童霄霞楊遠(yuǎn)勤陳勉王懷遠(yuǎn)胡海軍章康健，3

（1. 浙江理工大學(xué)，杭州 310018；2. 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生化細(xì)胞所，上海 200031；3. 四川輝陽(yáng)生命工程股份有限公司，成都610021）

C19orf18蛋白的表達(dá)與純化及多克隆抗體制備

童霄霞1楊遠(yuǎn)勤1陳勉2王懷遠(yuǎn)2胡海軍2章康健2，3

（1. 浙江理工大學(xué)，杭州 310018；2. 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生化細(xì)胞所，上海 200031；3. 四川輝陽(yáng)生命工程股份有限公司，成都610021）

旨在得到較高濃度和純度的C19orf18蛋白，再將得到的目的蛋白用于制備其特異性的多克隆抗體。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出C19orf18基因的胞內(nèi)段和胞外段，中間用柔性肽連接，再將目的片段克隆到pET28a（+）與pET32a（+）載體上，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)少量的目的蛋白，篩選出表達(dá)量較高的載體，再用篩選得到的表達(dá)量較高的載體大量表達(dá)目的蛋白，通過(guò)鎳柱純化得到較純的C19orf18蛋白。用得到的蛋白免疫新西蘭白兔，得到的抗血清先經(jīng)過(guò)Protein A純化，再進(jìn)行抗原親和純化得到C19orf18蛋白多克隆抗體。結(jié)果顯示，載體pET28a-C19orf18 蛋白表達(dá)量高于pET32a-C19orf18，經(jīng)過(guò)鎳柱純化后得到了較高濃度與純度的目的蛋白，利用得到的目的蛋白作為抗原成功制備了其特異性的多克隆抗體。在原核細(xì)胞中成功表達(dá)了C19orf18重組蛋白，并得到了其特異性多克隆抗體，所制備的多克隆抗體可應(yīng)用于ELISA、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

C19orf18蛋白；原核表達(dá)；抗原親和純化

C19orf18基因，又名19號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框18，該基因定位于19q13.43，擁有6個(gè)外顯子，編碼215個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約為24.2 kD，該基因在真核生物物種間進(jìn)化保守。2002年發(fā)現(xiàn)其是一個(gè)編碼基因［1］，并在2004年得到證實(shí)［2］，然而目前對(duì)其功能的研究較少。

Stephen A. Krawetz于2007年發(fā)現(xiàn)C19orf18蛋白在正常精子細(xì)胞中表達(dá)量要顯著高于畸形精子［3］，同時(shí)Ola'h［4］發(fā)現(xiàn)C19orf18蛋白與β淀粉樣蛋白（阿茲海默癥的特征蛋白）聚合物有顯著的結(jié)合親和力，為C19orf18蛋白可能參與到阿茲海默癥的發(fā)病過(guò)程中提供證據(jù)。另外，有學(xué)者利用質(zhì)譜技術(shù)從尿液中分離到了C19orf18蛋白，提示C19orf18作為分泌蛋白可能是某種疾病的潛在標(biāo)志物［5］。我們利用COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)在一些回盲腸腺癌，惡性黑色素瘤，卵巢癌或食管癌患者中C19orf18基因存在突變，在肝癌、十二指腸腺癌患者中存在C19orf18基因的高表達(dá)，提示該蛋白可能在癌癥的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮作用。

基于以上研究以及一些臨床數(shù)據(jù)，獲得C19orf18蛋白的抗體對(duì)其在生理學(xué)和病理學(xué)的分子機(jī)制的研究迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)選擇原核表達(dá)載體pET28a（+）和pET32a（+）進(jìn)行C19orf18蛋白的表達(dá)，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)得到C19orf18蛋白。之后用鎳柱親和純化（Ni-NTA）得到高純度的C19orf18蛋白對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，抗血清經(jīng)過(guò)Protein A親和純化后再進(jìn)行抗原親和純化得到C19orf18蛋白的多克隆抗體，最后通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blotting）檢測(cè)多克隆抗體的效價(jià)及特異性，旨為之后研究C19orf18蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET28a（+）和pET32a（+）為本實(shí)驗(yàn)室保存；KOD-puls-neo和Ligation-high 連接酶購(gòu)于日本的TOYOBO公司；DNA MAKER購(gòu)于中國(guó)的全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)于美國(guó)的Fermentas公司；IP Lysis Buffer購(gòu)于中國(guó)的碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白MAKER購(gòu)于美國(guó)的Thermo Fisher Scientific公司；5個(gè)C19orf18蛋白相關(guān)的shRNA表達(dá)載體購(gòu)于加拿大的ABM公司；Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)的Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人淋巴瘤Raji細(xì)胞系從上海中科院細(xì)胞庫(kù)獲得，Raji細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640中，37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)［6，7］。1.2.2 C19orf18基因克隆及表達(dá)載體pET28a-C19orf18和 pET32a-C19orf18的 構(gòu) 建 全 長(zhǎng) 的C19orf18蛋白有215個(gè)氨基酸（AA）。從uniprot網(wǎng)站預(yù)測(cè)到，最前面的29個(gè)AA是C19orf18蛋白的信號(hào)肽，接下來(lái)的77個(gè)AA，21個(gè)AA，以及最后94個(gè)AA分別是C19orf18蛋白的胞外段（ED），穿膜區(qū)（TM）以及胞內(nèi)段（ID）。通過(guò)NCBI查詢?nèi)薈19orf18基因序列（Gene ID：147685），在其編碼的胞外段和胞內(nèi)段基因的上下游各設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，利用PCR擴(kuò)增出C19orf18蛋白胞外段和胞內(nèi)段的基因，模板為一段來(lái)自韓家淮教授贈(zèng)予的cDNA，胞外段和胞內(nèi)段中間通過(guò)甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸（GGGGS）的柔性肽連接，再用BamH I和Not I雙酶切得到pET28a與pET32a大片段。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行終延伸68℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，切取大小正確的條帶，利用瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒提取純化PCR產(chǎn)物，將純化后的PCR產(chǎn)物與載體用一步克隆法進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21（DE3）感受態(tài)，在Luria-Bertani（LB）平板上挑取單克隆并于37℃振蕩培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后進(jìn)行鑒定。

1.2.3 C19orf18蛋白的小量表達(dá) 將鑒定正確的菌液接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖床上震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。一部分用于保存甘油菌，另取一部分按1∶100的比例加入到10 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min搖床中震蕩培養(yǎng)使其OD值達(dá)到0.6-0.8之間，然后在實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h，同時(shí)設(shè)立不加IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照組。取5 mL菌液，5 000 r/min離心15 min，棄上清，收集菌體沉淀。然后將沉淀重懸于200 μL PBS中，震蕩器震蕩混勻，加入SDSPAGE蛋白上樣緩沖液（5×），100℃煮10 min變性，分別取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的樣品20 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。為了研究C19orf18蛋白的溶解性，取5 mL的菌液，5 000 r/min離心15 min，沉淀用PBS重懸后置于冰浴中超聲裂解，將上清和沉淀同時(shí)收集后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，最后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.4 重組蛋白的純化 將鑒定正確的菌液接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min 搖床上震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將上面5 mL菌液按1∶100 的比例加入到200 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)使其OD值達(dá)到0.6-0.8之間，加入IPTG，使其終濃度為0.5 mmol/L，37℃震蕩培養(yǎng)6 h后，將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液在4℃、5 000 r/min離心15 min，棄上清，收集沉淀。用20 mL的PBS重懸菌體沉淀，置于冰浴中超聲裂解細(xì)菌，超聲波處理?xiàng)l件為：功率250 W，共作用3 輪，每一輪作用5 s，間隔10 s，作用99次。將細(xì)菌裂解液4℃、12 000 r/min離心20 min，收集超聲破碎后的沉淀，用20 mL的包涵體洗滌液（洗滌液1：10.0 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1.0 mmol/L EDTA，2 mol/L尿素；洗滌液2：10.0 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1.0 mmol/L EDTA，1% Triton X-100）對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌。8 000 r/min 離心20 min，沉淀即為包涵體。將沉淀重懸于Buffer（8 mol/L Urea，0.01 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L Na2HPO4，pH8.0）中，并于搖床上放置30 min后，10 000 r/min離心30 min。將上清上樣于預(yù)先用平衡緩沖液平衡好的Ni-NTA親和柱中［8］。用含不同濃度咪唑（0、10、50、200和500 mmol/L）的洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，8 mol/L尿素，pH8.0）梯度洗脫，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。最后將得到的蛋白儲(chǔ)存于-80℃冰箱。

1.2.5 C19orf18蛋白多克隆抗體的制備 用純化的C19orf18蛋白免疫新西蘭白兔，每只家兔以100 μg/kg的劑量注射。將C19orf18與弗氏完全佐劑充分混勻后，進(jìn)行背部多點(diǎn)肌肉注射。分別于15、29和43日用相同劑量的C19orf18蛋白與弗氏不完全佐劑混合加強(qiáng)免疫3次，第53天進(jìn)行耳緣靜脈采血，兔心臟采血，分離抗血清存放在-80℃冰箱，保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.6 抗血清的純化 為了得到高特異性的多克隆抗體，先對(duì)得到的抗血清進(jìn)行Protein A親和純化。兔血清經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，Protein A親和柱用10倍柱體積PBS平衡，流盡溶液，血清過(guò)親和柱，流盡溶液，收集流穿，10倍柱體積PBS洗滌，流盡溶液，接著，5倍柱體積的甘氨酸溶液（0.1 mol/L，pH2.5）加入到柱子中，分管收集洗脫液，每管1 mL，加入pH8.8的1 mol/L Tris溶液以中和洗脫液。收集洗脫液檢測(cè)280 nm處的吸光度，吸光度大于1.0的組分合并，用PBS進(jìn)行透析過(guò)夜。取C19orf18蛋白，加入PBS，用1 L PBS透析過(guò)夜（4℃），取出蛋白，連接到活化的CNBr-activated Sepharose 4B上，制備抗原親和柱，親和柱用10倍柱體積PBS平衡。然后，將血清過(guò)層析柱并收集流出物。之后，再次用10倍柱體積的PBS平衡親和層析柱，加入5 mL抗體洗脫液，分管收集洗脫液，每管1 mL，收集的洗脫液檢測(cè)280 nm處的吸光度，吸光度大于1.0的組分合并，用PBS進(jìn)行透析。

1.2.7 ELISA檢測(cè)純化后的多克隆抗體的效價(jià)C19orf18蛋白用pH9.6的0.05 mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液稀釋成1 μg/mL，加入酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4℃過(guò)夜。將包被液棄去，每孔加入200 μL封閉液（5%脫脂奶粉），37℃放置1.5 h。棄去封閉液，加入純化的稀釋好的多克隆抗體，每孔100 μL加入酶標(biāo)板，37℃放置1 h。用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min，加入100 μL用封閉液稀釋至工作濃度的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，每孔100 μL，37℃放置30 min后，用洗滌液洗3次。加入TMB顯色底物，每孔100 μL，37℃放置15 min，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀λ=450 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度［10］。

1.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，胰酶消化細(xì)胞并于6孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔4×105個(gè)細(xì)胞，操作按Thermo Fisher Scientific公司的Lipo3000轉(zhuǎn)染手冊(cè)進(jìn)行。每孔2.5 μg質(zhì)粒與脂質(zhì)體共同孵育形成復(fù)合物后，與無(wú)血清的培養(yǎng)液一起加入培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24-72 h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，取效果最佳者進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)。

1.2.9 Western blotting鑒定 將細(xì)胞用PBS洗3次后，加入細(xì)胞裂解液，4℃離心取上清，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白的濃度。等量的總蛋白經(jīng)常規(guī)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉常溫封閉30 min；TBST洗滌3次后，以C19orf18蛋白多克隆抗體為一抗在4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次后，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，室溫孵育2 h。同樣經(jīng)TBST清洗后，掃描 PVDF膜并分析結(jié)果［11］。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

設(shè)計(jì)合成引物進(jìn)行C19orf18基因PCR擴(kuò)增，插入到pET28a（+）和pET32a（+）載體中。C19orf18蛋白的胞外段基因和胞內(nèi)段基因通過(guò)overlap PCR的方法拼接到一起，中間用柔性肽GGGGS連接，方案和所用引物如圖1和表1所示。C19orf18基因片段插入到用BamH I和Not I雙酶切的原核表達(dá)載體pET-28a（+）和pET-32a（+）中，構(gòu)建pET28a-C19orf18及pET32a-C19orf18質(zhì)粒，DNA測(cè)序結(jié)果正確。

圖1 pET28a-C19orf18和pET32a-C19orf18表達(dá)載體的構(gòu)建方案

表1 C19orf18蛋白的氨基酸序列及PCR反應(yīng)引物序列

2.2 pET28a-C19orf18和pET32a-C19orf18在大腸桿菌中的表達(dá)分析

為了在大腸桿菌中表達(dá)C19orf18蛋白，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，并且在37℃條件下用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h。最后，將所有大腸桿菌BL21（DE3）裂解，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×），100℃煮10 min。然后，通過(guò)SDS-PAGE電泳分析細(xì)菌裂解液。電泳結(jié)果（圖2）證實(shí)該蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞中成功表達(dá)，并且pET28a-C19orf18比pET32a-C19orf18表達(dá)的蛋白量要高很多，選擇pET28a-C19orf18用于進(jìn)一步的蛋白質(zhì)表達(dá)純化。

2.3 C19orf18蛋白以包涵體形式表達(dá)

為了檢測(cè)大腸桿菌中表達(dá)的C19orf18蛋白的溶解度，在超聲處理后通過(guò)SDS-PAGE電泳分析細(xì)菌裂解液的上清液和沉淀物，觀察到具有預(yù)期分子量大小的C19orf18蛋白條帶（圖3）。結(jié)果表明大多數(shù)C19orf18蛋白是不溶性的，主要分布在細(xì)菌裂解液的沉淀中。

2.4 C19orf18蛋白的純化及濃度測(cè)定

將C19orf18蛋白變性后，通過(guò)Ni-NTA親和純化。高濃度的蛋白質(zhì)可以通過(guò)加入不同濃度的咪唑（0、10、50、200和500 mmol/L）進(jìn)行梯度洗脫（圖4）。使用SDS-PAGE電泳測(cè)定C19orf18蛋白的濃度，測(cè)得的C19orf18蛋白濃度為約0.8 μg/μL（圖5）。

圖2 pET28a-C19orf18和pET32a-C19orf18在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)的SDS-PAGE電泳分析

圖3 蛋白表達(dá)形式SDS-PAGE電泳分析

圖4 蛋白純化SDS-PAGE電泳圖

2.5 通過(guò)ELISA測(cè)定C19orf18蛋白多克隆抗體的效價(jià)

將純化的C19orf18蛋白加入等量的弗氏完全佐劑免疫新西蘭白兔，用添加弗氏不完全佐劑的C19orf18蛋白加強(qiáng)免疫，制備多克隆抗體。將單用Protein A純化的多克隆抗體和用先經(jīng)過(guò)Protein A純化，后用抗原親和純化的多克隆抗體進(jìn)行稀釋，用ELISA方法進(jìn)行抗體的效價(jià)檢測(cè)，用免疫前血清純化得到的IgG作為陰性對(duì)照。結(jié)果（圖6）顯示，隨著抗體濃度的降低，OD值逐漸變小，但經(jīng)過(guò)抗原親和純化的多克隆抗體效價(jià)仍高達(dá)1∶80 000以上，比單用Protein A純化的多克隆抗體高。

圖5 蛋白定量電泳圖

圖6 多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)

2.6 利用Western blotting檢測(cè)C19orf18蛋白多克隆抗體的特異性

用4種特異性針對(duì)C19orf18基因的shRNA表達(dá)載體和一種陰性對(duì)照質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，通過(guò)RNA干擾后，采用Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞中C19orf18蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果（圖7）顯示，實(shí)驗(yàn)組S1、實(shí)驗(yàn)組S2、實(shí)驗(yàn)組S3、實(shí)驗(yàn)組S4的C19orf18蛋白表達(dá)水平與陰性對(duì)照組相比顯著受到抑制。C19orf18蛋白被干擾的效率（圖8）顯示，轉(zhuǎn)染后，C19orf18基因的表達(dá)被明顯抑制，進(jìn)一步證明C19orf18蛋白多克隆抗體能夠識(shí)別人源的C19orf18蛋白，特異性較好。

圖7 多克隆抗體的特異性檢測(cè)

圖8 C19orf18蛋白相關(guān)的shRNA干擾效率

3 討論

隨著人類基因組計(jì)劃的發(fā)展，越來(lái)越多的具有未知功能的蛋白質(zhì)被研究清楚，其中一些與人類疾病密切相關(guān)［12，13］。其中，對(duì)C19orf18蛋白的了解卻非常有限，功能尚不清楚。近來(lái)一些研究表明C19orf18蛋白與多種人類疾病相關(guān)，包括畸形精子癥，阿爾茨海默病，回盲腸腺癌和黑色素瘤等等。為了研究C19orf18蛋白的功能，高特異性的C19orf18抗體對(duì)于理解C19orf18蛋白的分子機(jī)制和生理功能是非常重要的。

單克隆抗體制備程序較為復(fù)雜，且許多實(shí)驗(yàn)也無(wú)需使用單抗。多克隆抗體以其操作簡(jiǎn)便、對(duì)使用儀器要求不高、周期短、成本低、效果好等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛運(yùn)用［14-18］。使用原核表達(dá)蛋白免疫兔子制備多克隆抗體是目前最常見(jiàn)的手段之一［19］。在本實(shí)驗(yàn)中，為了獲得具有更高特異性的C19orf18蛋白多克隆抗體，使用了去除預(yù)測(cè)的信號(hào)肽區(qū)和跨膜區(qū)的C19orf18的截短肽作為免疫原免疫兔子。首先，通過(guò)PCR的方法獲得C19orf18基因的胞外段和胞內(nèi)段，并克隆到原核表達(dá)的pET32a和pET28a載體中。之后，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，選擇具有更高蛋白表達(dá)水平的pET28a載體。最后，我們純化了大腸桿菌表達(dá)C19orf18重組蛋白。為了獲得多克隆抗體，使用具有相對(duì)低的成本的兔子作為免疫動(dòng)物模型。在免疫的過(guò)程中，加入弗氏佐劑來(lái)減緩蛋白質(zhì)的釋放，從而增加其在血清中的半衰期，這可提高巨噬細(xì)胞的吞噬作用的效率，使C19orf18蛋白更具免疫原性［20］。獲得的多克隆抗體效價(jià)通過(guò)間接ELISA檢測(cè)，達(dá)到了1∶80 000以上，說(shuō)明融合蛋白具有較好的免疫原性，最后通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)，C19orf18蛋白多克隆抗體對(duì)人內(nèi)源的C19orf18蛋白有良好反應(yīng)，我們成功獲得了具有高特異性的多克隆抗體。

綜上，我們制備的高度純化的C19orf18重組蛋白和對(duì)人內(nèi)源C19orf18蛋白具有高特異性多克隆抗體，將有利于在分子水平和細(xì)胞水平對(duì)C19orf18蛋白結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)行深入研究，使用這種抗體進(jìn)行腫瘤方面的研究工作我們正在進(jìn)行中。

4 結(jié)論

本 實(shí) 驗(yàn) 構(gòu)建 了pET28a-C19orf18和pET32a-C19orf18重組載體，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了C19orf18蛋白，又用此蛋白作為抗原免疫新西蘭白兔，得到C19orf18蛋白多克隆抗體。ELISA結(jié)果顯示，多克隆抗體效價(jià)高達(dá)1∶80 000，Western blotting證實(shí)多克隆抗體具有很好的特異性。

［1］Strausberg RL, Feingold EA, Grouse LH, et al. Generation and initial analysis of more than 15, 000 full-length human and mouse cDNA sequences［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99：16899-16903.

［2］Gerhard DS, Wagner L, Feingold EA, et al. The status, quality, and expansion of the NIH full-length cDNA project：the Mammalian Gene Collection（MGC）［J］. Genome Res, 2004, 14：2121-2127.

［3］Platts AE, Dix DJ, Chemes HE, et al. Success and failure in human spermatogenesis as revealed by teratozoospermic RNAs［J］. Hum Mol Genet, 2007, 16：763-773 .

［4］Olah J, Vincze O, Virok D, et al. Interactions of pathological hallmark proteins：tubulin polymerization promoting protein/p25, beta-amyloid, and alpha-synuclein［J］. J Biol Chem, 2011, 286：34088-34100.

［5］Gonzales PA, Pisitkun T, Hoffert JD, et al. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes［J］. Journal of the American Society of Nephrology, 2009, 20：363-379.

［6］Wang Y, Liu T, Huang P, et al. A novel Golgi protein（GOLPH2）-regulated oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor efficacy in hepatocellular carcinoma［J］. Oncotarget, 2015, 6：13564-13578.

［7］Wilson AG, Symons JA, McDowell TL, et al. Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional activation［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94：3195-3199.

［8］Hwang WH, Lee WK, Ryoo SW, et al. Expression, purification and improved antigenicity of the Mycobacterium tuberculosis PstS1 antigen for serodiagnosis［J］. Protein Expr Purif, 2014, 95：77-83.

［9］Daniel MD, Melendez LV, Hunt RD, et al. Herpesvirus saimiri：VII. Induction of malignant lymphoma in New Zealand white rabbits［J］. J Natl Cancer Inst, 1974, 53：1803-1807.

［10］Qasemi M, Behdani M, Shokrgozar MA, et al. Construction and expression of an anti-VEGFR2 Nanobody-Fc fusionbody in NS0 host cell［J］. Protein Expr Purif 2016, 123：19-25.

［11］ Zhang YL, Chen SS, Yang KG, et al. Functional expression, purification, and characterization of human Flt3 ligand in the Pichia pastoris system［J］. Protein Expr Purif, 2005, 42：246-254.

［12］Stenson PD, Mort M, Ball EV, et al. The Human Gene Mutation Database：building a comprehensive mutation repository for clinical and molecular genetics, diagnostic testing and personalized genomic medicine［J］. Hum Genet, 2014, 133：1-9.

［13］Pericak-Vance MA, Bebout JL, Gaskell PC, Jr. , et al. Linkage studies in familial Alzheimer disease：evidence for chromosome 19 linkage［J］. Am J Hum Genet, 1991, 48：1034-1050.

［14］Cai SH, Yaol SY, Lu YS, et al. Immune response in Lutjanus erythropterus induced by the major outer membrane protein（OmpU）of Vibrio alginolyticus［J］. Dis Aquat Organ, 2010, 90：63-68.

［15］Zahn R, von Schroetter C, Wuthrich K. Human prion proteins expressed in Escherichia coli and purified by high-affinity column refolding［J］. FEBS Lett, 1997, 417：400-404.

［16］Hu Z, Chen Z, Huang N, et al. Expression, purification of IL-38 in Escherichia coli and production of polyclonal antibodies［J］. Protein Expr Purif, 2015, 107：76-82.

［17］Liu F, Wu X, Li L, et al. Expression, purification and characterization of two truncated peste des petits ruminants virus matrix proteins in Escherichia coli, and production of polyclonal antibodies against this protein［J］. Protein Expr Purif, 2013, 91：1-9.

［18］Yang Y, Wang B, Yang D, et al. Prokaryotic expression of woodchuck cytotoxic T lymphocyte antigen 4（wCTLA-4）and preparation of polyclonal antibody to wCTLA-4［J］. Protein Expr Purif, 2012, 81：181-185.

［19］Hernandez-Torres F, Pedrajas JR, Aranega AE, et al. Expression in bacteria of small and specific protein domains of two transcription factor isoforms, purification and monospecific polyclonal antibodies generation, by a two-step affinity chromatography procedure［J］. Protein Expr Purif, 2008, 60：151-156.

［20］Lotan R, Beattie G, Hubbell W, et al. Activities of lectins and their immobilized derivatives in detergent solutions. Implications on the use of lectin affinity chromatography for the purification of membrane glycoproteins［J］. Biochemistry 1977, 16：1787-1794.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Prokaryotic Expression，Purification and Preparation of Polyclonal Antibody of C19orf18 Protein

TONG Xiao-Xia1YANG Yuan-Qin1CHEN Mian2WANG Huai-Yuan2HU Hai-Jun2ZHANG Kang-Jian2，3
（1. Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018；2. State Key Laboratory of Cell Biology，Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology，Shanghai Institutes for Biological Sciences，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200031；3. Sichuan Huiyang Life Science and Technology Corp，Chengdu 610021）

The purpose of this study is to clone the human C19orf18 gene，construct the prokaryotic expression system of C19orf18，and prepare the recombinant human C19orf18 protein and its corresponding rabbit polyclonal antibody. According to the sequence reported in GenBank database，we used PCR to amplify intracellular and extracellular segments，and ligated them by flexible peptide，and inserted the target segment into prokaryotic expression vectors pET28a and pET32a. Then the vectors of high expression were selected by inducing a little expression of target protein. Further the highly expressing vector was employed for expressing the great amount of target protein. The C19orf18 protein was purified by Ni-NTA affinity column，and then identified by SDS-PAGE. Following that，New Zealand white rabbits were immunized with the purified proteins four times to produce polyclonal antibody. Specificity of the product polyclonal antibody was affirmed by Western blotting. Our results showed that pET28a was a better vector than pET32a for the expression of C19orf18 protein. More importantly，C19orf18 protein with truncated amino acids was expressed in prokaryotic cells，and its corresponding rabbit polyclonal antibody with high specificity was prepared successfully.

C19orf18 protein；prokaryotic expression；antigen affinity purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1031

2016-11-15

四川科技項(xiàng)目（2013ZZ0004），四川輝陽(yáng)生命工程股份有限公司研究項(xiàng)目（Y363S21763）

童霄霞，女，碩士，研究方向：癌癥的靶向基因-病毒治療；E-mail：xiaoxia_tong@163.com

章康健，男，博士，研究方向：癌癥的靶向基因-病毒治療及超級(jí)干擾素的抗癌機(jī)理研究；E-mail：zhangkangjian@sibcb.ac.cn