王智文陳海波宋福平郭淑元

（1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

蘇云金芽胞桿菌分泌蛋白的鑒定及分析

王智文1陳海波1宋福平2郭淑元1

（1. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

研究蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在生長發(fā)育過程中分泌蛋白的類型和含量，尤其是胞外蛋白酶，對于充分了解該菌的殺蟲機(jī)理、擴(kuò)大該菌的應(yīng)用具有重要意義。通過制備Bt_HD73過渡期（transition phase）的分泌蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行質(zhì)譜檢測并分析其分泌蛋白的種類、含量、功能和信號肽等。結(jié)果表明，Bt_HD73在過渡期初期有54種胞外蛋白質(zhì)，其中酶類最多，占所有分泌蛋白的66.30%，且主要為蛋白水解酶；毒力蛋白次之，占所有分泌蛋白的14.53%。在54種分泌蛋白中，發(fā)現(xiàn)27種含有經(jīng)典Sec型信號肽（Secretory signal peptide，Sec-type SP），信號肽的長度在24-40個氨基酸之間。因此，Bt_HD73產(chǎn)生分泌蛋白的能力較強(qiáng)，在過渡期可分泌大量酶類，尤其是蛋白水解酶。同時還建立了該菌株的信號肽庫，包括27種具有引導(dǎo)外源蛋白分泌潛力的信號肽。

蘇云金芽胞桿菌；分泌表達(dá)；分泌蛋白質(zhì)；胞外蛋白酶；信號肽

利用細(xì)菌生產(chǎn)重組蛋白方便快捷，然而，常用的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌（Escherichia coli）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）等不易將外源可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中，這不僅限制了產(chǎn)量，還增加了下游加工的時間和金錢成本［1］。此外，大腸桿菌的外膜中存在內(nèi)毒素脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）［2］，會引起發(fā)熱和休克，且從重組蛋白中除去細(xì)菌外毒素難度大，經(jīng)濟(jì)成本高，產(chǎn)品安全性低。因而內(nèi)毒素脂多糖的存在，限制了大腸桿菌在制藥、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用［3-5］。一些芽胞桿菌（Bacillus）具有生長速度快、分泌能力強(qiáng)、安全等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于科研、制藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［6］。近年來，利用芽胞桿菌，尤其是枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis，Bs）來分泌表達(dá)外源蛋白已經(jīng)取得了很多可喜的成就［7，8］，特別是用來產(chǎn)生一些有價值的酶類，如甲基對硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase，MPH）［9］、木聚糖水解酶（Xylanase）［10］、瓊膠酶（β-agarose）［11］、纖維素內(nèi)切酶（Cellulase）［12］、植酸酶（Phytase）［13］、甘露聚糖酶（β-mannanase）［14］、脂氧合酶（Lipoxygenase）［15］、聚半乳糖醛酸鹽裂解酶（Polygalacturonate lyase，PGL）［16］等。但遇到一些瓶頸問題，一方面，為避免分泌途徑和細(xì)胞壁合成受阻，細(xì)胞內(nèi)存在一系列質(zhì)量控制點；另一方面，細(xì)胞同時會產(chǎn)生一些蛋白水解酶，可能會降解目的蛋白［17，18］。這二者限制了外源蛋白分泌表達(dá)的產(chǎn)量。然而，目前仍然沒有簡便統(tǒng)一的策略來提高外源蛋白分泌表達(dá)的產(chǎn)量，多數(shù)情況下需要針對不同的目標(biāo)蛋白研究合適的特異的優(yōu)化方法［19］。因此，開發(fā)其他安全高效的分泌表達(dá)菌株，可能有效提高目前工業(yè)上產(chǎn)量受限的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，為分泌表達(dá)外源蛋白提供更多的候選宿主。

蘇云金芽胞桿菌在產(chǎn)生芽胞的同時可以產(chǎn)生具有殺蟲活性的晶體蛋白，是一種應(yīng)用廣泛的微生物殺蟲劑［20］。Bt作為一種革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁成分簡單，胞外蛋白分泌到培養(yǎng)基時無需穿過細(xì)胞壁外膜，是一種良好的分泌表達(dá)外源蛋白的候選宿主。李玉呈［21］在Bt_HD73中分泌表達(dá)煙草幾丁質(zhì)酶基因tchiB，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液上清的幾丁質(zhì)酶活性得到了提高。然而Bt本身分泌的蛋白水解酶可能會影響目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量。因此，要將Bt發(fā)展為新的分泌表達(dá)宿主，首先應(yīng)對其分泌蛋白組進(jìn)行研究，為后續(xù)敲除蛋白水解酶基因，構(gòu)建蘇云金芽胞桿菌分泌表達(dá)宿主奠定基礎(chǔ)。Bt_HD73的全基因組測序已于2013年完成［22］，為Bt分泌蛋白組的研究提供了重要依據(jù)。

本研究制備了Bt_HD73過渡期T1的胞外蛋白質(zhì)樣品，并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。經(jīng)分析比對確定其分泌蛋白的種類和含量，并重點分析其中的蛋白水解酶。同時，利用生物信息學(xué)網(wǎng)站分析這些分泌蛋白，建立Sec型信號肽庫。本研究旨為進(jìn)一步了解蘇云金芽胞桿菌分泌的胞外蛋白的情況提供了數(shù)據(jù)，對充分了解該菌與昆蟲的互作機(jī)理，進(jìn)一步擴(kuò)大該菌的應(yīng)用范圍提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki strain HD73野生型（Bt_HD73）由本實驗室保存。LB培養(yǎng)基相關(guān)試劑購自O(shè)xoid公司；30%丙烯酰胺、1 mol/L Tris-HCl、1.5 mol/L Tris-HCl等SDS-PAGE膠配制試劑購自Coolaber公司；尿素購自Sigma公司；2×蛋白上樣緩沖液購自艾德萊公司；電泳緩沖液相關(guān)試劑購自Amresco公司，Typsin酶購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 T0的確定 將過夜活化的Bt_HD73菌株1%轉(zhuǎn)接于100 mL（1 L錐形瓶）新鮮LB液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)，從0 h開始，每0.5 h測定OD600，繪制生長曲線，對數(shù)期與過渡期的轉(zhuǎn)折點記為T0，OD600約為2.6，從接種到T0的時間約為3.5 h。T0后1h記為T1，OD600約為3.2。

1.2.2 分泌蛋白樣品的制備 將過夜活化的Bt_ HD73菌株1%轉(zhuǎn)接于100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)至T1。離心取胞外上清，并用0.2 μm無菌濾器過濾除菌2次，60%硫酸銨沉淀4 h后，用8 mol/L尿素溶解沉淀。最后用超濾濃縮管將樣品濃縮為100-200 μL。

1.2.3 分泌蛋白樣品的電泳及膠內(nèi)酶解 將樣品分別上樣于兩塊SDS-PAGE膠，一塊進(jìn)行常規(guī)電泳、染色、脫色、觀察；另一塊SDS-PAGE膠在樣品剛進(jìn)入分離膠約8 min后停止電泳，根據(jù)預(yù)染蛋白Maker的指示，于15 kD和25 kD之間切膠，以除去培養(yǎng)基中的干擾肽段。而后將此膠塊切成1 mm3左右的小塊，用50%乙腈/100 mmol/L NH4HCO3（pH 8.0）浸洗3次，抽干后，將膠塊浸于10 mmol/L二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）/50 mmol/L NH4HCO3（pH 8.0）中，56℃溫育1 h后吸去浸液，將膠塊浸于55 mmol/L碘乙酰胺（Iodoacetamide，IAM）/50 mmol/L NH4HCO3（pH 8.0）中，室溫下暗室溫育30 min后吸去浸液，依次用10 mmol/L NH4HCO3和乙腈浸洗2次，每次10 min，真空抽干后加入適量10 ng/μL的Typsin酶，孵育至酶液被膠塊吸收，加入足量10 mmol/L NH4HCO3，37℃溫育過夜，加入等體積的60%乙腈/5%甲酸，超聲振蕩10 min，離心后收集上清，并將上清真空抽干，最終溶解于50%乙腈中，待質(zhì)譜檢測。

1.2.4 質(zhì)譜鑒定 高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀配置：液相色譜體系為EASY-nLCTM1200（Thermo，USA）；質(zhì)譜儀為Orbitrap Fusion Lumos（Thermo，USA，配備納噴離子源）。

色譜條件：毛細(xì)管液相色譜柱Acclaim PepMap 100 C18（75 μm ID*25 cm，3 μm填 料 ）（Thermo，USA）；流動相A溶液為0.1%甲酸，B溶液為0.1%甲酸與100%乙腈混合溶液，所用梯度為95 min內(nèi)流動相B由5%升高至22%，然后16 min內(nèi)流動相B由22%升高至32%，最終5 min內(nèi)由32%升至95%，整個過程在120 min內(nèi)完成；流速為250 nL/min；進(jìn)樣體積為2 μL（1 μg）。

質(zhì)譜條件：采用數(shù)據(jù)依賴性采集技術(shù)（Datadependent acquisition）；噴霧電壓為2.2 kV；檢測方式為正離子；質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍為350-2 000。

1.2.5 蛋白質(zhì)鑒定 數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 2.0軟件搜庫鑒定。搜索引擎：SEQUEST HT；數(shù)據(jù)庫：HD73本地化數(shù)據(jù)庫；蛋白酶：trypsin（full）；最大漏切位點：1；母離子質(zhì)量精度：10 ppm；子離子質(zhì)量精度：0.2 Da；固定修飾：Carbamidomethyl（C + 57.021 Da）；可變修飾：Deamidated（N + 0.984 Da），Oxidation（M + 15.995 Da）。搜庫結(jié)果使用Percolator卡值（FDR 1%）。輸出結(jié)果中，emPAI值表征蛋白的含量。

1.2.6 信號肽分析 在生物信息學(xué)網(wǎng)站SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）中輸入蛋白質(zhì)序列，預(yù)測該蛋白是否含有經(jīng)典的Sec型信號肽及其信號肽的長度［23］。

2 結(jié)果

2.1 Bt_HD73分泌蛋白質(zhì)的提取、鑒定和分析

制備Bt_HD73 T1時期的分泌蛋白質(zhì)樣品并進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果（圖1）顯示，Bt在T1時期可以分泌豐富的胞外蛋白質(zhì)。預(yù)實驗中直接對制備好的分泌蛋白質(zhì)液態(tài)樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測，發(fā)現(xiàn)其中含有酪蛋白的干擾，大小約為20 kD，因而改進(jìn)實驗方法，采用電泳切膠方式，除去干擾肽段，而后再質(zhì)譜檢測，從而有效地解決了這一問題。結(jié)果（表1）表明，共檢測到54種HD73分泌蛋白。根據(jù)NCBI中的注釋，將這些分泌蛋白分為7個大類，包括酶類、毒力蛋白、各類結(jié)合蛋白、鞭毛相關(guān)蛋白、噬菌體相關(guān)蛋白、其他功能蛋白及功能未知蛋白。

圖1 Bt_HD73 T1時期分泌蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖

Bt_HD73 T1時期的分泌蛋白中共檢測到33個酶類（圖2），含量占分泌蛋白總量的66.30%，其中包括19個水解酶類、10個氧化還原酶類及4個轉(zhuǎn)移酶類，含量分別為47.06%、15.00%、4.25%；除酶類外，種類較多的為毒力蛋白，共檢測到7個，含量占分泌蛋白總量的14.53%。此外，還包括5個結(jié)合蛋白、3個鞭毛相關(guān)蛋白、1個噬菌體相關(guān)蛋白、2個其他功能蛋白以及3個功能未知蛋白。

蛋白水解酶屬于水解酶類，可以水解蛋白中的肽鏈。結(jié)果（圖3）表明，Bt_HD73 T1時期共檢測到9種胞外蛋白水解酶，占所有分泌蛋白總量的25.07%、所有分泌酶類的37.82%。其中HD73_2118（peptidase P60）最多，占胞外蛋白水 解 酶 的48.31%，HD73_5638（peptidase M24）、HD73_0744（peptidase M6）、HD73_1513（peptidase

M6）次之，分別為16.13%、13.84%和12.58%。此外，HD73_5406（bacillolysin）、HD73_2986（peptidase M6）、HD73_2161（peptidase）、HD73_5219（leucyl aminopeptidase）、HD73_5768（aminopeptidase）這5種蛋白水解酶也有少量分泌。

表1 Bt_HD73 T1時期的分泌蛋白質(zhì)的種類及其含量

A：分泌蛋白的種類數(shù)；B：各類分泌蛋白的含量比例

圖3 Bt_HD73 T1時期分泌蛋白酶的含量

2.2 Bt_HD73分泌蛋白質(zhì)信號肽庫的建立

根據(jù)NCBI中Bt_HD73的蛋白質(zhì)序列［22］，利用SignalP 4.1分析預(yù)測所有質(zhì)譜檢測到的分泌蛋白，共發(fā)現(xiàn)27個蛋白含有經(jīng)典的Sec型信號肽（表2），其長度在24-40個氨基酸之間。

3 討論

Gohar等［24］于2005年制備了Bt 407無晶體突變株在LB培養(yǎng)基中T2時期的胞外蛋白樣品，質(zhì)譜檢測后以蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus，Bc）ATCC14579菌株的基因組數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出36個Bt胞外蛋白。本研究以Bt_HD73基因組數(shù)據(jù)庫對質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行檢索，檢索結(jié)果更為準(zhǔn)確，共鑒定出54個Bt胞外蛋白，其中14個蛋白與Gohar等鑒定的蛋白相似性在95%以上，其他為本研究中新檢測到的蛋白，胞外蛋白種類更加豐富。此外，本研究還對胞外蛋白的含量作了進(jìn)一步分析，結(jié)果表明，Bt在過渡期初期產(chǎn)生的胞外蛋白質(zhì)中大部分為酶類，尤其是水解酶類，這可能與水解利用營養(yǎng)物質(zhì)，以滿足細(xì)菌快速生長的需求相關(guān)。

Bt細(xì)胞壁由肽聚糖和磷壁酸構(gòu)成，這與大腸桿菌細(xì)胞壁有明顯的差別，后者層次多且成分復(fù)雜。由于Bt沒有脂多糖外膜，產(chǎn)物更容易分泌到培養(yǎng)基之中，且加工過程避免了內(nèi)毒素、核酸等的污染。此外，從培養(yǎng)基中純化目標(biāo)產(chǎn)物大大降低了下游成本［25］，且分泌蛋白不易形成包涵體，通常保持著生物活性形式［26］。因此，可以嘗試?yán)肂t分泌表達(dá)外源蛋白。但是由于Bt可以分泌一些蛋白水解酶，可能造成外源蛋白的降解，因而對這類蛋白作進(jìn)一步分析。結(jié)果表明，在過渡期T1時期，Bt胞外蛋白中約25%為蛋白水解酶類，其中HD73_2118最多，HD73_5638、HD73_0744、HD73_1513次之。經(jīng)BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）分析比對，蠟樣芽胞桿菌的EntFM（CwpFM）蛋白（GenBank：AAX14641.1）與HD73_2118相似性為100%，與HD73_5638相似性為46%。EntFM是一種細(xì)胞壁肽酶，含有特征性結(jié)構(gòu)域NlpC/P60，與細(xì)菌運動性、形狀、毒力相關(guān)，參與Bc黏附到上皮細(xì)胞和生物膜的形成過程，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的空泡化［27］。HD73_0744和HD73_1513是M6家族的金屬蛋白酶，該家族功能未知，但其特征性結(jié)構(gòu)域Peptidase_M6一般存在于InhA中，InhA可以特異性地切割宿主抗菌蛋白［28，29］。因而，HD73_0744和HD73_1513可能在侵染宿主過程中發(fā)揮一定的作用。在構(gòu)建蘇云金芽胞桿菌分泌表達(dá)宿主時，可敲除這些蛋白水解酶基因，尤其是要敲除編碼HD73_2118和HD73_5638、HD73_0744、HD73_1513的基因，以免對目標(biāo)蛋白產(chǎn)生降解作用，同時可減少背景蛋白的表達(dá)，更利于下游的純化。

表2 Bt_HD73 T1時期分泌蛋白質(zhì)的Sec型信號肽

除酶類外，種類較豐富的還有毒力蛋白，它是細(xì)菌毒性的最直接體現(xiàn)。有些毒力蛋白靶向作用于細(xì)胞表面，如針對免疫系統(tǒng)和細(xì)胞表面分子的毒素、使細(xì)胞膜形成孔道的細(xì)胞膜破壞毒素以及殺蟲毒素等；而有些毒力蛋白則靶向作用于胞內(nèi)物質(zhì)，如影響蛋白質(zhì)合成、信號傳導(dǎo)、胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運等［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，在過渡期早期Bt胞外存在的毒力蛋白有溶血素、腸毒素、細(xì)胞毒素和蜂房毒素等，它們可能參與和宿主的相互作用。此外，各類結(jié)合蛋白中，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白HD73_3189（chitin-binding protein）的分泌量最大。

分泌蛋白質(zhì)在胞內(nèi)合成，而后運輸?shù)桨獍l(fā)揮作用，這一現(xiàn)象貫穿細(xì)胞整個生命過程。大多數(shù)胞外蛋白首先被合成為蛋白質(zhì)前體，并在氨基端帶有信號肽。大多數(shù)細(xì)菌胞外蛋白通過高度保守的Sec途徑運輸?shù)桨猓?1］。信號肽可以引導(dǎo)蛋白質(zhì)的定位和跨膜轉(zhuǎn)運，當(dāng)?shù)鞍淄瓿赊D(zhuǎn)運后，信號肽才被移除［32］。因而，信號肽對蛋白質(zhì)的高效分泌至關(guān)重要，可以保證蛋白的活性和穩(wěn)定性，尤其對于一些酶類來說，活性和穩(wěn)定性是發(fā)揮生物催化必不可少的條件。Brockmeier等［33］以角質(zhì)酶和酯酶作為分泌表達(dá)外源蛋白的報告基因，分析了Bs中所有Sec型信號肽對二者的分泌的影響，發(fā)現(xiàn)對角質(zhì)酶分泌效率最高的信號肽對酯酶的分泌效率卻很低，反之亦然，表明了信號肽與分泌的成熟蛋白間組合的重要性。這一結(jié)果強(qiáng)調(diào)了對于不同目標(biāo)蛋白的分泌表達(dá)，需要確定其最優(yōu)信號肽。2016年，Zhang等［10］的研究結(jié)果也證實了這一結(jié)論。因此，信號肽庫是提高分泌表達(dá)效率的一個重要工具。本研究建立了含27種經(jīng)典的Sec型信號肽的Bt信號肽庫，為優(yōu)化分泌表達(dá)、提高分泌效率奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生分泌蛋白的能力較強(qiáng)，在過渡期T1時有50多種胞外蛋白質(zhì)，且大部分為酶類，其次為毒力蛋白。其中，蛋白水解酶含量較多，尤 其 是HD73_2118和HD73_5638、HD73_0744、HD73_1513，可能會降解外源蛋白，因而構(gòu)建Bt分泌表達(dá)宿主時可對其進(jìn)行敲除。此外，建立了Bt_ HD73 T1時期分泌蛋白質(zhì)的Sec型信號肽庫，包括27種具有引導(dǎo)外源蛋白分泌潛力的信號肽。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Identification and Analysis of Secretory Proteins in Bacillus thuringiensis

WANG Zhi-wen1CHEN Hai-bo1SONG Fu-ping2GUO Shu-yuan1
（1. School of Life Sciences，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081；2. Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

The study on Bacillus thuringiensis（Bt）secretory protein types and their contents，especially the extracellular proteases，is of great significance for fully understanding the insecticidal mechanism and expanding the application of this bacterium. In our research，the secretory protein samples in the transition phase of Bt_HD73 were detected by mass spectrometry，then the types，contents，functions and signal peptides of secretory proteins were analyzed. The results showed that Bt_HD73 secreted 54 kinds of extracellular proteins in transition phase，and most of them were enzymes，accounting for 66.30% of all secretory proteins. Moreover，most of the enzymes were proteases，and the followed was virulence protein，accounting for 14.53% of all secretory proteins. Among the 54 secretory proteins，27 proteins were found to contain the classic Sec-type signal peptides，and the lengths were between 24 and 40 amino acid residues. Therefore，Bt_HD73 has a strong secretory ability，and it can secrete large amounts of enzymes especially proteases in the transition phase. Concurrently，the signal peptide library of this strain was established in this study，including 27 signal peptides with potential for guiding the secretion of heterologous proteins.

Bacillus thuringiensis；secretory expression；extracellular protease；secretory protein；signal peptide

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.022

2016-10-19

國家自然科學(xué)基金項目（31540088）

王智文，女，碩士，研究方向：蘇云金芽胞桿菌的分泌表達(dá)研究；E-mail：zhiwen_w@yeah.net

郭淑元，女，博士，教授，研究方向：微生物與宿主間作用的分子基礎(chǔ)及微生物應(yīng)用；E-mail：guosy@bit.edu.cn