樊壽德 王艷

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

鹽穗木鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HcSCL13基因啟動子的克隆及活性初步分析

樊壽德 王艷

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

為探明鹽穗木鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因HcSCL13的表達調(diào)控規(guī)律，利用基因組步移法成功克隆獲得該基因2 200 bp 的啟動子序列。PlantCARE數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，該啟動子不僅含有啟動子區(qū)的核心元件 CAAT-box和 TATA-box，還包含多個與逆境應(yīng)答有關(guān)的順式調(diào)控元件。將克隆獲得的 HcSCL13轉(zhuǎn)錄因子基因啟動子序列定向替換pBI121載體上的35S啟動子，構(gòu)建融合表達載體并轉(zhuǎn)染模式植物擬南芥，對轉(zhuǎn)基因擬南芥進行GUS組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥整株被染色，提示該啟動子具有表達活性且可能為組成型啟動子。

鹽穗木轉(zhuǎn)錄因子HcSCL13基因；染色體步移；啟動子克隆；元件及啟動活性分析

基因的表達可受轉(zhuǎn)錄、翻譯等不同水平上的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控在植物基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，涉及多種順式作用元件和反式作用因子。啟動子作為轉(zhuǎn)錄水平上重要的調(diào)控元件，通常是指位于基因上游，緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點的一段提供RNA聚合酶識別和結(jié)合的DNA序列，通過與特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，控制基因轉(zhuǎn)錄的起始、效率及時空特異性。啟動子的特定基序也可響應(yīng)激素（生長素、脫落酸、赤霉素、茉莉酸、油菜素內(nèi)酯、水楊酸）［1，2］和環(huán)境脅迫（冷脅迫、傷害脅迫、干旱脅迫及高鹽脅迫）等［3，4］，從而調(diào)節(jié)下游基因應(yīng)對環(huán)境變化。因此，對啟動子及其基序進行分析有助于進一步了解下游基因的表達模式及生理調(diào)節(jié)。在轉(zhuǎn)基因植物研究中，組成型啟動子，如35S［5，6］、Actin［7］和 Ubipuitin［8，9］的啟動子，已被廣泛應(yīng)用。

GRAS家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，由最初發(fā)現(xiàn)的3個家族成員GAI、RGA和SCR的特征字母命名［10］。目前已在擬南芥、水稻、葡萄、佛手、胡楊、枳、番茄、煙草等多種植物中發(fā)現(xiàn)GRAS家族基因，根據(jù)模式植物擬南芥和水稻基因組中的33個及57個GRAS家族成員可將GRAS家族分成8個分支，分別為：SCL3、SHR、PAT1、LISCL、DELLA、SCR、LS和HAM［11］。在植物中GRAS蛋白數(shù)量眾多，功能多樣，是許多重要生長發(fā)育過程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。近年來陸續(xù)報道關(guān)于GRAS家族蛋白在植物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，已成為研究的熱點。Torres-Galea等［12］檢測擬南芥PAT1分支AtSCL13表達模式時發(fā)現(xiàn)，在鹽、干旱、低溫等非生物脅迫及植物激素刺激下均能誘導(dǎo)表達AtSCL13；同屬PAT1分支的佛手GRAS基因，在低溫脅迫下其表達明顯上調(diào)［13］；徐凱等［14］從水稻中克隆了GRAS基因OsGRAS23，能提高轉(zhuǎn)基因水稻對干旱脅迫的耐受性；從甘藍型油菜中分離的GRAS基因 BnLAS，能使轉(zhuǎn)基因植株葉片氣孔密度增加，同時增加了葉表面蠟質(zhì)的分泌，從而增強了植株對干旱的耐受性［15］；馬洪雙等［16］從胡楊中克隆了GRAS基因PeSCL7，該基因定位在細胞核中，并能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱和鹽的耐受性；山葡萄PAT1分支基因VaPAT1能夠同時提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對冷、干旱和鹽脅迫的耐受性［17］；剛毛檉柳GRAS基因啟動子序列含有多個與逆境應(yīng)答有關(guān)的順式調(diào)控元件以及一些光響應(yīng)元件，可能在植物的逆境脅迫響應(yīng)和光響應(yīng)中起作用［18］。盡管GRAS家族參與植物抗逆功能的研究越來越多，但有關(guān)該家族基因啟動子如何在轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控鮮有報道。

鹽穗木（Halostachys caspica）是鹽生、旱生稀鹽多汁半灌木，生長于荒漠地區(qū)鹽堿地、鹽湖邊及河岸，具有重要生態(tài)價值的鹽生植物［19-22］，成為研究鹽堿脅迫機制和進行抗旱耐鹽堿脅迫基因及啟動子克隆的理想材料。HcSCL13是鹽穗木中發(fā)現(xiàn)的第一個具有典型C端保守結(jié)構(gòu)域的GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族基因，隸屬該家族PAT1分支，與擬南芥AtSCL13同源性最高，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示HcSCL13基因在鹽脅迫條件下表達量顯著上升［23］，推測其可能在鹽穗木耐鹽機制中發(fā)揮重要作用。

本實驗基于小組前期克隆獲得的鹽穗木HcSCL13基因全長，設(shè)計特異性引物，采用染色體步移技術(shù)克隆獲得了該基因的啟動子序列，使用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對啟動子序列進行分析，同時構(gòu)建偶聯(lián)GUS報告基因的植物表達載體 PHcSCL13∶GUS，通過GUS組織化學(xué)染色分析HcSCL13基因啟動子的活性，旨在為研究HcSCL13基因參與鹽脅迫響應(yīng)的調(diào)控模式和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽穗木種子（Halostachys caspica Drob.）采自新疆103團通古特沙漠。在溫室中于營養(yǎng)土、珍珠巖和蛭石（2∶1∶1）的混合基質(zhì)中進行種子萌發(fā)，平均培養(yǎng)溫度25℃，光照時間16 h/d，相對濕度40%。以生長3個月左右的鹽穗木幼苗作為實驗材料，提取基因組DNA。

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Col生態(tài)型。擬南芥種子經(jīng)4℃春化2 d，次氯酸鈉表面消毒后，播種于1/2MS固體培養(yǎng)基上，8 d后將幼苗轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)土中生長約4周，花序浸染法進行轉(zhuǎn)染。

植物基因組提取試劑盒、PCR回收純化試劑盒、Taq DNA 聚合酶購自TIANGEN公司；Genome Walking Kit試 劑 盒、Ex Taq酶、pMD18-T Vector、限制性內(nèi)切酶Hind III、Xba I購自TaKaRa公司；In-Fusion HD Cloning Kit購自Clontech公司；E. coli DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金公司；其它抗生素類均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 HcSCL13基因啟動子克隆及其序列分析 稱取鹽穗木同化枝0.1 g，按照植物基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）說明書提取鹽穗木基因組DNA，基因組的濃度和純度用NanoDropTM分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

以鹽穗木基因組DNA為模板，根據(jù)TaKaRa公司Genome Walking Kit說明書，以HcSCL13 基因序列設(shè)計巢式PCR特異性引物SP1、SP2、SP3。首先以純化后的鹽穗木基因組DNA為模板，根據(jù)試劑盒PCR反應(yīng)體系，分別以試劑盒中提供的4種獨特簡并引物AP1、AP2、AP3、AP4及HcSCL13基因特異性引物SP1進行第一輪巢式PCR。再取第一輪巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物1 μL作為第二輪巢式PCR反應(yīng)的模板，上一輪對應(yīng)的簡并引物為上游引物，SP2為下游引物，進行第二輪巢式PCR。取第二輪巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物1 μL作為模板，再以上一輪對應(yīng)的簡并引物為上游引物，SP3引物為下游引物，進行第三輪巢式PCR，經(jīng)過三輪PCR得到HcSCL13基因上游的側(cè)翼序列。

使用PCR回收試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）對第三輪巢式 PCR產(chǎn)物進行回收純化。將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后挑取單克隆菌，菌液PCR驗證后，送上海生物工程有限公司測序。利用DNAMAN對測序結(jié)果與HcSCL13 5' UTR區(qū)進行比對，并根據(jù)拼接完好的啟動子序列結(jié)果設(shè)計特異性引物，以鹽穗木基因組DNA 為模板進行 PCR擴增，從而進一步驗證克隆得到的啟動子序列的正確性。采用PlantCARE在線分析軟件對克隆獲得的啟動子序列進行分析，預(yù)測其可能存在的順式作用元件。

1.2.2 植物表達載體PHcSCL13∶GUS 的構(gòu)建 為分析鹽穗木HcSCL13啟動子的活性以及其時空表達特異性，用HcSCL13基因啟動子PHcSCL13定向替換植物表達載體pBI121上啟動GUS基因的35S啟動子，使之與GUS基因融合，構(gòu)建如圖1所示。根據(jù)HcSCL13基因啟動子的序列設(shè)計特異性引物，HcSCL13PGU1：5'-GATTACGCCAAGCTTGGGAACA TGACATGGATTACGA-3'（下劃線標(biāo)記為 Hind III酶切位點），HcSCL13PGU2：5'-CCGGGGATCCTCTAG ACCGAGAATAGCACAATCTGACTCTAT-3'（下劃線標(biāo)記為 Xba I 酶切位點）。

圖1 構(gòu)建HcSCL13基因啟動子偶聯(lián)GUS報告基因的植物表達載體示意圖

以測序正確含有鹽穗木HcSCL13啟動子的克隆載體為模板，HcSCL13PGU1和HcSCL13PGU2為特異引物進行擴增，使用限制性內(nèi)切酶 Hind III和 Xba I對植物表達載體pBI121進行雙酶切，膠回收后，使用 In-Fusion HD Cloning Kit試劑盒對回收帶有酶切位點的啟動子PCR產(chǎn)物和酶切的載體進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，采用酶切鑒定和測序方法確定HcSCL13啟動子是否已置換35S啟動子，將成功構(gòu)建的重組載體命名為PHcSCL13∶GUS。

1.2.3 PHcSCL13∶GUS對擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及抗性苗篩選 將構(gòu)建正確的植物表達載體pBI121-PHcSCL13∶GUS采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，并挑取菌落進行PCR 鑒定，陽性克隆用于擬南芥的轉(zhuǎn)化。采用農(nóng)桿菌花序浸染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，溫室培養(yǎng)收種。利用50 μg/mL卡那霉素篩選T0代轉(zhuǎn)PHcSCL13∶GUS陽性苗，單株收種。提取卡那霉素抗性擬南芥基因組DNA，進行基因組PCR鑒定。

1.2.4 GUS活性組織染色分析 參照Jefferson等［24］方法測定T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS報告基因的表達情況。將待染色的外植體浸泡在GUS染色液（50 mmol/L磷酸鈉緩沖液、0.1% Triton X-100、1 mmol/L K3［Fe（CN）6］、1 mmol/L K4［Fe（CN）6］、1 mmol/L X-Gluc）中，置于37℃中保溫過夜，用75%乙醇沖洗脫色，直至底色完全消失，在體視鏡下拍照觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 HcSCL13基因啟動子克隆

利用染色體步移技術(shù)的原理，通過簡并引物AP3與設(shè)計的3條特異性引物進行3輪巢式PCR反應(yīng)，得到一條長約2 kb的啟動子片段（圖2），回收該片段并連接至pMD18-T克隆載體上，通過序列測定和比對，該序列長2 200 bp，且其3'端與HcSCL13基因序列的一致性達到了98%，說明擴增得到的側(cè)翼序列是HcSCL13基因上游的啟動子序列。

圖2 HcSCL13基因啟動子的克隆

2.2 鹽穗木HcSCL13基因啟動子生物信息學(xué)分析

利用PlantCARE在線生物信息學(xué)軟件對所獲得的2 200 bp HcSCL13基因啟動子序列進行相關(guān)預(yù)測分析。結(jié)果顯示克隆獲得的HcSCL13基因啟動子區(qū)域不僅包含啟動子區(qū)的核心元件CAAT-box和TATA-box，多個光響應(yīng)元件 GAG-motif、GA-motif、Box I和chs-CMA2a。還含有多個與逆境應(yīng)答有關(guān)的順式調(diào)控元件（圖3），如MBS、LTR、ERE、Box I、TCA-motif和TC-rich repeats等順式作用元件（表1）。

2.3 植物表達載體的構(gòu)建

使用Hind III和Xba I限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒pBI121-PHcSCL13進行雙酶切，得到與目的片段長度一致的單一條帶，表明HcSCL13啟動子已經(jīng)插入到pBI121載體中，構(gòu)建成功（圖4）。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗性苗鑒定

通過花序浸染法將偶聯(lián)有GUS報告基因的HcSCL13啟動子轉(zhuǎn)入擬南芥，經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得20株抗性植株。以HcSCL13PGU1和HcSCL13PGU2為特異性引物對抗性植株進行PCR檢測，部分結(jié)果如圖5所示，所檢測植株的擴增結(jié)果與預(yù)期一致，表明抗性植株均含有HcSCL13啟動子片段。

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS的染色分析

以T1代PHcSCL13∶GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥為實驗材料，將萌發(fā)生長7 d和15 d的幼苗進行GUS組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示（圖6），在不同生長發(fā)育階段轉(zhuǎn)PHcSCL13∶GUS基因T1代擬南芥幼苗的葉片和根部均檢測到GUS活性的藍色信號，而在非轉(zhuǎn)基因擬南芥的各個部位均未檢測到GUS活性，各組織未見染色，呈白色。

3 討論

GRAS作為植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于多種植物中。盡管目前已對該家族部分基因的功能開展了相關(guān)研究，但有關(guān)其調(diào)控機理的報道還很少。本研究利用基因組步移技術(shù)克隆獲得了鹽穗木GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子HcSCL13基因2 200 bp的啟動子序列，與同源基因擬南芥AtSCL13啟動子長度近似（2 800 bp）。通過生物信息學(xué)對該啟動子進行分析預(yù)測，含有如下順式作用元件：O2-site、GAG-motif、GA-motif、LTR、MBS、ARE、Box I、chs-CMA2a、TC-rich repeats、TCA-element、ERE、TATA-box和TCT-motif。其中，GAG-motif、GA-motif、Box I和chs-CMA2a、TCT-motif［25-27］為多個對光響應(yīng)的元件，是常見的受光調(diào)節(jié)啟動子中的順式作用元件，能夠調(diào)節(jié)基因受光誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄活性。與已報道的擬南芥AtSCL13基因啟動［28］子相似，推測其為受光誘導(dǎo)的啟動子，也可能參與了對植物光敏色素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

此外，HcSCL13作為積極響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子基因，在該啟動子上還發(fā)現(xiàn)了與脅迫相關(guān)的一些順式作用元件，這些元件的非生物逆境應(yīng)答特性在以往的研究中已有較多的報道。LTR是與低溫脅迫相關(guān)的啟動子調(diào)控序列［29］。MBS元件與干旱等多種非生物逆境脅迫相關(guān)，能夠作為反式作用因子MYB蛋白的結(jié)合位點［30，31］。ARE與厭氧應(yīng)答相關(guān)［32］。TC-rich repeats是植物應(yīng)對逆境脅迫時響應(yīng)的元件，參與多種生物與非生物脅迫應(yīng)答［33］。TCA-element參與水楊酸反應(yīng)，該順式作用元件能在不同非生物脅迫下通過調(diào)控防御基因的表達，提高植物對脅迫的耐受性［34，35］。GCC box作為乙烯響應(yīng)元件ERE的保守序列，能夠調(diào)節(jié)植物對乙烯的響應(yīng)［36］。推測這些順式作用元件可能調(diào)節(jié)了HcSCL13 基因在鹽等逆境下的表達，進而再通過 HcSCL13 所介導(dǎo)的信號路徑調(diào)節(jié)下游相關(guān)脅迫基因的表達以應(yīng)對各種非生物脅迫，從而表現(xiàn)出復(fù)雜的調(diào)控方式。

圖3 HcSCL13基因啟動子順式作用元件分析

通過對PHcSCL13∶GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥7 d和15 d兩個不同生長發(fā)育階段的組織化學(xué)染色證明了HcSCL13啟動子在非脅迫條件下能夠持續(xù)有效地啟動下游GUS報告基因的表達，但是該啟動子具有多個光響應(yīng)原件，在缺乏光照條件下能否啟動GUS基因的表達還有待于進一步驗證。同時，鹽等非生物脅迫是否會影響GUS活性也有待于深入研究。

4 結(jié)論

本研究獲得了鹽穗木轉(zhuǎn)錄因子HcSCL13基因的啟動子，通過PantCARE在線軟件分析該啟動子序列的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)了一些與光響應(yīng)、非生物脅迫（干旱、低溫）、激素（水楊酸、乙烯）、及逆境響應(yīng)的順式作用元件。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明該啟動子具有活性。

表1 HcSCL13轉(zhuǎn)錄因子基因啟動子核心作用元件

圖4 植物表達載體pBI121-PHcSCL13的酶切鑒定

圖5 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定

圖6 轉(zhuǎn)pBI121-HcSCL13：GUS擬南芥幼苗的GUS組織化學(xué)染色

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Activity Analysis of Promoter of GRAS Transcription Factor Gene HcSCL13 from Halostachys caspica

FAN Shou-de WANG Yan
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

In order to explore the expression characteristic and function of GRAS transcription factor gene HcSCL13 from Halostachys caspica，the 2 200 bp sequence of promoter was cloned using the genomic walking method. The analysis results using the PlantCARE software suggested that the promoter sequence contained not only the core elements such as CAAT-box and TATA-box，but also some cis-element related to the stress response. The 35S promoter sequence of the pBI121 expression vector was replaced by the HcSCL13 promoter sequence to construct the fusion expression vector. Then，the fusion expression vector was transformed into Arabidopsis thaliana by flora method and the T1 seedlings were stained by GUS. The results of GUS staining showed that the whole transformed A. thaliana seedlings were stained，indicating that the HcSCL13 gene promoter had expression activity，and it might be constitutive promoter.

transcription factor gene HcSCL13；genomic walking method；promoter cloning；analysis of cis-acting element and promoter activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.019

2016-09-26

國家青年自然科學(xué)基金項目（31400729）

樊壽德，碩士研究生，研究方向：植物抗逆的生理生化與分子機制；E-mail：fanshoude123@163.com

王艷，博士，副教授，研究方向：植物抗逆的生理生化與分子機制；E-mail：wangyanxju@126.com