趙能原曉龍繆福俊王毅陳偉李江吳濤王娟

（1. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224；2. 云南省林業(yè)科學(xué)院 云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201）

思茅松轉(zhuǎn)錄組SSR分析及標(biāo)記開(kāi)發(fā)

趙能1原曉龍2繆?？?王毅2陳偉2李江2吳濤2王娟2

（1. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224；2. 云南省林業(yè)科學(xué)院 云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201）

基于思茅松轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行其SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)，為豐富思茅松SSR數(shù)據(jù)庫(kù)提供參考。采用MISA軟件對(duì)思茅松59 636條Unigene進(jìn)行SSR搜索，共獲得3 745個(gè)SSR位點(diǎn)，分布頻率為6.28%，平均11.36 kb出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)。SSR重復(fù)類(lèi)型以三核苷酸基序?yàn)橹?，其次是二核苷酸基序，所占比例分別為49%和24%，其主要重復(fù)單元分別為AGC/CTG和AT/TA。隨機(jī)挑選224個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)及合成，瓊脂糖凝膠檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中29個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性且效果良好，但僅12個(gè)位點(diǎn)符合SSR重復(fù)類(lèi)型的倍數(shù)大小且擴(kuò)增效率高于85%。利用這12對(duì)熒光標(biāo)記引物，對(duì)2個(gè)居群42份樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測(cè)到35個(gè)等位基因，多態(tài)性信息量（PIC）為0.093 2-0.480 9，平均為0.306 9。4個(gè)位點(diǎn)為低度多態(tài)位點(diǎn)（0＜PIC＜0.25），8個(gè)位點(diǎn)為中度多態(tài)位點(diǎn)（0.25＜PIC＜0.5）。這12個(gè)標(biāo)記可用于思茅松遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及克隆等研究，旨為思茅松分子標(biāo)記輔助育種及變異水平等研究提供技術(shù)支持。

思茅松；轉(zhuǎn)錄組；SSR；引物開(kāi)發(fā)

思茅松（Pinus kesiya var. langbianensis）是松科松屬常綠喬木，為卡西亞松（P. kesiya）的地理變種，主要分布在云南中南部海拔1 800 m以下地區(qū)，具有生長(zhǎng)快、材質(zhì)好、紋理正直等特點(diǎn)，木材纖維長(zhǎng)且強(qiáng)度高，是云南省重要的造林、采脂、紙漿材及用材針葉樹(shù)種，在云南省林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)中起著極其重要的作用［1，2］。思茅松的遺傳育種研究一直受到重視，已從育種策略［3］、核型分析［4］和等位酶分析［5］等方面開(kāi)展了研究。隨著科技的進(jìn)步，分子標(biāo)記技術(shù)已在近年來(lái)開(kāi)始用于思茅松遺傳多樣性研究。盡管建立了思茅松簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增（Inter-simple sequence repeat，ISSR）［6］和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）［7］的PCR擴(kuò)增體系，但已有的思茅松遺傳多樣性研究?jī)H限于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）一種方法［8］，還沒(méi)有用簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記分析思茅松遺傳多樣性的報(bào)道，因而缺乏思茅松SSR標(biāo)記的特異性引物。

SSR標(biāo)記又稱(chēng)微衛(wèi)星標(biāo)記，具有穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富、位點(diǎn)特異性、共顯性遺傳和檢測(cè)方便等特點(diǎn)，是廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、親權(quán)鑒定、基因定位及克隆等的理想分子標(biāo)記［9，10］。引物開(kāi)發(fā)是進(jìn)行SSR分子標(biāo)記研究的前提。早期開(kāi)發(fā)SSR引物的方法主要有2種，一種是cDNA文庫(kù)構(gòu)建和克隆測(cè)序的方法，另一種是通過(guò)搜索公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）進(jìn)行開(kāi)發(fā)［11］。前者步驟復(fù)雜、工作量大、開(kāi)發(fā)成本高，后者需要大量EST數(shù)據(jù)的支持。由于思茅松分子研究基礎(chǔ)較為薄弱，目前尚無(wú)其SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)及應(yīng)用的報(bào)道。鑒于當(dāng)前高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，測(cè)序成本顯著降低，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，其所產(chǎn)生的巨量數(shù)據(jù)中包含了大量的EST序列，基于此進(jìn)行SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)無(wú)疑是便捷有效的方法［12，13］。因此，對(duì)思茅松EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行系統(tǒng)性識(shí)別并開(kāi)發(fā)專(zhuān)屬、穩(wěn)定和有效的標(biāo)記引物，對(duì)于推進(jìn)思茅松遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)探索、開(kāi)展種質(zhì)資源的研究以及選育優(yōu)良新品種（系）等工作有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

本研究以思茅松轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對(duì)59 636條Unigenes中的SSRs位點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)搜索和引物批量設(shè)計(jì)，對(duì)它們?cè)谵D(zhuǎn)錄組中的分布特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析，并且隨機(jī)挑選224對(duì)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，旨在為思茅松的SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料為云南省普洱市普文鎮(zhèn)普文林場(chǎng)的高產(chǎn)脂單株“KHR01”，采集其樹(shù)干韌皮部和形成層組織，液氮保存。2014年5月，經(jīng)華大基因公司（北京）通過(guò)Illumina Hiseq2000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得59 636條Unigene，總長(zhǎng)42 526 184 nt，平均長(zhǎng)度713 nt。

SSR擴(kuò)增所用思茅松樣本于2015年8月采自景谷林場(chǎng)和普文林場(chǎng)的2個(gè)人工林居群，每個(gè)居群各取21株單株樣本。樣品取健康的當(dāng)年生針葉，硅膠干燥保存，用于DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用DNAsecure Plant Kit（北京天根）試劑盒，提取思茅松各單株的基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，稀釋成20 ng/ μL，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR序列 來(lái)源 使用軟件Micro Satellite（MISA）對(duì)59 636條Unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)查找。查找標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)巍⒍?、三、四、五、六核苷酸的最小重?fù)次數(shù)分別為12、6、5、5、4、4次，并且SSR位點(diǎn)側(cè)翼序列長(zhǎng)度≥50 bp。

用Primer5和Oligo7軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)。設(shè)計(jì)引物時(shí)設(shè)置的主要參數(shù)為：GC含量40%-70%，退火溫度58-60℃，引物長(zhǎng)18-25 bp，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100-300 bp，且無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體。引物命名為YAFP加序號(hào)，如YAFP-001。

1.2.3 SSR引物篩選 隨機(jī)選取224對(duì)SSR引物，由Invitrogen（上海）公司合成。PCR擴(kuò)增所用的2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：Master Mix10 μL，DNA模版1 μL，Primer F與Primer R各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。利用BioRad基因擴(kuò)增儀（T100）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

用6個(gè)思茅松單株DNA樣品的混合模板對(duì)224對(duì)引物進(jìn)行初篩，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠于5 V/cm下電泳60 min，電泳結(jié)束后EB染色，用GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照，檢測(cè)有無(wú)明顯目的條帶。有目的條帶的引物再用思茅松12個(gè)DNA模版進(jìn)行SSR引物復(fù)篩，檢測(cè)是否具有多樣性。

1.2.4 SSR遺傳多樣性分析 選擇12對(duì)條帶清晰、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定且具有多態(tài)性位點(diǎn)的引物，合成熒光標(biāo)記引物，以2個(gè)居群的42個(gè)思茅松單株DNA樣品為模板，按照上述PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序進(jìn)行SSR位點(diǎn)擴(kuò)增。取1 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，于ABI3730 DNA分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，并收集數(shù)據(jù)。用GeneMapper 4. 0軟件對(duì)收集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過(guò)內(nèi)標(biāo)讀取SSR標(biāo)記片段的大小。按照大寫(xiě)英文字母順序記錄等位基因，即同一位點(diǎn)最大的等位基因記為A，其余等位基因則依次記為B，C，D等；只有1個(gè)峰值的按照純合基因型處理。用POPGENE 1.31軟件統(tǒng)計(jì)分析等位基因數(shù)（Na）、Shannon信息指數(shù)（I），利用PowerMarker 3.25軟件計(jì)算多態(tài)性信息量（PIC）。

2 結(jié)果

2.1 思茅松轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的分布特點(diǎn)

經(jīng)過(guò)MISA軟件篩選，在思茅松轉(zhuǎn)錄組的59 636個(gè)Unigene序列中發(fā)現(xiàn)共3 745 SSR位點(diǎn)，SSR的分布頻率（SSR的個(gè)數(shù)與總Unigene的數(shù)量比）為6.28%。思茅松轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)單元的分布特征如表1所示。可以看出，思茅松轉(zhuǎn)錄組中SSR的主要重復(fù)類(lèi)型是三核苷酸重復(fù)，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的49%，其次為二核苷酸重復(fù)，占SSR總數(shù)的24%，其余核苷酸重復(fù)類(lèi)型的數(shù)量較少，總計(jì)27%（表1）。

表1 思茅松轉(zhuǎn)錄組SSR分布特征

在出現(xiàn)頻率最多的三核苷酸重復(fù)中，出現(xiàn)頻率最高的核苷酸類(lèi)型是AGC/CTG，占三核苷酸重復(fù)類(lèi)型的24%；其次為AAG/CTT，占三核苷酸重復(fù)類(lèi)型的20%；出現(xiàn)頻率第三和第四的分別是AGG/CCT和ATC/ATG，分別占三核苷酸重復(fù)類(lèi)型的19%和12%；其余核苷酸類(lèi)型的數(shù)量較少，總計(jì)25%（圖1）。

圖1 三核苷酸重復(fù)中不同重復(fù)單元比例

2.2 思茅松轉(zhuǎn)錄組SSR引物的有效性檢測(cè)

用6個(gè)思茅松單株樣本的DNA混合模板對(duì)224對(duì)引物進(jìn)行初篩，其中123對(duì)引物擴(kuò)增效果明顯，能夠獲得帶型清晰、與預(yù)期大小相符的目的片段，擴(kuò)增率為54.91%。之后選用思茅松12個(gè)單株樣本的DNA模板對(duì)這123對(duì)引物進(jìn)行復(fù)篩，得到帶型清晰且擴(kuò)增穩(wěn)定的引物共29對(duì)，占所有設(shè)計(jì)引物的12.95%。圖2展示了引物YAFP-04擴(kuò)增12個(gè)模板的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖3展示了引物YAFP-04分別擴(kuò)增4個(gè)樣品的毛細(xì)管電泳結(jié)果。這29對(duì)引物擴(kuò)增出的目的片段長(zhǎng)度基本在100到280 bp，但經(jīng)ABI3730毛細(xì)管電泳分析后，其中17對(duì)引物的擴(kuò)增片段大小不符合SSR重復(fù)類(lèi)型的倍數(shù)大小或存在較多的無(wú)效擴(kuò)增，僅12對(duì)引物（表2）的擴(kuò)增效率不低于85%，擴(kuò)增結(jié)果的峰型清晰且具有多態(tài)性，用于后續(xù)的思茅松群體遺傳多樣性分析。

圖2 引物YAFP-04擴(kuò)增12個(gè)樣本的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

表2 12對(duì)SSR引物序列

表3 12對(duì)SSR引物的遺傳多樣性分析

2.3 思茅松遺傳多樣性分析

通過(guò)GeneMapper4.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，采用POPGENE 1.31和PowerMarker軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，42個(gè)樣本在12個(gè)SSR位點(diǎn)檢測(cè)到的遺傳變異見(jiàn)表3。12對(duì)引物共檢測(cè)到35個(gè)等位基因，平均每對(duì)引物檢測(cè)到2.92個(gè)等位基因，其中引物YAFP-04在42個(gè)樣本中檢測(cè)的等位基因數(shù)量最多，為5個(gè)（圖3）。12個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC）為0.093 2-0.480 9，平均為0.306 9。根據(jù)Botstein等［14］的理論，有4個(gè)標(biāo)記為低度多態(tài)位點(diǎn)（0＜PIC＜0.25），8個(gè)標(biāo)記為中度多態(tài)位點(diǎn)（0.25＜PIC＜0.5），無(wú)高度多態(tài)位點(diǎn)（PIC＞0.5），YAFP-11位點(diǎn)的PIC最高（0.480 9）。

圖3 引物YAFP-04對(duì)4個(gè)樣本的基因型分型結(jié)果

3 討論

思茅松轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星種類(lèi)豐富且數(shù)量眾多，從單核苷酸重復(fù)到6核苷酸重復(fù)都有出現(xiàn)，主要重復(fù)類(lèi)型為二、三核苷酸重復(fù)類(lèi)型，占到所有重復(fù)類(lèi)型的73%，這與張振等［15］對(duì)紅松（Pinus koraiensis）轉(zhuǎn)錄組SSR標(biāo)記的分析結(jié)果一致。同為松屬植物，紅松EST中的SSR重復(fù)類(lèi)型也是以二核苷酸與三核苷酸重復(fù)類(lèi)型居多，且以三核苷酸重復(fù)類(lèi)型為主。大別山五針?biāo)桑≒inus dabeshanensis）［16］也呈現(xiàn)相同結(jié)果，甘蔗（Saccharum officinarum）［17］和普通小麥（Triticum aestivum）［18］等農(nóng)作物同樣是以三核苷酸重復(fù)類(lèi)型為主，其三核苷酸重復(fù)類(lèi)型分別為90%和67%。二核苷酸重復(fù)單元中AT／TA和AG／TC（占全部二核苷酸重復(fù)單元的88.28%）占主導(dǎo)地位，但GC/CG單元只出現(xiàn)一次，這一結(jié)果與黃海燕等人［19］在杜仲（Eucommia ulmoides）的轉(zhuǎn)錄組SSR中GC/CG單元只出現(xiàn)一次的結(jié)果一致，表現(xiàn)出明顯的偏倚性，這一結(jié)果可能與思茅松本身基因組特性有關(guān)。

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索SSR位點(diǎn)，搜索結(jié)果與搜索標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)［19］。本項(xiàng)研究中，從思茅松59 636個(gè)Unigene序列中發(fā)現(xiàn)3 745個(gè)SSR位點(diǎn)，分布頻率為6.28%，略高于馬尾松（Pinus massoniana）（3.62%）［20］， 日 本 落 葉 松（Larix kaempferi）（3.85%）［21］及火炬松（Pinus taeda）（4.32%）［22］。思茅松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的Unigene序列總長(zhǎng)為42 526 184bp，平均11.36 kb發(fā)現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)，其SSR分布距離與楊樹(shù)（Populus，14.0 kb）［23］、銀杏（Ginkgo biloba，12.02 kb）［24］和胡椒（Piper nigrum，12.86 kb）［25］相近，低于橡膠（Hevea brasiliensis，3.93 kb）［26］、 茶 樹(shù)（Camellia sinensis，3.68 kb）［27］和柑 桔（Citrus，5.7 kb）［28］， 高 于 油 菜（Brassica napus）［29］、杜仲（26.13 kb）［19］等。這一方面說(shuō)明本項(xiàng)研究設(shè)定的SSR位點(diǎn)搜尋標(biāo)準(zhǔn)較為適宜，另一方面也提示，當(dāng)搜尋結(jié)果獲得的SSR位點(diǎn)數(shù)量較少而難以開(kāi)發(fā)滿(mǎn)意數(shù)量的SSR標(biāo)記時(shí)，可適當(dāng)調(diào)整搜索標(biāo)準(zhǔn)。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記是一種較為快捷有效的方法［30-32］。但由于針葉樹(shù)種的基因組序列（10 000-40 000 Mb）較為巨大，是擬南芥（Arabidopsis thaliana，114.5 Mb）的100倍以上，且重復(fù)DNA序列較多，導(dǎo)致針葉樹(shù)種的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)成功率較低［33，34］。海岸松（Pinus pinaster）的成功率為7%［35］，中山杉（Taxodium ‘zhongshansa’）為16%［36］，冷杉（Abies alba）為24%［37］。本研究也表明思茅松SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)成功率較低，僅為5.36%（12/224）。但所獲得的12對(duì)引物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)具有多態(tài)性，且成功的在2個(gè)居群42個(gè)思茅松樣本中進(jìn)行了遺傳多樣性分析，后續(xù)可作為遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及克隆等研究的理想分子標(biāo)記。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)思茅松轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析數(shù)據(jù)的Unigenes序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，得到3 745個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR重復(fù)類(lèi)型以三核苷酸為主（49%）；其次是二核苷酸（24%），主要重復(fù)單元分別為AGC/CTG和AT/TA。對(duì)其中的224個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，最終篩選出12個(gè)擴(kuò)增效率高、擴(kuò)增條帶清晰的多態(tài)性位點(diǎn)。這12個(gè)SSR標(biāo)記成功地運(yùn)用到思茅松2個(gè)居群的42個(gè)樣本中，印證了利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的可行性，為思茅松種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平分析及變異水平的研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Development of SSR Molecular Markers Based on Transcriptome Data of Pinus kesiya var. langbianensis

ZHAO Neng1YUAN Xiao-long2MIAO Fu-jun2WANG Yi2CHEN Wei2LI Jiang2WU Tao2WANG Juan2
（1. College of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming 650224；2. Yunnan Province Key Laboratory of Forest Plant Cultivation and Utilization，Yunnan Academy of Forestry，Kunming 650201）

In Simao pine（Pinus kesiya var. langbianensis）breeding programs，lack of co-dominant genetic markers constrains the development of molecular marker assisted breeding. The aim of this study is to develop SSR molecular markers using transcriptome sequencing data. Searching the SSR loci from 59636 unigenes of P. kesiya var. langbianensis with MISA software，total 3745 SSRs were obtained，accounting for 6.28% of the total unigenes，averagely one SSR per 11.36 kb. Trinucleotide and dinucleotide repeats were dominant types among SSRs with the ratio of 49% and 24%，and others were only 27%. AGC/CTG was the most trinucleotide motif and AT/TA was the most dinucleotide motif. The primers were designed and synthetized based on randomly selected 224 SSR loci，verification by agarose gel electrophoresis revealed that 29 loci showed clear polymorphism. While only 12 of the 29 loci satisfied the multiple fragments of SSR repeat motifs in capillary electrophoresis and their amplification efficiencies were higher than 85%. Genetic diversity of 42 Simao pine samples from Jingdong and Puwen populations was investigated with these 12 fluorescently labeled primers. A total of 35 alleles were detected，the polymorphism information content（PIC）of all loci ranged from 0.0932-0.4809（the mean was 0.3069）. Among these，4 loci were classified as lowly polymorphic ones（0 ＜ PIC ＜0.25）and 8 loci as moderately polymorphic ones（0.25 ＜ PIC ＜0.5）. Conclusively，these 12 SSRs may be used in future studies on genetic diversity，linkage mapping，gene location and cloning，providing the technical support for molecular marker assisted breeding and mutation in P. kesiya var. langbianensis.

Pinus kesiya var. Langbianensis；transcriptome；SSR；primer development

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.010

2016-10-24

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（201304105）

趙能，男，碩士研究生，研究方向：植物化學(xué)和分子生物學(xué)；E-mail：247677981@qq.com

吳濤，男，博士，副研究員，研究方向：林木遺傳育；E-mail：ynafwt@126.com王娟，女，博士，教授，研究方向：植物分子生物學(xué)和生物多樣性保護(hù)；E-mail：schima@163.com