盧守亮 李良遠 高磊 沈敏 萬鵬程 石國慶 代蓉

（新疆農墾科學院 省部共建綿羊遺傳育種與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，石河子 832000）

不同品種綿羊發(fā)情周期LEPRb mRNA表達分析

盧守亮 李良遠 高磊 沈敏 萬鵬程 石國慶 代蓉

（新疆農墾科學院 省部共建綿羊遺傳育種與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，石河子 832000）

為了探討LEPR在綿羊季節(jié)性發(fā)情中的表達特點，以季節(jié)性發(fā)情的中國美利奴和常年發(fā)情的多浪羊為研究對象，利用實時熒光定量PCR技術檢測繁殖季節(jié)不同發(fā)情階段LEPRb mRNA在下丘腦、卵巢和子宮組織中的表達變化。結果顯示，在發(fā)情間期、前期和發(fā)情期中國美利奴卵巢和子宮組織LEPRb的相對表達水平都低于下丘腦，但在發(fā)情后期卵巢和子宮LEPRb的相對表達水平顯著高于下丘腦。不同發(fā)情時期，兩品種綿羊同一組織的LEPRb的表達變化幅度有所差異，但趨勢相似。且中國美利奴各組織LEPRb的表達水平都高于常年發(fā)情的多浪羊。LEPRb的表達變化與綿羊發(fā)情存在相關關系。

綿羊；LEPRb；表達水平；發(fā)情周期；實時定量PCR

在進化的長河中，自然界中的動、植物為了種族的延續(xù)和發(fā)展，逐漸進化形成在特定的繁育特性，綿羊的季節(jié)性繁殖就是一個自然選擇和適應的結果。許多綿羊品種特別是細毛羊品種具有季節(jié)性繁殖特點。在現(xiàn)代綿羊養(yǎng)殖生產中，提高綿羊的繁殖效率是增產增收的關鍵環(huán)節(jié)。結合MOET技術可以實現(xiàn)綿羊一年兩產或兩年三產，但需要投入大量的人力物力，而且在非繁殖季節(jié)外源激素處理的效果有時也差強人意。因此打破發(fā)情特性實現(xiàn)常年發(fā)情，提高綿羊的繁殖效率，選育具有常年發(fā)情特性的細毛羊品種是規(guī)?；B(yǎng)殖過程中急需解決的問題，而深入解析綿羊季節(jié)性發(fā)情的分子基礎和作用機制是定向選育的第一步。

Leptin（瘦素）是肥胖基因（Obese gene，Ob）的表達產物，是一種由脂肪細胞分泌的多功能細胞因子，在能量平衡、食欲調節(jié)和繁殖方面起重要作用，主要在脂肪組織中表達，在其他組織中也有少量表達［1］。脂肪細胞分泌的leptin與血清蛋白結合，運輸?shù)桨薪M織，轉變成游離的leptin［2］，與受體結合作用于代謝調節(jié)中樞從而發(fā)揮其生物學功能。1996年小鼠的leptin受體被成功克?。?］。Leptin受體包括6種異構體（LEPR a-f），其中長型受體LEPRb為主要的功能性受體，在leptin的信號轉導中起重要作用。有研究表明leptin及其受體的表達變化與哺乳動物繁殖性能有一定關系［4］。ob/ob（leptin基因突變）和db/db（LEPRb基因突變）肥胖小鼠均無繁殖能力，ob/ob小鼠皮下注射外源leptin可使其體重和繁殖性能恢復正常［5］，給性成熟前的小鼠注射人重組leptin會使小鼠的初情期提前［6］，青春期時血清leptin會早于生殖激素/性激素開始上升，激活性腺軸，進而對青春期生殖功能的發(fā)育進行調節(jié)。Di等［7］發(fā)現(xiàn)給性成熟前的兔子注射大劑量的letpin會抑制排卵，但低劑量長時間的注射會促進幼兔卵泡發(fā)育和排卵。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊外周血中的leptin含量存在顯著的品種差異［8，9］，推測leptin參與綿羊發(fā)情調控，但其具體的調控機制和作用方式仍不明確。因此，本研究以發(fā)揮leptin主要生物學功能的長型受體為研究對象，分析其在發(fā)情周期的不同階段和不同組織中的表達變化，為探討leptin參與調控綿羊發(fā)情的作用機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇年齡相近（3-4歲）、體況相似、健康的中國美利奴（軍墾型）（新疆農墾科學院試驗羊場）和多浪羊（新疆農墾科學院試驗羊場）各12只，統(tǒng)一飼養(yǎng)管理。秋分后開始早晚公羊試情，跟蹤2個情期后采集不同發(fā)情時期的組織樣品（下丘腦、卵巢和子宮）［10］，并迅速置于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成 Trizol（Invitrogen）一步法提取各組織總RNA，0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，核酸蛋白分析儀（Implen）檢測RNA濃度及純度。參照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）說明書合成cDNA第一鏈。

1.2.2 綿羊LEPRb基因實時熒光定量PCR檢測 分別以各組織樣品的cDNA為模板，以持家基因GAPDH 為內參，利用實時熒光定量PCR方法檢測 LEPRb的表達水平，每個樣品設置3個重復。參考綿羊LEPRb（U62124.1）序列和GAPDH（NM_001190390.1）序列信息設計檢測引物（表1）。依照LightCycler 480 SYBR Green I Master（Roche）試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR分析，反應條件為：95℃預變性10 min；95℃ 10 s；60℃ 20 s；72℃ 25 s；45個循環(huán)。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

1.2.3 實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析 采用2-ΔΔCT法分析不同組織中LEPRb基因表達變化，SPSS 16.0軟件單因素方差分析對結果進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 總RNA的提取及目的基因擴增

提取的各組織總RNA 經(jīng)0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示總RNA完整性較好且無蛋白和基因組DNA污染；核酸蛋白分析儀檢測OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，各組織總RNA濃度及純度符合試驗要求。分別以不同組織總RNA為模板反轉錄合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，利用LEPRb與GAPDH特異引物擴增目的片段，PCR 產物與預期大小相符且擴增片段特異。

2.2 LEPRb在不同品種綿羊發(fā)情不同時期的組織表達變化

將下丘腦組織LEPRb 表達水平定義為1，對定量PCR檢測結果進行標準化處理。圖1所示為LEPRb在不同綿羊品種不同發(fā)情階段各組織表達情況。整個發(fā)情過程中，LEPRb在下丘腦、卵巢和子宮組織中均有表達，但表達變化趨勢不同。

在發(fā)情間期（圖1-A），中國美利奴下丘腦的LEPRb表達水平極顯著高于卵巢和子宮（P＜0.01），而卵巢和子宮的相對表達水平無顯著差異；多浪羊LEPRb表達水平由高到低依次為：子宮、下丘腦、卵巢，其中子宮LEPRb表達水平顯著高于下丘腦（P＜0.05），極顯著高于卵巢（P＜0.01）。

發(fā)情前期（圖1-B）兩品種綿羊在3個組織中的表達變化相同，下丘腦LEPRb表達水平極顯著高于卵巢和子宮（P＜0.01），卵巢中的表達水平最低，子宮組織LEPRb基因表達水平均略高于卵巢組織，同一品種子宮和卵巢組織的表達水平無顯著差異（P＞0.05）。

與發(fā)情前期的變化趨勢相似，發(fā)情期（圖1-C）的中國美利奴LEPRb表達水平由高到低依次為下丘腦、卵巢、子宮，且下丘腦的表達水平極顯著高于卵巢和子宮（P＜0.01），子宮和卵巢LEPRb表達水平無顯著差異。多浪羊LEPRb表達水平由高到低依次為下丘腦、子宮、卵巢，其中下丘腦中的表達水平極顯著高于卵巢（P＜0.01），顯著高于子宮（P＜0.05）；子宮中的表達水平顯著高于卵巢（P＜0.05）。

發(fā)情后期（圖1-D），中國美利奴和多浪羊各組織LEPRb表達與前3個時期有明顯的差異。LEPRb在中國美利奴發(fā)情后期的子宮中表達水平最高，但不同組織中的表達水平無顯著差異。多浪羊子宮和下丘腦的LEPRb表達水平較高，極顯著地高于卵巢（P＜0.01）。

圖1 LEPRb在不同綿羊品種不同發(fā)情時期的組織表達變化

2.3 不同發(fā)情階段不同組織LEPRb的表達變化

發(fā)情季節(jié)不同發(fā)情階段各組織中LEPRb 表達變化如圖2所示。同一品種相同組織發(fā)情間期的表達水平為對照，以比較分析同一組織不同時期LEPRb的表達變化。圖2-A為下丘腦LEPRb 相對表達水平。與發(fā)情間期相比，中國美利奴下丘腦中LEPRb的表達呈現(xiàn)出從發(fā)情間期向發(fā)情期逐漸下降趨勢，至發(fā)情期LEPRb的表達水平有所回升，但與發(fā)情間期和發(fā)情前期的差異不顯著（P＜0.05），發(fā)情期至發(fā)情后期急劇減少，發(fā)情后期的表達水平極顯著低于其它階段（P＜0.01）。多浪羊下丘腦組織不同發(fā)情時期LEPRb的表達水平在發(fā)情前期達到最高點，然后逐漸下降至發(fā)情間期時達到最低點，發(fā)情前期表達水平是發(fā)情間期的2.14倍（P＜0.01）。

從圖2-B中可以看出，中國美利奴卵巢LEPRb表達水平從發(fā)情期的最低點開始逐漸升高，至發(fā)情前期達到最高水平，發(fā)情前期的表達水平極顯著高于其他3個階段（P＜0.01）。多浪羊卵巢LEPRb表達水平從發(fā)情前期開始逐漸升高至發(fā)情后期達到最高點后下降，發(fā)情后期LEPRb表達水平極顯著高于其他3個階段（P＜0.01）。

圖2-C為兩品種綿羊子宮LEPRb表達變化。從圖中可以看出，兩品種綿羊子宮組織LEPRb表達變化趨勢與卵巢相似。在發(fā)情前期中國美利奴子宮LEPRb表達水平達到最高值，極顯著高于其他3個時期（P＜0.01）；同期多浪羊子宮LEPRb表達水平達到最低值，極顯著低于發(fā)情間期（P＜0.01），顯著低于發(fā)情后期（P＜0.05）。

圖2 LEPRb在不同綿羊品種不同發(fā)情階段的組織表達變化

2.4 不同品種不同組織LEPRb表達變化

以相同發(fā)情時期多浪羊組織LEPRb 表達水平為對照組，分析在發(fā)情季節(jié)不同發(fā)情階段中國美利奴與多浪羊各組織LEPRb 表達水平變化。從圖3中可以看出在不同發(fā)情階段中國美利奴各組織中LEPRb表達水平都高于多浪羊，但在發(fā)情后期各組織、發(fā)情間期和發(fā)情期子宮組織表達水平在品種之間差異不顯著。

圖3 LEPRb在不同綿羊品種各組織相對表達變化

3 討論

Leptin是主要由脂肪細胞分泌的多功能細胞因子，是聯(lián)系機體生長發(fā)育和下丘腦促性腺激素釋放激素釋放系統(tǒng)的外周信號之一。大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)leptin能顯著刺激雄性大鼠下丘腦分泌GnRH［11，12］，使正中隆起弓狀外植體釋放促黃體素釋放激素（LHRH），刺激垂體前葉釋放FSH和LH［13］，添加leptin可促進LHRH和LH的分泌［14］。leptin可以直接作用于卵巢，影響卵泡發(fā)育和排卵［15］。LEPR蛋白由一個細胞外結構域、一個小的疏水跨膜結構域和一個細胞內結構域組成，其中細胞內結構域的長短決定了受體亞型。長型受體LEPRb有完整的細胞內結構域，是leptin的功能性受體。目前研究已證實leptin長受體在大鼠和羊下丘腦［16-18］、垂體［16，17，19］和卵巢［20-22］中均有表達。Leptin及其受體的mRNA和蛋白在山羊卵泡中均有表達［23］，且在牛小卵泡中表達量很高，并隨著卵泡的生長和E2濃度的增加而顯著下調，表明leptin對卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟有潛在的調控作用［24］。在體外培養(yǎng)卵巢試驗中，添加不同濃度的leptin均可以增加leptin受體的表達，且低leptin濃度促進孕酮分泌，高leptin濃度則抑制孕酮分泌［14］。在大鼠卵巢排卵過程的研究發(fā)現(xiàn)低濃度leptin促進排卵，高濃度抑制排卵。Luoh等［25］發(fā)現(xiàn)LEPRb是在下丘腦表達的主要受體亞型。人LEPRb突變會導致早發(fā)性病態(tài)肥胖，而且純合型突變致使青春期停滯、生長激素和促甲狀腺素的分泌減少［26］。LEPRb的表達變化可能改變了機體對leptin的敏感性。在ob/ob和db/db小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，主要的功能性受體LEPRb在弓狀核中mRNA含量比+/ob小鼠高2.3倍。與注射生理鹽水的對照組相比，ob/ob小鼠注射leptin后弓狀核LEPRb mRNA含量下降30%。正常小鼠禁食48h后，弓狀核LEPRb mRNA水平極顯著升高。此外，禁食48 h的大鼠的LEPRb mRNA水平在弓狀核和腹內側核分別提高40%和75%［23］。

Leptin通過與其受體結合發(fā)揮抑制食欲、減少能量攝取、增加能量消耗和抑制脂肪合成等生物學功能。下丘腦是控制能量平穩(wěn)的區(qū)域，而leptin在脂肪和能量代謝中起重要作用，因此下丘腦是leptin重要的靶器官，而LEPRb就是leptin在下丘腦發(fā)揮作用的連接點。本研究中發(fā)現(xiàn)除發(fā)情后期外，中國美利奴各組織LEPRb的表達水平都低于下丘腦，但在發(fā)情后期卵巢和子宮LEPRb的表達水平都顯著高于下丘腦。Leptin及其受體的mRNA和蛋白在牛小卵泡中高水平表達，并隨著卵泡的生長和E2濃度的增加而顯著下調，表明leptin在卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟方面存有潛在的調控作用［24］，這與我們的研究結果相同。在同一組織內，兩品種綿羊在不同時間同一組織的LEPRb的表達變化趨勢和變化幅度有所差異。多浪羊中LEPRb在下丘腦組織的表達變化是從發(fā)情前期開始逐漸下降，作為性腺軸的下游靶器官卵巢和子宮中LEPRb的表達變化滯后于下丘腦，這與下丘腦和卵巢、子宮在性腺軸所處的位置相符。中國美利奴各組織LEPRb的表達變化略有不同，但卵巢和子宮LEPRb的表達水平在發(fā)情前期最高，呈現(xiàn)協(xié)同變化特點。下丘腦LEPRb的表達變化呈現(xiàn)出明顯的品種特異性。在發(fā)情季節(jié)不同發(fā)情階段中國美利奴各組織LEPRb的表達水平都高于常年發(fā)情的多浪羊，這與本研究血清leptin濃度檢測的結果趨勢相同［9］。

4 結論

通過分析比較LEPRb在不同綿羊品種不同發(fā)情時期的不同組織中的表達變化，發(fā)現(xiàn)LEPRb的表達變化與綿羊發(fā)情存在相關關系，但具體的作用機制仍需要進一步的研究。

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（責任編輯 李楠）

The Expression of LEPRb mRNA in the Estrus Cycle of Different Sheep Strains

LU Shou-liang LI Liang-yuan GAO Lei SHEN Min WAN Peng-cheng SHI Guo-qing DAI Rong
（State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science，Shihezi 832000）

The aim of the study is to explore LEPR expression characteristics in seasonal estrus of sheep. Chinese merino（seasonal estrus sheep）and Duolang sheep（perennial estrus sheep）were selected to determine the expression changes of LEPRb mRNA in hypothalamus，ovaries and uterus in different stage of estrus cycle by quantitative real-time PCR. The results showed that during the whole estrus cycle，except the metaestrus，the LEPRb levels in the ovarian and uterus were found to be significantly lower than the levels in hypothalamus of Chinese Merino，but the results in metaestrus showed the reverse. Although the expression level of LEPRb varied in the same tissue of 2 cultivars during estrus stage，the trend was similar. Moreover，the LEPRb expression levels in different tissues of Chinese Merino were significantly higher than those in Duolang sheep. The results indicate that the expression variation of LEPRb is correlated with sheep estrus.

sheep；LEPRb；expression level；estrus cycle；real-time quantitative PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.020

2016-09-07

國家絨毛用羊產業(yè)技術體系（CARS-40-07），兵團博士資金（2014BB015），兵團院士資金（2013BB022）

盧守亮，男，助理研究員，研究方向：綿羊繁殖技術研究；E-mail：lsl912@163.com

代蓉，女，副研究員，研究方向：綿羊分子遺傳及繁育；E-mail：dairong1@163.com石國慶，男，研究員，研究方向：綿羊育種與繁殖；E-mail：nkkxyxms@163.com