馮小艷 張樹珍

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

綜述與專論

RNAi作用機(jī)制及應(yīng)用研究進(jìn)展

馮小艷 張樹珍

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由小非編碼RNA（small non-coding RNA，sncRNA）誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，廣泛存在于真核生物中。RNAi現(xiàn)象自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，很快成為生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，并取得了一定成果。就RNAi的作用機(jī)制、作用過(guò)程的關(guān)鍵因子及其應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為RNAi的進(jìn)一步研究提供參考。

RNAi；作用機(jī)制；dicer；argonaute蛋白家族；RdRP

狹義的RNA干擾（RNA interference，RNAi），是指由長(zhǎng)雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）產(chǎn)生的小RNA介導(dǎo)序列特異性mRNA降解，進(jìn)而引發(fā)基因沉默的現(xiàn)象。廣義的RNAi，是指由小非編碼RNA（Small non-coding RNA，sncRNA）誘導(dǎo)mRNA降解、抑制翻譯或促使異染色質(zhì)形成等，進(jìn)而引發(fā)基因沉默的現(xiàn)象［1-3］。本文所描述的RNAi指的是廣義RNAi。

1998年，F(xiàn)ire和Mello等［4］在線蟲（Caenorhabditis elegans）的研究中首次描述了RNAi現(xiàn)象。他們?cè)谘芯糠戳xRNA作用的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，正義RNA和反義RNA的混合物，即dsRNA對(duì)基因的沉默作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于任一單鏈RNA，并將dsRNA（實(shí)際是由dsRNA產(chǎn)生的小RNA）引起的基因沉默現(xiàn)象稱為RNAi。此后，人們?cè)诠墸―rosophila melanogaster）、錐蟲（Trypanosoma）、渦蟲（Planaria）、水螅（Hydra）、斑馬魚（Barchydanio rerio）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、青蛙（Rana nigromaculata）、小鼠及人類等多種真核生物中均發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象［5，6］。RNAi是真核生物獨(dú)有的基因沉默現(xiàn)象，普遍存在于真核生物中，是真核生物調(diào)控內(nèi)源基因表達(dá)及抵御外源核酸入侵的高效自我保護(hù)系統(tǒng)［7，8］。本文從廣義的角度對(duì)RNAi的作用機(jī)制、作用過(guò)程的關(guān)鍵因子及其應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為RNAi的進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 RNAi的作用機(jī)制

RNAi由長(zhǎng)度為20-30 nt的sncRNA觸發(fā)，根據(jù)sncRNA生物合成和作用機(jī)制的不同，可將其分為siRNA（small interfering RNA）、miRNA（microRNA）和piRNA（PIWI-interacting RNA）3種［9］。

1.1 siRNA的作用機(jī)制

siRNA的作用機(jī)制見(jiàn)圖1。由于RNA病毒入侵、基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄、自退火轉(zhuǎn)錄或?qū)嶒?yàn)轉(zhuǎn)染等原因，使得細(xì)胞中出現(xiàn)內(nèi)源性或外源性的dsRNA，核酸內(nèi)切酶Dicer識(shí)別dsRNA，并將其剪切成長(zhǎng)度為21-25 nt、5'端含有一個(gè)磷酸基團(tuán)、3'端含有一個(gè)羥基并且突出2 nt的siRNA［9-12］。siRNA的這一結(jié)構(gòu)對(duì)于RNAi是必要的，缺乏5'端磷酸化的siRNA或平端siRNA無(wú)論在細(xì)胞內(nèi)外都無(wú)法啟動(dòng)RNAi［13］。人工導(dǎo)入的siRNA需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞質(zhì)中的激酶Clp1加工成5'端磷酸化的siRNA才能參與誘導(dǎo)靶基因沉默［14］。具有一定結(jié)構(gòu)的siRNA隨后在Dicer的幫助下與AGO2等結(jié)合，構(gòu)成siRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（siRNA-induced silencing complex，siRISC），siRISC中 的 siRNA經(jīng)AGO2作用分解成兩條單鏈，正義鏈被釋放出去，反義鏈則留在siRISC中。僅含反義鏈的siRISC被激活，在反義鏈的引導(dǎo)下通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶基因結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)靶基因的沉默。沉默發(fā)生后，靶基因被釋放，使得siRISC能與另一個(gè)靶基因結(jié)合，開始誘導(dǎo)新一輪的基因沉默［10，15，16］。

siRISC誘導(dǎo)基因沉默的具體方式包括以下3種：（1）反義siRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)（一般發(fā)生在mRNA的編碼區(qū)或開放閱讀框中），siRISC中具有核酸內(nèi)切酶活性的AGO2剪切靶mRNA，啟動(dòng)靶mRNA的降解，一旦最初降解形成，細(xì)胞中的核酸外切酶就會(huì)攻擊剩余片段以完成整個(gè)降解過(guò)程，從而導(dǎo)致靶基因沉默，這是siRISC的主要作用方式［17-20］。（2）反義siRNA與靶mRNA不完全配對(duì)（一般發(fā)生在mRNA的3'非編碼區(qū)），此時(shí)的siRISC將抑制靶mRNA的翻譯或引發(fā)靶mRNA的降解。siRISC通過(guò)與翻譯起始復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)、影響核糖體大小亞基的聚合等作用在翻譯的起始階段抑制翻譯，或者通過(guò)減緩核糖體在翻譯中的移動(dòng)速度、促進(jìn)核糖體的提早解離等作用在翻譯的其他階段抑制翻譯。siRISC還可以促進(jìn)脫帽酶切除mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)，脫腺苷酶切除mRNA的3'端poly（A）尾巴，使mRNA失去5'和3'端的保護(hù)而被核酸外切酶攻擊，最終導(dǎo)致mRNA的降解［21-23］。（3）除了作用于mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)外，siRISC也可作用于DNA在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)。siRISC通過(guò)激活甲基化酶或抑制去甲基化酶的作用，引發(fā)DNA的甲基化，DNA的甲基化進(jìn)一步導(dǎo)致染色質(zhì)蛋白的甲基化、乙?；?、磷酸化和泛素化等，從而促進(jìn)異染色質(zhì)的形成，引發(fā)基因沉默［21，24-26］（圖1）。

雙鏈siRNA進(jìn)入siRISC后，經(jīng)AGO2作用解開成兩條單鏈，反義鏈留在siRISC中引導(dǎo)siRISC沉默靶基因，正義鏈被釋放出去。被釋放的正義鏈可能很快被降解，也可能作為引物，在RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）的催化下以靶mRNA為模板擴(kuò)增得到dsRNA，dsRNA又被Dicer降解成siRNA進(jìn)入RNAi循環(huán)，從而使得RNAi的效果級(jí)聯(lián)放大［10，27-29］。

1.2 miRNA的作用機(jī)制

與siRNA主 要 來(lái) 自 外 源 性dsRNA不同，miRNA主要源于生物自身的基因組［31］。細(xì)胞核內(nèi)編碼miRNA的基因在RNA聚合酶II或聚合酶III（polymerase II/ polymerase III，Pol II/Pol III）的作用下轉(zhuǎn)錄得到pri-miRNA，pri-miRNA是一個(gè)具有帽子結(jié)構(gòu)、poly（A）尾巴、一個(gè)或多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的大分子RNA，長(zhǎng)度從數(shù)百到數(shù)萬(wàn)個(gè)堿基不等。primiRNA經(jīng)Drosha或Mirtron作用，去除帽子結(jié)構(gòu)和poly（A）尾巴，得到長(zhǎng)度約為70 nt的pre-miRNA，pre-miRNA通常具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且其3'端突出2 nt。pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin 5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer剪切成長(zhǎng)度約為22 nt的miRNA：miRNA*雙鏈［21，32］。這種雙鏈miRNA的分子結(jié)構(gòu)與siRNA相似，同樣是5'端具有磷酸基團(tuán)，3'端具有羥基且突出2 nt，不同的是siRNA的兩條鏈完全互補(bǔ)配對(duì)，而miRNA的兩條鏈只是部分互補(bǔ)配對(duì)［33］。miRNA：miRNA*雙鏈很快與AGO（AGO1-4，主要是AGO1）等結(jié)合形成miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（miRNA-induced silencing complex，miRISC），隨后miRNA：miRNA*雙鏈中5'端堿基配對(duì)穩(wěn)定性較強(qiáng)的正義鏈miRNA*迅速被降解，5'端堿基配對(duì)穩(wěn)定性較弱的反義鏈miRNA則保留在miRISC中。僅含反義鏈的miRISC被激活，在反義鏈miRNA的引導(dǎo)下通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則識(shí)別靶基因，誘導(dǎo)靶基因沉默［9，21］（圖1）。

圖1 RNAi作用機(jī)制示意圖［10，30］

siRNA主要通過(guò)完全互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因結(jié)合，并通過(guò)直接剪切作用誘發(fā)靶基因的降解，從而保護(hù)體內(nèi)基因組不受轉(zhuǎn)座子活動(dòng)或病毒感染等外源性因素的影響。與之不同，miRNA主要通過(guò)不完全配對(duì)的方式與靶mRNA結(jié)合，抑制靶mRNA的翻譯或引發(fā)靶mRNA的降解，從而內(nèi)源性的調(diào)控體內(nèi)基因的表達(dá)［34，35］。miRNA與靶mRNA不完全配對(duì)時(shí)的具體作用機(jī)制與siRNA與靶mRNA不完全配對(duì)時(shí)的具體作用機(jī)制類似，亦是通過(guò)與翻譯起始復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)5'帽子結(jié)構(gòu)或影響核糖體的正常功能等作用抑制靶mRNA的翻譯，以及通過(guò)促進(jìn)相應(yīng)酶切除mRNA的5'和3'端保護(hù)結(jié)構(gòu)等作用誘發(fā)靶基因的降解［21，36-38］。與siRNA一致，miRNA也可以與靶基因完全互補(bǔ)配對(duì)，通過(guò)直接剪切作用誘發(fā)靶基因的降解［39］。此外，miRNA也能作用于DNA，通過(guò)誘導(dǎo)DNA甲基化，促進(jìn)異染色質(zhì)的形成，從而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)［40］（圖1）。

1.3 piRNA的作用機(jī)制

RNAi過(guò)程中，3種sncRNA均與Argonaute蛋白家族結(jié)合，Argonaute蛋白家族包括AGO和PIWI兩類亞家族，siRNA和miRNA與AGO亞家族結(jié)合，而piRNA則與PIWI亞家族結(jié)合［41，42］。piRNA途徑是動(dòng)物特有的，主要存在于動(dòng)物的生殖細(xì)胞中［43］。piRNA的具體作用機(jī)制尚未闡明，目前對(duì)piRNA的認(rèn)識(shí)尚處于初級(jí)階段。

基因間的重復(fù)序列、活躍的轉(zhuǎn)座子基因或piRNA基因簇轉(zhuǎn)錄得到的單鏈piRNA前體，經(jīng)具有核酸酶活性的PIWI蛋白加工，得到長(zhǎng)度約為24-32 nt的piRNA。與siRNA和miRNA不同，piRNA的生成不需要Dicer的參與。piRNA的生物合成涉及初級(jí)加工和次級(jí)加工兩條途徑。初級(jí)加工途徑產(chǎn)生初級(jí)piRNA，初級(jí)piRNA經(jīng)次級(jí)加工途徑（亦稱ping-pong循環(huán)）擴(kuò)增。初級(jí)加工及初級(jí)piRNA與PIWI蛋白的結(jié)合發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，但初級(jí)加工過(guò)程所需的因子尚未清楚。在ping-pong循環(huán)中，初級(jí)piRNA依次被PIWI蛋白MILI和MIWI2（即PIWIL2和PIWIL4）剪切其5'端，由此決定piRNA的5'端結(jié)構(gòu)，決定piRNA 3'端結(jié)構(gòu)的核酸酶目前未知［30，44］。piRNA可以通過(guò)直接剪切靶mRNA或者促進(jìn)異染色質(zhì)的形成等方式誘導(dǎo)基因沉默，從而在轉(zhuǎn)錄后水平或轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)［45，46］。

2 RNAi過(guò)程的關(guān)鍵因子

RNAi過(guò)程中有多個(gè)關(guān)鍵因子參與，其中最為重要的是Dicer、Argonaute蛋白家族和RdRP。

2.1 Dicer

Dicer是一個(gè)高度保守的ATP依賴的核酸內(nèi)切酶，隸屬于RNaseIII家族。在RNAi途徑中，siRNA和miRNA的生成依賴Dicer的剪切活性。Dicer的分子量在200 kD左右，具有4個(gè)特征結(jié)構(gòu)域，從N端到C端依次為DEXD/H解旋酶結(jié)構(gòu)域、PAZ結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)串聯(lián)的RNaseIII（RNaseIIIa和RNaseIIIb）結(jié)構(gòu)域及dsRBD結(jié)構(gòu)域，其中PAZ結(jié)構(gòu)域有助于識(shí)別底物，dsRBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合底物，DEXD/H解旋酶結(jié)構(gòu)域使底物解螺旋，RNaseIII結(jié)構(gòu)域則參與了底物的剪切。Dicer的作用底物為dsRNA，為了剪切dsRNA的兩條鏈，需要兩個(gè)Dicer共同起作用，形成二聚體。Dicer二聚體中含有4個(gè)復(fù)合的剪切活性中心（RNaseIII活性中心），但在剪切過(guò)程中，僅兩個(gè)活性中心發(fā)揮作用，另外兩個(gè)活性中心失活，因?yàn)閮蓚€(gè)活性中心間隔22 nt，因此Dicer剪切產(chǎn)生的siRNA和miRNA的長(zhǎng)度為22 nt。然而，Dicer結(jié)構(gòu)的微小改變會(huì)導(dǎo)致剪切活性中心間隔的變化，從而使得剪切產(chǎn)物的長(zhǎng)度略有差異［1，29，47］。

2.2 Argonaute蛋白家族

Argonaute是RNAi過(guò)程中的核心組分，siRNA、miRNA或piRNA錨定在Argonaute上引導(dǎo)Argonaute作用于靶基因，從而引發(fā)靶基因沉默。Argonaute蛋白家族包括AGO和PIWI兩類亞家族。AGO亞家族在各組織中均表達(dá)，它與siRNA或miRNA結(jié)合，主要通過(guò)影響mRNA的穩(wěn)定或抑制翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。PIWI亞家族主要在動(dòng)物的生殖細(xì)胞中表達(dá)，它與piRNA一起作用誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子沉默［48-50］。Argonaute的分子量約為100 kD，具有PAZ和PIWI兩個(gè)特征結(jié)構(gòu)域。其中，PAZ結(jié)構(gòu)域與Dicer共享，能直接契合Dicer剪切形成的RNA 3'端突出2 nt；PIWI結(jié)構(gòu)域具有類似RNase H的催化核心結(jié)構(gòu)，能對(duì)靶mRNA進(jìn)行剪切，但在進(jìn)化過(guò)程中，部分Argonaute家族成員由于PIWI 結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列發(fā)生變化而使其喪失了原有的核酸內(nèi)切酶活性［21，51，52］。在人類的4個(gè)AGO蛋白（AGO1-4）中，僅AGO2具有剪切活性，但在果蠅中，所有的AGO蛋白和PIWI蛋白均具有剪切活性。除了PIWI結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的剪切，Argonaute還可與其他蛋白因子相互作用，通過(guò)誘導(dǎo)翻譯抑制、mRNA降解、異染色質(zhì)形成等方式沉默基因［30，53］。

2.3 RdRP

RdRP是RNAi信號(hào)擴(kuò)增的核心分子。它可以RISC釋放出的正義siRNA為引物，靶mRNA為模板，通過(guò)“下降PCR”的方式合成dsRNA；還可通過(guò)非引物依賴的方式，以一些異常的單鏈mRNA為模板合成dsRNA。這些dsRNA被加工成新的siRNA進(jìn)入RNAi循環(huán)，如此反復(fù)從而使RNAi效應(yīng)放大。參與RNAi的RdRP同系物存在于真菌、線蟲和植物中，目前還未在果蠅和哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)RdRP同系物，其體內(nèi)缺失的參與RNAi的RdRP同系物可由其他RdRP替代，如一些病毒RdRP的水平轉(zhuǎn)移。實(shí)際上，有證據(jù)表明果蠅和脊椎動(dòng)物中存在RdRP類似物，但是這些物質(zhì)是否參與及如何參與RNAi過(guò)程仍有待研究［1，29，54］。

3 RNAi的應(yīng)用

3.1 在基因功能研究中的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們完成了眾多生物的全基因組測(cè)序工作，對(duì)這些全基因組序列進(jìn)行基因功能分析相當(dāng)重要。通過(guò)RNAi特異沉默基因表達(dá)，比較基因沉默前后生物表型的變化，可以闡明基因的功能。與傳統(tǒng)的基因敲除手段相比，RNAi技術(shù)具有快速、高效、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)易等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究基因功能的強(qiáng)有力工具，在后基因組時(shí)代中發(fā)揮重要作用［55］。

Kimber等［56］利用RNAi技術(shù)沉默馬鈴薯白線蟲（Globodera pallida）的FMRF酰胺類多肽（FMRFamide-like peptides，F(xiàn)LP）基因發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯白線蟲的運(yùn)動(dòng)功能受到了阻礙，表明flp對(duì)馬鈴薯白線蟲的正常運(yùn)動(dòng)功能是必須的。Zhang等［57］鑒定了東亞飛蝗（Locusta migratoria manilensis）幾丁質(zhì)合成酶1基因（Chitin synthase 1 gene，LmCHS1）的2個(gè)可變剪接體LmCHS1A和LmCHS1B，并利用RNAi技術(shù)對(duì)它們的功能進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示注射LmCHS1、LmCHS1A和LmCHS1B dsRNA的幼蟲死亡率分別為95%、88%和51%，其中，注射LmCHS1A和LmCHS1 dsRNA的幼蟲表型相似，均表現(xiàn)為發(fā)育遲緩，蛻皮過(guò)程中舊角質(zhì)層無(wú)法脫離，蛻皮之后新的角質(zhì)層薄，后腿彎曲，無(wú)法行走，身體扭曲，而注射LmCHS1B dsRNA的幼蟲表皮褶皺，無(wú)法完成蛻皮，以上結(jié)果表明，LmCHS1的可變剪接體在東亞飛蝗的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。Dong等［58］克隆了番茄（Solanum lycopersicum）的MADS-box基因SlMADS1，為了進(jìn)一步探討SlMADS1的功能，他們利用RNAi技術(shù)沉默該基因發(fā)現(xiàn)，SlMADS1沉默的番茄果實(shí)成熟時(shí)間縮短，參與果實(shí)成熟的乙烯合成基因和乙烯應(yīng)答基因表達(dá)水平均上調(diào)，乙烯產(chǎn)量比野生型增加近2-4倍，這些結(jié)果提示SlMADS1是番茄果實(shí)成熟的重要負(fù)調(diào)控因子。

3.2 在信號(hào)傳導(dǎo)通路研究中的應(yīng)用

信號(hào)傳導(dǎo)是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNAi技術(shù)相結(jié)合可以方便確定信號(hào)傳導(dǎo)通路中各個(gè)基因的上下游關(guān)系［59］。Clemens等［60］用dsRNA干擾果蠅細(xì)胞系來(lái)研究胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路，得到的結(jié)果與已知胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路完全一致，表明RNAi技術(shù)可用于分析復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路。轉(zhuǎn)染是研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的傳統(tǒng)方法，但該方法具有重組蛋白非生理聚集及轉(zhuǎn)染效率不高的缺點(diǎn)，RNAi技術(shù)克服上述缺點(diǎn)，并且具有簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，是研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的有力手段［59］。

3.3 在疾病治療中的應(yīng)用

RNAi技術(shù)能高效、特異地下調(diào)靶基因的表達(dá)，是一種十分有前景的疾病治療方法。與其他治療方法相比，RNAi治療效果持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，使得治療費(fèi)用降低，且治療所需的sncRNA劑量小，降低或消除了不良反應(yīng)的發(fā)生。目前，基于RNAi的治療研究主要針對(duì)癌癥、病毒感染和眼部疾病等［10］。

polo樣激酶1（polo-like kinase 1，PLK1）和紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白（Kinesin spindle protein，KSP）是必要的細(xì)胞周期蛋白，與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。抑制PLK1和KSP的活性將誘導(dǎo)有絲分裂阻滯和癌細(xì)胞凋亡，因此，PLK1和KSP可以作為癌癥治療的靶點(diǎn)。研究者對(duì)靶向PLK1和KSP的siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾，并將修飾的siRNA通過(guò)靜脈注射到小鼠腫瘤模型中，結(jié)果顯示，siRNA有效沉默了靶基因，抑制了PLK1和KSP的生物學(xué)活性，引起廣泛的有絲分裂受阻和腫瘤細(xì)胞凋亡，從而有力抵抗了癌癥［61］。人類細(xì)小病毒B19（Human parvovirus B19，B19V）可引發(fā)急性和慢性心肌炎，并伴隨內(nèi)皮功能紊亂，目前還沒(méi)有治療B19V感染的有效方法。Brandt等［62］將靶向B19V結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因的短發(fā)卡RNA（Short hairpin RNA，shRNA）經(jīng)腺病毒載體介導(dǎo)進(jìn)入感染了B19V的UT7/Epo-S1細(xì)胞中，結(jié)果顯示，VP2的mRNA水平顯著降低，B19V的復(fù)制受到明顯抑制，提示靶向結(jié)構(gòu)B19-VP2基因的RNAi技術(shù)可用于治療B19V感染。艾滋病是一種嚴(yán)重威脅人類生命安全的傳染病，由人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）引起。HIV主要攻擊人體T淋巴細(xì)胞，破壞免疫系統(tǒng)，從而使人體感染各種疾病，最終導(dǎo)致艾滋病。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（Highly active antiretroviral therapy，HAART） 是治療艾滋病的常用方法，但該方法具有耐藥性等缺陷，因此仍然需要尋找更好的治療手段［63］。將靶向HIV-1 Nef 的siRNA導(dǎo)入人類T細(xì)胞中，有效抑制了細(xì)胞中HIV-1的復(fù)制，表明RNAi介導(dǎo)的基因療法是治療艾滋病的潛在手段，值得深入研究［64，65］。眼部因其具有局限的密閉空間，便于局部用藥，因此成為RNAi治療的理想靶器官［66］。整合素連接激酶（Integrin linked kinase，ILK）具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、分化、遷移和凋亡的作用。Zheng等［67］將靶向ILK的siRNA通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)進(jìn)入視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞后，細(xì)胞中ILK的mRNA和蛋白水平均顯著下降，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維減少，細(xì)胞遷移和細(xì)胞介導(dǎo)的凝膠收縮明顯受到抑制，這提示RNAi可以作為與Müller細(xì)胞分化相關(guān)的眼部纖維增生性疾病的治療新方法。

4 結(jié)語(yǔ)

RNAi技術(shù)具有高效、簡(jiǎn)捷、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是研究基因功能、信號(hào)傳導(dǎo)通路和治療疾病的有力工具，但目前仍存在一些無(wú)法完滿解決的問(wèn)題，如RNAi的詳盡作用機(jī)制，包括RISC的具體組分及各組分的結(jié)構(gòu)和功能、piRNA初級(jí)加工過(guò)程所需因子、決定piRNA 3'端結(jié)構(gòu)的核酸酶等都尚未清楚，以及RNAi應(yīng)用過(guò)程中存在的脫靶效應(yīng)［68］。相信隨著研究的不斷深入，這些問(wèn)題將逐漸得到解決，RNAi技術(shù)將更好地為人們所用。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Advances on RNAi Mechanism and Its Application

FENG Xiao-yan ZHANG Shu-zhen
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101）

RNA interference（RNAi）is a gene silencing phenomenon induced by small non-coding RNA（sncRNA），which is widely found in eukaryotes. RNAi has become the focus of biological research with some achievements since its discovery. In order to provide some references for the further study of RNAi，the mechanism of RNAi，the key factors involved in RNAi and the application of RNAi are reviewed in this paper.

RNAi；mechanism；dicer；argonaute protein family；RdRP

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.001

2016-10-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371687）

馮小艷，女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：植物分子育種；E-mail：fengxiaoyan@itbb.org.cn

張樹珍，女，博士，研究員，研究方向：甘蔗生物技術(shù)；E-mail：zhangshuzhen@itbb.org.cn