肖自華 高飛 孫會(huì)改 周宜君

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

蒙古沙冬青AmMYB4-like基因的克隆與表達(dá)分析

肖自華 高飛 孫會(huì)改 周宜君

（中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081）

基于已有研究工作基礎(chǔ)，從蒙古沙冬青［Ammopiptanthus mongolicus（Maxim）Cheng. f］中分離到1個(gè)編碼MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為AmMYB4-like。該序列長(zhǎng)度為1 145 bp，含有一個(gè)由960 bp 組成的開(kāi)放閱讀框，編碼319個(gè)氨基酸，具有R2和R3保守結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，AmMYB4-like 在葉片中參與低溫和干旱脅迫應(yīng)答，在根中主要參與干旱脅迫應(yīng)答。構(gòu)建了pPZP212-AmMYB4-like 植物表達(dá)載體，旨為進(jìn)一步研究AmMYB4-like 的功能奠定基礎(chǔ)。

蒙古沙冬青；AmMYB4-like；基因克隆；表達(dá)分析；植物表達(dá)載體構(gòu)建

MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是迄今為止在植物中發(fā)現(xiàn)的成員數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子。自1987年P(guān)az-Ares等［1］從玉米中克隆得到與色素合成相關(guān)的MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因（C1）以來(lái)，已經(jīng)從多種植物中分離和鑒定了大量的MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，如擬南芥中198個(gè)［2］、水稻中183個(gè)［3］、蘋(píng)果中229個(gè)［4］、甜橙中177個(gè)［5］、谷子（Setaria italica）中209個(gè)［6］，獲得MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的成員數(shù)量在100以上是普遍的。結(jié)構(gòu)上，MYB轉(zhuǎn)錄因子各家族成員的N-端具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，即DNA binding 結(jié)構(gòu)域，也稱(chēng)為MYB結(jié)構(gòu)域，由1-4個(gè)不等的MYB重復(fù)單元組成。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域所含重復(fù)單元個(gè)數(shù)，將MYB轉(zhuǎn)錄因子劃分為4種類(lèi)型：4R-MYB（4個(gè)MYB重復(fù)單元）、3R-MYB（3個(gè)MYB重復(fù)單元）、R2R3-MYB（2個(gè)MYB重復(fù)單元）以及MYB-related（1個(gè)或部分MYB重復(fù)單元），其中R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多［7-9］。

隨著對(duì)植物中更多的MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能解析，人們發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型的MYB轉(zhuǎn)錄因子具有不同的功能，參與生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞形態(tài)建成、激素和環(huán)境因子應(yīng)答等許多生命活動(dòng)過(guò)程的調(diào)節(jié)，特別是參與植物初級(jí)和次級(jí)代謝的調(diào)節(jié)［10］。研究表明，擬南芥的類(lèi)黃酮合成途徑相關(guān)基因（如EBGs和LBGs）受AtMYB11及AtMYB75等調(diào)控［8，9］，棉花的GmMYB042基因的過(guò)表達(dá)使轉(zhuǎn)基因煙草的類(lèi)黃酮代謝途徑部分關(guān)鍵酶基因（如PAL、CHS 和FLS）的表達(dá)量明顯上升［10］，玉米的ZmMYB111和ZmMYB148可同時(shí)調(diào)節(jié)PAL基因，涉及類(lèi)黃酮和木質(zhì)素的合成［11］。

蒙古沙冬青（A. mongolicus）是我國(guó)西北荒漠地區(qū)唯一的強(qiáng)旱生常綠闊葉灌木，同時(shí)也是阿拉善荒漠區(qū)特有的建群物種，對(duì)維持當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)平衡發(fā)揮至關(guān)重要的作用。沙冬青長(zhǎng)期生活在干旱、低溫等逆境環(huán)境中，具有極強(qiáng)的抗旱、抗寒能力，其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理方面都有與之相適應(yīng)的特征，這為提高水分的利用率、應(yīng)對(duì)水分虧缺、極端嚴(yán)寒、高溫、風(fēng)蝕沙埋等逆境環(huán)境提供了條件［12，13］，因此沙冬青是研究植物抗逆機(jī)理和篩選抗逆基因的資源植物，具有重要的科學(xué)研究?jī)r(jià)值。

近年來(lái)，基于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序構(gòu)建了蒙古沙冬青正常與逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)，為篩選抗逆響應(yīng)基因、研究抗逆應(yīng)答機(jī)理提供了大量的數(shù)據(jù)［14-17］，同時(shí)，人們研究了沙冬青中重要的功能基因（包括編碼轉(zhuǎn)錄因子基因）的結(jié)構(gòu)和響應(yīng)逆境的表達(dá)特征，如AmCBL1［18］和AmDREB2［19］等，但關(guān)于蒙古沙冬青中的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道。近來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室的研究表明，干旱脅迫下MiR858通過(guò)上調(diào)MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而調(diào)節(jié)類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)的合成［20］。由于植物中MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多，且參與多種生物學(xué)過(guò)程，因此，本研究基于本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的蒙古沙冬青轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)獲得的AmMYB4-like基因進(jìn)行了相關(guān)研究，旨在為闡釋MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在蒙古沙冬青逆境應(yīng)答中的特點(diǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

蒙古沙冬青（A. mongolicus）種子采自寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)縣。播種于盛有蛭石：珍珠巖：營(yíng)養(yǎng)土（3:1:1）浸濕的混合土壤的塑料盆中，光照16 h（23℃）/黑暗8 h（18℃），光照強(qiáng)度93 μmol· m-2·s-1，空氣濕度30%-40%。種子發(fā)芽后，每周澆一次水。生長(zhǎng)8周后，分別以20% PEG6000模擬干旱脅迫、以4℃低溫培養(yǎng)進(jìn)行低溫脅迫，脅迫時(shí)間分別為0 h、1 h、6 h、24 h、7 d，以0 h為對(duì)照。分別收獲葉片和根組織，液氮速凍，-80℃冷凍保存。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

Trizol試 劑 購(gòu) 自 Invitrogen公 司，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量試劑盒SYBR Green和無(wú)縫重組試劑盒（EasyGeno）購(gòu)自天根生化（北京）有限公司，KOD FX Neo PCR克隆酶購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司，膠回收試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司，質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自百泰克生物技術(shù)有限公司，AT克隆載體購(gòu)自北京全式金生物。植物表達(dá)載體pPZP212為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 基因分離 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的蒙古沙冬青干旱轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選表達(dá)量較高的MYB基因序列作為候選基因，設(shè)計(jì)引物序列（表1）。用Trizol法提取蒙古沙冬青葉片和根總RNA，cDNA第一鏈合成按天根FastQuant RT kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)體系（50 μL）：第一鏈cDNA 1 μL、10 mmol/L正向引物1.5 μL、10 mmol/L反向引物 1.5 μL、2 mmol/L dNTPs 10 μL、2×PCR Buffer for KOD Fx Neo 25 μL、1 U/μL KOD FX Neo 1 μL及ddH2O 10 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，61℃退火30 s，68℃延伸60 s，循環(huán)34次。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目的片段，送至生工（上海）測(cè)序。

1.2.2 序列分析 將獲得的基因序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST查詢，獲得相關(guān)同源基因信息。使用在線的ORF（Open reading frame，ORF）查詢網(wǎng)站確定基因的ORF（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）。用于進(jìn)化樹(shù)分析的序列來(lái)源于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。用MEGA5.1軟件進(jìn)行蛋白序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析，用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。使用在線軟件（http://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)等電點(diǎn)及相對(duì)分子質(zhì)量大小，使用在線軟件（http://www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）對(duì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用NetPhos3.1Serve在線軟件（http://www. cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)。使用在線軟件（http://weblogo.berkeley.edu/examples.html）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.2.3 脅迫條件下的基因表達(dá)分析 用Trizol法提取20% PEG6000及4℃低溫處理的蒙古沙冬青葉片和根的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。將單鏈cDNA產(chǎn)物濃度稀釋5倍后作為熒光定量PCR反應(yīng)的模板。在熒光定量PCR儀MYIQ2（Bio-Rad）上進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系（20 μL）：2×FastFire qPCR PreMix（with SYBR Green I）10 μL、ddH2O 7 μL、10 mmol/L上下游特異引物（見(jiàn)表1）各1 μL和cDNA 1 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性5 s，55℃退火10 s，72℃延伸15 s，循環(huán)40次。以蒙古沙冬青AmeIF1基因?yàn)閮?nèi)參基因［21］。采用2-△△Ct方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因特異引物序列

1.2.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 利用無(wú)縫重組試劑盒（EasyGeno）使用無(wú)縫重組方法將目的基因連接到植物表達(dá)載體pPZP212上，選擇Xba I和Sac I作為插入位點(diǎn)，引物序列見(jiàn)表1。重組反應(yīng)體系（10 μL）：0.5 μL線性化載體（110 ng/μL）、2 μL插入片段（180 ng/μL）、5 μL 2×EasyGeno Assembly Mix、2.5 μL ddH2O。具體步驟參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將重組載體轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，在含有100 μg/mL壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化菌落，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 AmMYB4-like基因的擴(kuò)增

以蒙古沙冬青葉片總RNA 反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA 為模板，AmMYB4-like-F和AmMYB4-like-R為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。圖1顯示，擴(kuò)增的目的條帶大小約1 000 bp。經(jīng)過(guò)測(cè)序，該序列長(zhǎng)度為1 145 bp。將得到的序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast檢索，該序列與大豆GmMYB4-like的核苷酸序列相似性最高（89%），因此將獲得的基因命名為AmMYB4-like。

圖1 AmMYB4-like PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2 AmMYB4-like基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 AmMYB4-like全長(zhǎng)基因序列的結(jié)構(gòu)特征 所獲得的蒙古沙冬青編碼MYB蛋白的目的基因全長(zhǎng)為1 145 bp，其中5'UTR長(zhǎng)度為157 bp，3'UTR長(zhǎng)度為28 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為960 bp，編碼319個(gè)氨基酸（圖2）。在線軟件分析表明，該蛋白的等電點(diǎn)（pI）為5.09，相對(duì)分子質(zhì)量（MW）為 78.530 21 kD。對(duì)其進(jìn)行MYB結(jié)構(gòu)域分析，AmMYB4-like含有R2和R3保守結(jié)構(gòu)域，屬于典型的R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子（圖2，圖3）。

圖2 AmMYB4-like的核苷酸序列及推測(cè)的蛋白序列

對(duì)AmMYB4-like進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果表明其定位于細(xì)胞核中。利用在線軟件預(yù)測(cè)AmMYB4-like具有41個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)，其中Ser 24個(gè)，Thr 15個(gè)，Tyr 2個(gè)。

2.2.2 AmMYB4-like的同源序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析 在NCBI中搜索與AmMYB4-like相近的10個(gè)編碼MYB的氨基酸序列與本研究獲得的AmMYB4-like進(jìn)行多序列比對(duì)。結(jié)果顯示（圖3-B），所有序列的N-端都具有R2和R3保守結(jié)構(gòu)域，皆屬于R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。在R2保守結(jié)構(gòu)域中含有3個(gè)色氨酸殘基（W），相互間的間隔為19個(gè)氨基酸。在R3保守結(jié)構(gòu)域中的第一個(gè)色氨酸殘基（W）被苯丙氨酸（F）所取代，另外2個(gè)色氨酸殘基（W）不變。此外多序列比對(duì)顯示各序列在C-端變異較大（圖3-A）。對(duì)N-端的R2和R3保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步采用在線軟件分析氨基酸序列特點(diǎn)，結(jié)果顯示保守性很強(qiáng)（圖3-B）。

圖3 AmMYB4-like與其他物種已知MYB蛋白的多序列比對(duì)（A）及R2和R3保守結(jié)構(gòu)域分析（B）

為研究AmMYB4-like與其他植物MYB序列的進(jìn)化關(guān)系，除了上述10個(gè)序列外，又選取了4個(gè)編碼MYB的氨基酸序列：擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtMYB14（NP_180676.1），煙草（Nicotiana tabacum）NtMYB4-like（NP_001312823.1），玉米（Zea mays）ZmMYB4（NP_001296459.1）和水稻（Oryza sativa）OsMYB4（XP_015633465.1），采用鄰接法（N-J）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖4）顯示，雙子葉植物的MYB4序列和單子葉植物的MYB4序列明顯的聚為2類(lèi)，而屬于豆科植物的8個(gè)序列聚為1類(lèi)，親緣關(guān)系較近。盡管本研究中的AmMYB4-like與所研究的豆科植物的7個(gè)MYB4序列親緣關(guān)系最近，但表現(xiàn)獨(dú)為一支。

圖4 AmMYB4-like的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 AmMYB4-like的表達(dá)模式分析

2.3.1 干旱脅迫下的表達(dá)特征 采用qRT-PCR技術(shù)分析正常條件下AmMYB4-like 在葉片和根中的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果（圖5）表明，AmMYB4-like在葉片和根中都表達(dá)，且葉片中的表達(dá)量較高，約為根中的1.46倍。以20% PEG6000模擬干旱脅迫，處理1 h時(shí)與對(duì)照相比，AmMYB4-like在葉片和根中都表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，分別為對(duì)照水平的3.08倍和4.04倍。而脅迫處理6 h時(shí)，AmMYB4-like在葉片中的表達(dá)量降低、與對(duì)照水平相同，而根中的表達(dá)量繼續(xù)增加，為對(duì)照水平的4.23倍。當(dāng)脅迫處理24 h時(shí)，AmMYB4-like在葉片中的表達(dá)量與對(duì)照基本相同，而根中的表達(dá)量降低為對(duì)照水平的59.8%。當(dāng)脅迫處理時(shí)間維持7 d時(shí)，AmMYB4-like在葉片中的表達(dá)量降低，為對(duì)照水平的61.2%，根中的表達(dá)量增加，為對(duì)照水平的2.52倍（圖6）。

圖5 AmMYB4-like在不同組織中的表達(dá)特征

圖6 20%PEG6000脅迫下AmMYB4-like在不同組織中的表達(dá)特征

2.3.2 低溫脅迫下的表達(dá)特征 采用qRT-PCR技術(shù)分析4℃低溫處理下AmMYB4-like 在葉片和根中的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果（圖7）顯示，AmMYB4-like 在葉片和根中表達(dá)不同。4℃低溫處理1 h和6 h時(shí)，與對(duì)照相比，AmMYB4-like在葉片表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，分別為對(duì)照水平的2.93倍和7.86倍，當(dāng)脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，AmMYB4-like表達(dá)量降低，與對(duì)照水平基本相同。而根中的AmMYB4-like表達(dá)量在脅迫6 h增加，為對(duì)照水平的1.77倍，在其他處理?xiàng)l件下都低于或近于對(duì)照水平。

圖7 4℃低溫脅迫下AmMYB4-like在不同組織中的表達(dá)特征

2.4 pPZP212-AmMYB4-like植物表達(dá)載體構(gòu)建

采用無(wú)縫重組法構(gòu)建表達(dá)載體pPZP212-AmMYB4-like，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，在含有Spec的LB固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化菌落，菌液PCR驗(yàn)證結(jié)果（圖8-A）顯示，在1 000 bp位置附近具有與目的基因大小一致的條帶，進(jìn)一步測(cè)序顯示結(jié)果正確，同時(shí)對(duì)構(gòu)建好的重組載體進(jìn)行了酶切驗(yàn)證，結(jié)果（圖8-B）顯示在1 000 bp位置附近具有與目的基因大小一致的片段，以上結(jié)果表明pPZP212-AmMYB4-like植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖8 pPZP212-AmMYB4-like重組載體菌液PCR驗(yàn)證（A）及酶切驗(yàn)證（B）

3 討論

植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子是具有成員數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子超家族，在4種類(lèi)型的MYB轉(zhuǎn)錄因子中，屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多，但不同物種的數(shù)量不同，如大豆（G. max）244個(gè)［22］，棉花（Gossypium raimondii）205個(gè)［23］，毛果楊（Populus trichocarpa）192個(gè)［24］，玉米（Z. mays）157個(gè)［25］，擬南芥126個(gè)［26］，葡萄（Vitis vinifera）108個(gè)［27］，水稻（O.sativa）88個(gè)［28］。有研究者認(rèn)為R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量多少與基因數(shù)量多少有關(guān)［23］，也就是說(shuō)物種基因組中所含有的基因數(shù)量越多，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量增加。

研究表明，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子具有重要的生物學(xué)功能，包括參與初級(jí)和次級(jí)代謝、生物和非生物脅迫、細(xì)胞命運(yùn)和發(fā)育過(guò)程等［7］。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子除了在N端具有保守的DNA-binding結(jié)構(gòu)域外，在C端則有轉(zhuǎn)錄激活/抑制區(qū)［23］。許多功能基因的啟動(dòng)子中含有特殊的MYB 結(jié)合元件（核心序列TAACTG），在逆境脅迫情況下，MYB 轉(zhuǎn)錄因子可以與該元件結(jié)合從而激活脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)［29］。

本研究從蒙古沙冬青中克隆得到1個(gè)編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子基因AmMYB4-like，生物信息學(xué)分析表明，其編碼蛋白序列含有高度保守的R2和R3的MYB結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。蒙古沙冬青屬于豆科植物，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示AmMYB4-like與同屬于豆科MYB4親緣關(guān)系最近，而與其他雙子葉植物物種的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與單子葉植物（水稻和玉米）MYB4的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，提示植物MYB4的進(jìn)化可能存在種屬特異性。

杜海等［10］在研究大豆GmMYB042時(shí)發(fā)現(xiàn)其受到PEG8000、NaCl及低溫誘導(dǎo)。He等［23］選取了棉花（G. raimondi）中25個(gè)屬的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，分別研究了在葉片和根中應(yīng)答干旱和高鹽脅迫下的表達(dá)特征，結(jié)果表明，這些成員在葉片和根中具有不同的響應(yīng)干旱和高鹽的表達(dá)模式，說(shuō)明可以通過(guò)不同的信號(hào)途徑參與脅迫應(yīng)答。本研究中，正常條件下AmMYB4-like在根和葉中都表達(dá)，但在不同脅迫條件下，具有不同的表達(dá)模式。以20%PEG6000模擬干旱處理，葉片和根中的AmMYB4-like上調(diào)表達(dá)，葉片中的AmMYB4-like在1 h時(shí)達(dá)到最高水平，為對(duì)照水平的3.08倍，而根中的AmMYB4-like在6 h達(dá)到最高水平，為對(duì)照水平的4.23倍，表明葉片和根中的AmMYB4-like參與干旱脅迫應(yīng)答。在4℃低溫處理下，葉片中的AmMYB4-like表達(dá)量增加，處理6 h時(shí)達(dá)到最高水平，為對(duì)照水平的7.86倍，但根中AmMYB4-like盡管在4℃低溫處理6 h表達(dá)提高，但相對(duì)較少。上述結(jié)果說(shuō)明蒙古沙冬青葉片中的AmMYB4-like既響應(yīng)低溫脅迫，也響應(yīng)干旱脅迫，而根中的AmMYB4-like主要參與干旱脅迫應(yīng)答。本研究以7 d作為較長(zhǎng)的脅迫時(shí)間研究了AmMYB4-like的表達(dá)特征，結(jié)果顯示，只有根中的AmMYB4-like在干旱脅迫7 d時(shí)檢測(cè)出上調(diào)表達(dá)，為對(duì)照水平的2.52倍，說(shuō)明根中的AmMYB4-like參與較長(zhǎng)時(shí)間的干旱脅迫應(yīng)答。根作為植物吸水的重要組織部位，對(duì)于干旱耐受能力十分重要，蒙古沙冬青是強(qiáng)旱生植物，其根的干旱耐受性十分重要，干旱脅迫下根中的相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)其耐受性可能具有一定的意義。

4 結(jié)論

從蒙古沙冬青中分離到1個(gè)編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為AmMYB4-like。該序列開(kāi)放閱讀框編碼319個(gè)氨基酸，具有典型的MYB轉(zhuǎn)錄因子保守的R2R3結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。qRTPCR 分析表明，葉片中的AmMYB4-like參與低溫和干旱脅迫應(yīng)答，而根中的AmMYB4-like主要參與干旱脅迫應(yīng)答。構(gòu)建了pPZP212-AmMYB4-like植物表達(dá)載體。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning and Expression Analysis of AmMYB4-like in Ammopiptanthus mongolicus

XIAO Zi-hua GAO Fei SUN Hui-gai ZHOU Yi-jun
（College of Life & Environmental Sciences，Minzu University of China，Beijing 100081）

Based on our previous work，a gene encoding MYB transcription factor was cloned from Ammopiptanthus mongolicus，and it was designated as AmMYB4-like. The full length of the AmMYB4-like cDNA was 1，145 bp，including a 960 bp opening reading frame（ORF）which encoded a 319-amino acid peptide. AmMYB4-like contained R2 and R3 conserved domains and belonged to the R2R3-MYB subfamily. Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）analyses revealed that AmMYB4-like was up-regulated in leaves under low temperature and drought stresses，but it was mainly induced by drought stress in roots. Plant expression vector pPZP212- AmMYB4-like was constructed for further research of AmMYB4-like.

Ammopiptanthus mongolicus；AmMYB4-lik；gene cloning；expression analysis；construction of plant expression vector

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.016

2016-10-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370356，31670335），建設(shè)世界一流大學(xué)（學(xué)科）和特色發(fā)展引導(dǎo)專(zhuān)項(xiàng)資金（YDZXXK201619，2015MDTD08C）

肖自華，男，碩士，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)；E-mail：xiaozihua1991@163.com

周宜君，女，教授，研究方向：植物抗逆分子生物學(xué)；E-mail：zhouyijun@muc.edu.cn