馮璐 王玉國 溫銀元 趙娟 劉圓 任建宏 賀美林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷030801）

納米碳對離體培養(yǎng)條件下幾種植物生長及分化的影響

馮璐 王玉國 溫銀元 趙娟 劉圓 任建宏 賀美林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷030801）

以食用百合、紅掌、大花蕙蘭及金昌棗的組培苗為材料，研究不同濃度的納米碳對幾種植物外植體生長及分化的影響。結(jié)果表明，MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.2 mg/L+納米碳0.10 g/L，促進(jìn)百合鱗莖增殖，當(dāng)納米碳為0.50 g/L時有利于百合苗的生長及生根；MS+6-BA 1.5 mg/L +IBA 0.2 mg/L+納米碳0.04-0.06 g/L適用于紅掌腋芽外植體愈傷組織誘導(dǎo)和分化，誘導(dǎo)率達(dá)90%以上，分化率達(dá)97%；加入納米碳1.0-2.0 g/L時能夠明顯抑制大花蕙蘭原球莖繼代培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象；MS+6-BA 1.5 mg/L +IBA 0.5 mg/L +納米碳0.05 g/L，利于金昌棗芽增殖，當(dāng)納米碳為0.15 g/L時，芽長勢健壯。

納米碳；組織培養(yǎng)；增殖；褐化

隨著20世紀(jì)后期新型納米技術(shù)的迅速興起，納米材料越來越被廣泛的應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中［1，2］。納米碳是一種具有宏觀量子隧道效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)及高表面能小尺度效應(yīng)的納米材料，與其他納米材料相比，尤其是納米金屬材料，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且碳元素廣泛存在于生物圈，因此對環(huán)境的潛在危害較?。?，4］。目前已有研究表明，納米碳在影響生物代謝、促進(jìn)作物生長發(fā)育等方面具有良好的作用［5］，如可以提高植物根系活力，增強植物抗氧化能力，改善作物品質(zhì)，增加作物產(chǎn)量等［6-8］。對于納米碳的研究及應(yīng)用主要集中在其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特性及改良土壤、促進(jìn)作物吸水吸肥、增產(chǎn)等，但其對植物的生理作用、分子機制及在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用研究較少。Khodakovskaya和Dervishi等［9］將番茄種子接入含納米碳10-40 mg/L的MS培養(yǎng)基中可提高種子萌發(fā)率，同時納米碳能夠穿透種皮，促進(jìn)種子內(nèi)部水分的吸收，影響種子萌發(fā)和幼苗的生長；王佳奇等［10］、Tiwari等［11］研究了玉米的種子和幼苗在含納米碳的培養(yǎng)基中生長，發(fā)現(xiàn)納米碳可促進(jìn)種子萌發(fā)及根系的生長，提高玉米幼苗對水分及礦質(zhì)元素的吸收。從這些研究中可以看出，目前納米碳在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用還處于起步階段，其對愈傷組織誘導(dǎo)、細(xì)胞培養(yǎng)、芽分化、繼代、生根等植物組織培養(yǎng)中關(guān)鍵步驟［12］的影響目前未見報道。本研究主要考察納米碳濃度對幾種植物組培苗的外植體增殖、分化及生長的影響，以獲得納米碳作用不同外植體繼代培養(yǎng)的最適濃度，旨為提高植物組培快繁的效率及進(jìn)一步研究納米碳在植物離體培養(yǎng)條件下的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

納米碳（C＞90%，粒徑40-80 nm，山西華農(nóng)納米科技有限公司）。6-BA（6-芐基腺嘌呤）；NAA（萘乙酸）。食用百合（Lilium brownii var. viridulum）、紅掌（Anthurium andraeanum）、大花蕙蘭（Cymbidium）及金昌棗（Zizyphus jujuba Mill）的組培苗由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物組織培養(yǎng)實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 食用百合的培養(yǎng) 選擇大小基本一致的食用百合鱗莖，將其接入MS+6-BA 0.8 mg/L +NAA 0.2 mg/L中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，待新的小鱗莖芽長至3-4 cm時，將其分為單株轉(zhuǎn)接到含納米碳（0、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00和2.00 g/L）的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。共7個處理，每個處理6瓶，每瓶接入單株6株，重復(fù)3次。定期觀察，40 d后統(tǒng)計鱗莖增殖系數(shù)、生根率及生根數(shù)等。鱗莖增殖系數(shù)=（增殖鱗莖總數(shù)-接種鱗莖數(shù)）/接種鱗莖數(shù)；生根率=（生根株數(shù)/接種株數(shù)）×100%。

1.2.2 紅掌的培養(yǎng) 將紅掌的組培苗葉片接種在誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L 2,4-D上培養(yǎng)，不定芽長至1 cm左右時，將其轉(zhuǎn)入MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。上述獲得的不定芽，選擇中間部位含一個腋芽1 cm左右的外植體，將其接入含納米碳（0、0.01、0.02、0.04、0.06和0.10 g/L）的MS+1.5mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA的誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。共6個處理，每個處理6瓶，每瓶7個外植體，重復(fù)3次。定期觀察，40 d后統(tǒng)計紅掌的愈傷誘導(dǎo)率，觀察其生長情況；120 d后統(tǒng)計外植體的平均芽分化數(shù)及不定芽分化率。愈傷誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；不定芽分化率（%）=分化不定芽的愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織塊數(shù)×100%。

1.2.3 大花蕙蘭的培養(yǎng) 以大小基本一致的大花蕙蘭原球莖作為外植體，將其接入MS+4 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，待新的原球莖芽長至2-3 cm時，將其分為單株轉(zhuǎn)接到含納米碳（0、0.30、0.50、0.70、1.00和2.00 g/L）的培養(yǎng)基中。共6個處理，每個處理6瓶，每瓶接入4個外植體，重復(fù)3次。每隔7 d定期觀察，40 d后記錄大花蕙蘭的增殖系數(shù)、褐化率。褐化率（%）=褐化的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.4 金昌棗的培養(yǎng) 將金昌棗的組培苗莖尖作為外植體，接種于MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA的培養(yǎng)基中繼代增殖，待叢生芽長至1.5 cm左右時，取莖尖部位轉(zhuǎn)接到含納米碳（0、0.025、0.05、0.075、0.10、0.125和0.15 g/L）的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。共7個處理，每個處理6瓶，每瓶接入7個外植體，重復(fù)3次。每隔30 d定期觀察，記錄金昌棗叢生芽的芽長、增殖系數(shù)及生長情況。

1.3 培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖30.0 g/L（除金昌棗的繼代增殖培養(yǎng)基含蔗糖40.0 g/L外），瓊脂5.0 g/L，pH6.0，121℃高溫滅菌20 min。光照強度30-40 μmol/（m2·s）（除紅掌腋芽誘導(dǎo)的光照強度12-13 μmol/（m2·s）外），光照時間14 h/d，溫度（25±2）℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2007和DPS 7.5數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較分析（Duncan法）。

2 結(jié)果

2.1 納米碳對食用百合生長及增殖的影響

以食用百合的鱗莖為外植體進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，由表1可知，隨著納米碳濃度的增加，對百合鱗莖的增殖、生根呈現(xiàn)不同的影響（圖1-A，1-B，1-C）。未添加納米碳的鱗莖增殖系數(shù)比添加0.10 g/L納米碳減少0.66，而生根率低僅5.56%，且隨著納米碳濃度的繼續(xù)增加，鱗莖增殖系數(shù)降低，不利于百合鱗莖增殖；當(dāng)加入0.75 g/L納米碳時，百合苗生根率增加至94%以上，而增殖系數(shù)低僅0.50，隨著納米碳濃度的增加，百合苗生根率增高，有利于苗的生長。當(dāng)納米碳濃度為0.50 g/L時，與對照相比，鱗莖增殖系數(shù)差異不顯著；而百合苗根長、生根數(shù)較其他處理效果明顯，且生根率達(dá)91.67%，苗長勢健壯。這說明納米碳影響百合鱗莖的分化及生長，低劑量的納米碳促進(jìn)百合鱗莖增殖，高劑量的納米碳利于百合苗的生長及生根，添加一定濃度的納米碳可提高百合苗的質(zhì)量，延長繼代周期。

表1 納米碳對食用百合增殖及生長的影響

2.2 納米碳對紅掌誘導(dǎo)和分化的影響

以紅掌的腋芽為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)，腋芽基部（接觸培養(yǎng)基部位）在10 d左右開始膨大，40 d可見緊密、嫩綠的愈傷，培養(yǎng)80 d愈傷組織黃綠色緊密并開始分化。由表2可知，隨著納米碳濃度的增加，愈傷誘導(dǎo)率提高，尤其是含納米碳0.04 g/L的培養(yǎng)基誘導(dǎo)率比對照高14.28%。培養(yǎng)120 d，愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽（圖1-D，1-E，1-F），隨著納米碳濃度的增加，不定芽分化數(shù)、不定芽分化率均有增加。當(dāng)納米碳濃度為0.04-0.06 g/L時，平均芽分化數(shù)高達(dá)20個以上，不定芽分化率達(dá)97%左右。這說明在紅掌的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中添加一定濃度的納米碳，有利于愈傷誘導(dǎo)和不定芽分化。

表2 納米碳對紅掌誘導(dǎo)和分化的影響

2.3 納米碳對大花蕙蘭褐化的影響

以大花蕙蘭的原球莖為外植體進(jìn)行繼代培養(yǎng)，由表3可知，隨著納米碳濃度的增加，大花蕙蘭的增殖系數(shù)處理間無顯著差異，但褐化率明顯降低。未添加納米碳的培養(yǎng)基中大花蕙蘭褐化嚴(yán)重達(dá)100%（圖1-G），當(dāng)添加納米碳0.70-1.00 g/L時，增殖系數(shù)增加0.12以上，褐化率降低80%-95%，苗長勢良好（圖1-H），有利于大花蕙蘭繼代增殖培養(yǎng)。當(dāng)納米碳濃度為2.00 g/L時，大花蕙蘭的增殖系數(shù)與對照相比僅減少0.09，且培養(yǎng)基中無褐化現(xiàn)象（圖1-I），有利于苗的生長。這說明添加納米碳可抑制大花蕙蘭在植物組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的褐化現(xiàn)象，高劑量的納米碳有利于大花蕙蘭原球莖的生長，且不影響其繼代增殖。

表3 納米碳對大花蕙蘭褐化的影響

2.4 納米碳對金昌棗芽增殖的影響

以金昌棗的莖尖為外植體進(jìn)行繼代增殖，由表4可知，隨著納米碳濃度的增加，金昌棗叢生芽的平均芽長呈先增高后降低的趨勢，芽增殖系數(shù)先增加后下降。培養(yǎng)60 d后，納米碳濃度為0.075 g/L的增殖培養(yǎng)基比未添加納米碳的培養(yǎng)基平均芽長增加0.38 cm，增殖系數(shù)差異不顯著；納米碳濃度在0.10-0.15 g/L時，增殖系數(shù)降低，平均芽長略有降低，但從生芽長勢健壯。當(dāng)納米碳濃度為0.05 g/L時，金昌棗叢生芽的平均芽長增加，增殖系數(shù)最佳可達(dá)5.74，有利于繼代增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)90 d后（圖1-J，1-K，1-L），含0.05 g/L納米碳的培養(yǎng)基叢生芽增殖系數(shù)最佳達(dá)9.76，但玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重；含0.125-0.15 g/L納米碳的培養(yǎng)基芽長勢健壯，未出現(xiàn)玻璃化。這說明添加一定濃度的納米碳可促進(jìn)金昌棗芽的繼代增殖，低劑量的納米碳有利于增殖培養(yǎng)，高劑量的納米碳抑制增殖，但可提高芽的質(zhì)量。

3 討論

在植物組織培養(yǎng)過程中，需遵循植物的生長規(guī)律，進(jìn)而對細(xì)胞、組織、器官等外植體的生長發(fā)育進(jìn)行改進(jìn)，調(diào)節(jié)外植體的脫分化、再分化過程，促進(jìn)次生代謝物的產(chǎn)生，防止組培苗的玻璃化、褐化及菌類污染等［12，13］。Khodakovskaya等［9］利用高倍率透射電子顯微鏡觀察番茄幼苗的根系發(fā)現(xiàn)納米碳能進(jìn)入植物根系，并提高根系的吸水吸肥能力；Liu等［14］研究發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管能穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入煙草細(xì)胞，且可作為分子轉(zhuǎn)運載體進(jìn)入細(xì)胞，同時能夠?qū)⒉煌奈镔|(zhì)傳遞到不同植物細(xì)胞器中。本實驗研究結(jié)果表明，百合鱗莖繼代增殖培養(yǎng)過程中添加納米碳0.10 g/L時，促進(jìn)百合鱗莖增殖，添加納米碳0.50 g/L時，提高百合苗生根率，促進(jìn)生長；對紅掌的腋芽進(jìn)行誘導(dǎo)分化時，添加0.04-0.06 g/L的納米碳有利于愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽的產(chǎn)生；金昌棗莖尖繼代增殖培養(yǎng)時，加入納米碳0.05 g/L時，芽增殖系數(shù)增加，加入納米碳0.15 g/L時，芽長勢健壯，增殖系數(shù)明顯降低。這說明低劑量的納米碳有利于組培苗的繼代增殖，促進(jìn)擴繁；高劑量的納米碳抑制其增殖，但能促進(jìn)組培苗的生長且長勢健壯，延長繼代周期。這些現(xiàn)象可能是納米碳進(jìn)入植物內(nèi)部，影響植物內(nèi)部的代謝水平；也可能是納米碳進(jìn)入細(xì)胞影響某些基因的表達(dá)，進(jìn)而影響植株的生長與發(fā)育，這有待進(jìn)一步研究證實。

表4 納米碳對金昌棗增殖及生長的影響

此外，本研究也表明，金昌棗莖尖繼代增殖培養(yǎng)90 d后，含低劑量納米碳（0.025-0.075 g/L）的培養(yǎng)基叢生芽玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，含高劑量納米碳的培養(yǎng)基未出現(xiàn)此現(xiàn)象；大花蕙蘭原球莖繼代增殖培養(yǎng)中，未添加納米碳時褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，添加納米碳1.00-2.00 g/L能夠抑制其褐化現(xiàn)象，且不影響繼代增殖。由于玻璃化、褐化現(xiàn)象均受激素水平的影響，尤其是細(xì)胞分裂素、生長素，如高濃度的細(xì)胞分裂素會促進(jìn)使玻璃化現(xiàn)象，細(xì)胞分裂素與生長素比例失調(diào)也會導(dǎo)致玻璃化現(xiàn)象［15］。這說明納米碳可調(diào)節(jié)外源激素的平衡和利用效率，從而改善植物分化及生長的進(jìn)程，同時能提高培養(yǎng)基中其他有機、無機營養(yǎng)物質(zhì)的利用率。

圖1 利用含不同濃度納米碳的培養(yǎng)基培養(yǎng)幾種植物組培苗的不同外植體

4 結(jié)論

本研究通過添加不同濃度的納米碳培養(yǎng)幾種植物的不同外植體，表明納米碳對植物組培苗具有一定的影響及應(yīng)用價值，低劑量的納米碳可促進(jìn)增殖，有利于繼代擴繁；高劑量的納米碳使組培苗健壯且促進(jìn)生長，可防止玻璃化、褐化現(xiàn)象，延長繼代周期，提高苗的成活率。

［1］Iijima S. Helical microtubules of graphitic carbon［J］. Nature, 1991, 354（6348）：56-58.

［2］呂金榜, 周蓓蓓, 王全九. 地表下納米碳混合層對土壤入滲過程的影響［J］. 水土保持學(xué)報, 2016, 30（2）：126-130.

［3］梅龍偉, 張振華, 丁開和. 單壁碳納米管電子輸運特性的穩(wěn)定性分析［J］. 物理學(xué)報, 2009, 58（3）：1971-1979.

［4］韓紅梅, 邱介山, 周穎, 等. 碳納米管的制備及其熱穩(wěn)定勝和表面性質(zhì)的研究［J］. 炭素技術(shù), 2001（4）：5-9.

［5］馬辰. 納米碳對玉米養(yǎng)分利用及產(chǎn)量的影響［D］. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

［6］武美燕, 蒿若超, 田小海, 等. 添加納米碳緩釋肥料對超級雜交稻產(chǎn)量和氮肥利用率的影響［J］. 雜交水稻, 2010, 4：86-90.

［7］梁太波, 蔡憲杰, 過偉民, 等. 納米碳用量對烤煙生長發(fā)育和鉀素吸收積累的影響［J］. 煙草科技, 2011（11）：61-65.

［8］Fan IL, Wang YH, Shao XW, et al. Effects of combined nitrogen fertilizer and nano-carbon application on yield and nitrogen use of rice grown on saline-alkali soil［J］. Food, Agriculture and Environment（JFAE）, 2012, 10（1）：558-562.

［9］Khodakovskaya M, Dervishi E, et al. Carbon nanotubes are able to penetrate plant seed coat and dramatically affect seed germination and plant growth［J］. Acs Nano, 2009, 10：3221-3227.

［10］王佳奇, 李麗鶴, 孟令波, 等. 納米碳對玉米種子萌發(fā)及根系形態(tài)的影響［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2013, 29（18）：62-66.

［11］ Tiwari DK, Dasgupta-Schubert N, et al. Interfacing carbon nanotubes（CNT）with plants：enhancement of growth, water and ionic nutrient uptake in maize（Zea mays）and implications for nanoagriculture［J］. Applied Nanoscience, 2013, 5：577-591.

［12］呂冬梅, 袁媛, 詹志來. 藥用植物大規(guī)模組織培養(yǎng)的相關(guān)問題探討［J］. 中國中藥雜志, 2014, 39（17）：3413-3415.

［13］高國訓(xùn). 植物組織培養(yǎng)中的褐變問題［J］. 植物生理學(xué)報, 1999（6）：501-506.

［14］Liu Q, Chen B, Wang Q, et al. Carbon nanotubes as molecular transporters for walled plant cells［J］. Nano Letters, 2009, 9：1007-1010.

［15］邵龍珠, 趙淑君, 王淑榮, 等. 植物組織培養(yǎng)中的常見問題與解決技術(shù)措施［J］. 林業(yè)勘查設(shè)計, 2012（1）：49-51.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Effects of Nano Carbon on the Growth and Differentiation of Several Plants in Vitro Culture

FENG Lu WANG Yu-guo WEN Yin-yuan ZHAO Juan LIU Yuan REN Jian-hong HE Mei-lin
（College of Agriculture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801）

This work is to study the effects of different concentrations of nano carbon on growth and differentiation of several plants’explants. The test tube seedling of edible lily，Anthurium andraeanum，Cymbidium hybridum，and Jinchang jujube as experimental material was cultured on MS medium with different concentrations of nano carbon. Results showed that，MS + 6-BA 0.8 mg/L + NAA 0.2 mg/L + nano carbon 0.10 g/L was conducive to the multiplication of lily bulb with the multiplication coefficient 2.11；when the concentration of nano carbon was 0.50 g/L，the growth and rooting of lily in vitro was significantly better. The optimal medium for induction and differentiation of Anthurium ‘s axillary buds was MS+ 6-BA 1.5 mg/L + IBA 0.2 mg/L + nano carbon 0.04 to 0.06 g/L，the induction rate was over 90% and the differentiation rate was 97%. The addition of nano carbon 1.0 to 2.0 g/L obviously inhibited the browning of C. hybridum protocorm subculture. The optimal medium for the multiplication cultivation of Jinchang jujube was MS + 6-BA 1.5 mg/L + IBA 0.5 mg/L + nano carbon 0.05 g/L，the multiplication coefficient reached 9.76；bud growth was robust when the concentration of nano carbon was 0.15 g/L.

nano carbon；tissue culture；multiplication；browning

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.021

2016-09-09

山西省財政廳科技成果轉(zhuǎn)化項目（K4714197）

馮璐，女，碩士，研究生，研究方向：植物生理與分子生物學(xué)；E-mail：fl930321@163.com

王玉國，男，教授，研究方向：植物生理與分子生物學(xué)；E-mail：tgwygn@126.com