(jìn)行開(kāi)放閱讀框確定；通過(guò)ExPASy ProtParam tool（http://web.expasy.org/protpar am/）進(jìn)行On-NITR氨基酸序列推導(dǎo)和相關(guān)理化性 質(zhì) 分 析；通 過(guò)Softberry（http://linux1.softberry. com/berry.phtml?topic =psite&group=programs&subgro up=proloc）進(jìn)行氨基酸基本功能位點(diǎn)分布預(yù)測(cè)；通過(guò) SignalP 4.0 Server（http://www.cbs.Dtu.dk/services/ signalp）進(jìn)行信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)；通過(guò)TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；通過(guò)Inter ProScan Sequence search（http://www.ebi.ac.uk/Tools） 和 SMART（http://smart. embl-heidelberg.de/）進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析；通過(guò) SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=npsa_sopma.html）、SWISSM-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/Interactive）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析；通過(guò)Clutalx和Genedoc軟件進(jìn)行氨基酸同源序列比對(duì)分析。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.4 羅非魚NITR的組織表達(dá)分析 重新利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物On-RT-NITR-F、On-RT-NITR-R。以β-actin為內(nèi)參基因，通過(guò)ABI 7500 Real-Time定量PCR儀分析進(jìn)行qRT-PCR。分析On-NITR在試驗(yàn)中的各個(gè)組織中的表達(dá)分布。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔作為平行。RT-PCR條件參照TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行。具體的反應(yīng)條件為：預(yù)變性 94℃ 30 s；94℃5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s（Dissociation Stage）。通過(guò)2-△△Ct方法計(jì)算羅非魚NITR基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 On-NITR基因的克隆

用On-NITR-1F、On-NITR-1026R作為引物，羅非魚脾臟組織cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物測(cè)序后經(jīng)NCBI Blast分析判定該擴(kuò)增產(chǎn)物為羅非魚NITR基因。用本試驗(yàn)中羅非魚NITR基因序列命名為On-NITR（GenBank登錄號(hào)：KX989509），該基因全長(zhǎng)1 119 bp，5'非編碼區(qū)為39 bp，3'非編碼區(qū)為55 bp，ORF為1 026 bp，可編碼341個(gè)氨基酸（圖1）。

2.2 On-NITR生物信息學(xué)分析

2.2.1 On-NITR氨基酸序列理化性質(zhì)分析 ProtParam在線分析結(jié)果顯示，羅非魚NITR蛋白的理論分子量為 37.38 kD，理論等電點(diǎn)（PI）為8.28。推測(cè)的氨基酸序列中絲氨酸（Ser）的含量最高，比例為10%；亮氨酸（Leu） 含量次之，為9.4%；色氨酸（Trp）含量最低，為0.6%。其中帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）有34個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）有30 個(gè)。不穩(wěn)定指數(shù)為36.85，歸類為1個(gè)穩(wěn)定的蛋白。該蛋白脂溶指數(shù)（Aliphatic index）為96.04，總的平均親水值為0.098，很有可能是疏水性蛋白且疏水性不強(qiáng)。ProtScale 分析表明羅非魚NITR蛋白疏水性氨基酸殘基數(shù)目在整體上稍微略高于親水性氨基酸殘基數(shù)目，疏水性不是很明顯（圖2），為疏水性蛋白，與理化分析的結(jié)果一致，因此推測(cè)羅非魚NITR基因編碼的蛋白質(zhì)為疏水性蛋白質(zhì)。

使用Signal P 4.1 Server預(yù)測(cè)該序列的信號(hào)肽（Signal peptide），發(fā)現(xiàn)前19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，為分泌型蛋白；利用TMHMM Server 2.0預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)在第251-273位氨基酸之間存在跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3）。SoftBerry-Psite預(yù)測(cè)該序列功能位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該序列酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)6個(gè)，N-糖基化位點(diǎn)和蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)各有5個(gè)，N-豆蔻?；稽c(diǎn)4個(gè)，cAMP 和 cGMP相關(guān)磷酸化位點(diǎn)、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)以及原生質(zhì)膜脂筏附著位點(diǎn)各有1個(gè)，CAAX box 6個(gè)，C末端定位信號(hào)序列微體6個(gè)。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)On-NITR蛋白在細(xì)胞中各位置的分布概率：細(xì)胞膜（64%），高爾基體（46%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（膜）（68.5%），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（腔）（10%）， 由 Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）對(duì)On-NITR進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)的結(jié)果為細(xì)胞膜，這與該蛋白作為分泌型免疫受體的預(yù)測(cè)結(jié)果相互佐證。

2.2.2 On-NITR的高級(jí)結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 通過(guò)SOPMA分析羅非魚NITR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中由109個(gè)氨基酸組成延伸鏈（Extended strand），占31.96%；由97個(gè)氨基酸組成α螺旋（Alpha helix），占28.45%；由95個(gè)氨基酸組成無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)（Random coil），占27.86%；由40個(gè)氨基酸組成β折疊結(jié)構(gòu)（（Beta turn）占11.73%。利用SWISS-MODLE在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)工具發(fā)現(xiàn)，On-NITR蛋白屬于免疫折疊蛋白，且與斑馬魚NITR蛋白具有一定的相似性，分析發(fā)現(xiàn)On-NITR蛋白結(jié)構(gòu)模型與預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果一致（圖4）。

圖1 羅非魚NITR及其推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2 羅非魚NITR蛋白親疏水性預(yù)測(cè)

圖3 羅非魚NITR蛋白擴(kuò)膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖4 羅非魚NITR蛋白（A）與斑馬魚NTIR蛋白（B）三維結(jié)構(gòu)

2.2.3 On-NITR同源性及進(jìn)化分析 將本研究On-NITR基因編碼的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)公布的其他物種的NITR氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們的相似度為27%-46%（表2），這與目前報(bào)道的其他物種間NITR的比對(duì)結(jié)果一致。

表2 羅非魚NITR蛋白與其他物種NITR蛋白比對(duì)

運(yùn)用ClustalW軟件將羅非魚NITR的氨基酸序列與虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、斑馬魚（Danio rerio）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）及桔點(diǎn)圓鲀（Spherodoies nephelus）等物種的NITR氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)（圖5）。綜合NCBI 對(duì)各物種的BLAST和InterPro在線軟件對(duì)各物種氨基酸的功能分析發(fā)現(xiàn)該序列含有1個(gè)信號(hào)肽區(qū)域和2個(gè)Igdomain區(qū)為IgV（25-139）、Ig（147-247），且分別包含1個(gè)甘氨酸連接橋區(qū)（GXG和FGXG），1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)（251-273），以及1個(gè)胞質(zhì)尾區(qū)（274-341），該胞質(zhì)尾區(qū)含有NITR典型的ITIM基序（305-312）（免疫受體酪氨酸抑制基序，Immunoreceptor tyrosinebased inhibitor motifs）和1個(gè)ITIM類似基序itim（321-326），且具有較高的保守性（圖5）。

2.3 On-NITR的組織表達(dá)分析

通過(guò)ABI 7500Real-Time定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR分析，檢測(cè)健康羅非魚各組織NITR基因的表達(dá)量，結(jié)果（圖6）顯示，On-NITR基因在所取的9個(gè)組織中均能表達(dá)，在腸道中表達(dá)量最高，其次是皮膚、肝臟，在胸腺、鰓、脾臟、心臟、腦中的表達(dá)量較少，在頭腎組織中的表達(dá)量最少。

圖5 羅非魚NITR與其他物種的同源性比較

圖6 羅非魚NITR在不同組織中的表達(dá)情況

3 討論

本研究對(duì)依托實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的羅非魚NITR分子進(jìn)行了克隆鑒定，并推導(dǎo)出編碼的NITR氨基酸序列。BLAST分析顯示On-NITR序列與其他已報(bào)道的硬骨魚類之間的同源性為27%-46%。

盡管On-NITR與硬骨魚類的比對(duì)呈現(xiàn)較低的同源性，但是結(jié)構(gòu)上都具有胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域（Ig domain）—IgV和Ig（V/C2），并包含相應(yīng)的甘氨酸連接橋基序（The glycine bulges of the joining mitif）［21］，1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域以及1個(gè)含有免疫抑制酪氨酸基序（ITIM）的胞質(zhì)尾區(qū)，并且高度保守。On-NITR的兩個(gè)胞外Ig結(jié)構(gòu)域內(nèi)各含有一個(gè)甘氨酸連接橋區(qū)域GXG（GQG128）和FGXG（FGNG241），并含有8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，這與斑馬魚、虹鱒等［6，8］其他硬骨魚類相一致。所有的半胱氨酸殘基都位于胞外區(qū)域，表明On-NITR蛋白可能與其他物種的Ig區(qū)半胱氨酸具有相同的功能—形成二硫鍵結(jié)合區(qū)；此外，On-NITR（N-X-S/T-X）的5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)也全部都位于胞外Ig區(qū)，其他已報(bào)道的硬骨魚類含有2-7個(gè)，這些Ig區(qū)域的糖基化位點(diǎn)與該受體的黏附作用和識(shí)別其他抗原的功能息息相關(guān)［22］，這意味著On-NITR的Ig區(qū)可能在細(xì)胞間的黏附作用中起著關(guān)鍵作用。

在On-NITR的胞質(zhì)尾區(qū)，含有1個(gè)免疫抑制酪氨酸抑制基序（ITIM，LHYAAL312）和1個(gè)類似 ITIM基 序 —itim（CVYSRV326）。On-NITR的ITIM區(qū)結(jié)構(gòu)上與Ravetch等［23］提出的ITMI基序結(jié)構(gòu)（I/V/L/S）XYXX（V/L）相一致，具有較高保守性，而itim基序不盡相同。Blery等［24］發(fā)現(xiàn)（I/V/S）TYSX（L/V）型基序只是屬于7種自然殺傷性細(xì)胞受體基序的一種，itim基序的出現(xiàn)表明ITIM基序在硬骨魚類中也存在一定的多樣性［25］。已有報(bào)道將含有正常的ITIM基序受體和ITIM基序中酪氨酸殘基發(fā)生突變的受體進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，ITIM基序在調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞受體抑制信號(hào)和結(jié)合其他免疫球蛋白受體方面具有重要作用［26，27］，On-NITR 的ITIM基序與上游的跨膜結(jié)構(gòu)域相隔33個(gè)氨基酸，itim和ITIM中所含有的酪氨酸之間相距23個(gè)氨基酸，這與Bléry等［24］報(bào)道的哺乳動(dòng)物自然殺傷細(xì)胞受體上的距離長(zhǎng)度非常類似，通過(guò)蛋白空間構(gòu)象與功能的密切聯(lián)系，可以推測(cè)On-NITR上的ITIM基序在功能上可能也相對(duì)保守。

有意思的是，On-NITR蛋白的結(jié)構(gòu)特征與先天性免疫中的自然殺傷細(xì)胞免疫抑制受體（KIRs）類似［28］，與白細(xì)胞受體集群所編碼的免疫抑制受體所具有的調(diào)控位點(diǎn)和其他結(jié)構(gòu)特征一樣，但是KIRs不含有IgV結(jié)構(gòu)域和甘氨酸連接橋基序（J motif）。此外，On-NITR蛋白的結(jié)構(gòu)特征與適應(yīng)性免疫中的T細(xì)胞受體（TCRs）和免疫球蛋白（Igs）也非常相近［9］，都含有IgV結(jié)構(gòu)域和甘氨酸連接橋基序。說(shuō)明NITR蛋白很可能兼有先天性免疫和獲得性免疫蛋白結(jié)構(gòu)特征。

組織分布結(jié)果顯示，On-NITR在羅非魚的腸道、皮膚、肝臟中表達(dá)量較高；其次是胸腺、鰓、脾臟、心臟及腦，在頭腎中的表達(dá)量最低。目前已報(bào)道的不同魚類的NITR基因在各組織中的表達(dá)情況差異較大，日本比目魚［12］和鯉［11］NITR在頭腎、脾臟和腸道中發(fā)生高水平表達(dá)，而斑點(diǎn)叉尾鮰［6］NITR1在頭腎、脾臟中表達(dá)量較高，但是NITR 2-4在腸道和頭腎中表達(dá)量很低，虹鱒［10］脾臟和頭腎中NITR1、NITR4都很高，但是NITR2、NITR3表達(dá)量很低。推測(cè)On-NITR的表達(dá)情況可能與NITR的類型有關(guān)。此外，NITR主要在硬骨魚類的巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞及NK-like細(xì)胞中被檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，并且在各種不同細(xì)胞中的表達(dá)情況也具有一定差異［6］，暗示著On-NITR表達(dá)的差異情況很可能是由于不同組織的細(xì)胞種類不同而造成的。

4 結(jié)論

本研究成功克隆并獲得羅非魚NITR基因，該基因cDNA全長(zhǎng)1 119 bp，ORF為1 026 bp，可編碼341個(gè)氨基酸。利用生物信息學(xué)相關(guān)方法對(duì)On-NITR蛋白結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)On-NITR具有1個(gè)信號(hào)肽區(qū)域、2個(gè)胞外Ig-domain區(qū)、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)有NITR典型的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）的胞質(zhì)尾區(qū)，且具有較高的保守性。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)On-NITR在健康尼羅羅非魚組織中均有表達(dá)，在腸道、皮膚、肝臟表達(dá)水平較高，在胸腺、鰓、脾臟、心臟和腦組織中的表達(dá)量較低，在頭腎組織中的表達(dá)量最低。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning and Tissue Expression Analysis of NITR in Nile Tilapia（Oreochromis niloticus）

WANG Zhi-wen HUANG Yu ZHANG Hai-yan TANG Ju-fen JIAN Ji-chang LU Yi-shan
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemilogy for Aquatic Economic Animals，Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutes，F(xiàn)isheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088）

The encoding sequence of NITR（Novel immune-type receptor）gene（GenBank accession number：KX989509；designated as On-NITR）was cloned from the spleen of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）. The complete cDNA sequence of On-NITR gene was 1 119 bp with an ORF of 1 026 bp encoding 341 amino acids. The deduced amino acid sequence of On-NITR had an estimated molecular weight of 37.38 kD and a theoretical pI of 8.28. Through NCBI BLAST，we found the amino acid sequence identities between On-NITR and previously reported fish NITRs were approximately 27% - 46%. Amino acid alignment indicated that On-NITR consisted of one typical signal peptide，two extracellular immunoglobulin（Ig）domains（V and V/C2），one transmembrane domain，and one highly conserved the cytoplasmic region with an immunoreceptor tyrosine-based inhibitor motif（ITIM）and an ITIM-like motif（itim）. Moreover，the analysis by real time quantitative PCR revealed that the expression of On-NITR was detected in all examined tissues of a healthy Nile tilapia with the higher expression level in intestine，skin and liver，while lower expression in thymus，gill，spleen，heart，and brain as well as the lowest level in head and kidney.

Nile tilapia（Oreochromis niloticus）；NITR protein；gene cloning；tissue expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.021

2016-11-06

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015A020209181），2016年廣東海洋大學(xué)優(yōu)秀學(xué)位論文培育項(xiàng)目（201602）

汪志文，男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病害控制；E-mail：1278799202@qq.com

魯義善，男，教授，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病害控制；E-mail：fishdis@163.com