趙佳黃靜陳哲聶園軍梁宏

（1. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，太原 030031）

西瓜枯萎病拮抗菌Lh-1的鑒定及生物防治效果研究

趙佳1黃靜1陳哲1聶園軍2梁宏1

（1. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，太原 030031）

對(duì)菌株Lh-1進(jìn)行鑒定，并對(duì)其防治西瓜枯萎病的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化檢測(cè)和16S rRNA基因同源性分析鑒定菌株Lh-1，測(cè)定其抑菌譜。設(shè)計(jì)盆栽試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)施用有機(jī)肥加Lh-1菌液（T2），施用有機(jī)肥（T1）和化肥（CK）3種處理的防治效果。結(jié)果顯示，將Lh-1鑒定為解淀粉芽胞桿菌。該菌對(duì)多種植物病原菌都有抑制作用具有廣譜抗菌活性，尤其對(duì)西瓜枯萎病有良好的防治效果。盆栽試驗(yàn)表明添加Lh-1后發(fā)病率僅為17.2%，與對(duì)照相比防治效果達(dá)到78.5%，植株高度、鮮重和干重指標(biāo)均為最高；瓜苗中的SOD、POD和CAT 活性顯著提高而MDA含量明顯下降；瓜苗根際的微生物區(qū)系中細(xì)菌與放線菌含量上升，真菌特別是尖孢鐮刀菌的數(shù)量下降，瓜苗根際微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)得到明顯改善。解淀粉芽胞桿菌Lh-1能夠防治西瓜枯萎病。

解淀粉芽胞桿菌；西瓜枯萎病；尖孢鐮刀菌；根際微生物區(qū)系

西瓜枯萎病是由西瓜?；图怄哏牭毒‵. oxysporum f. sp. niveum）侵染所引起的土傳性病害［1，2］，在西瓜種植過(guò)程中特別是連作條件下會(huì)大規(guī)模爆發(fā)，減產(chǎn)甚至絕收的情況時(shí)有發(fā)生，是西瓜產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的瓶頸［3，4］。利用農(nóng)藥防治植物病害帶來(lái)的污染和殘留問(wèn)題日益受到重視，而利用功能微生物進(jìn)行生物防治無(wú)污染，無(wú)殘留，綠色環(huán)保，是綜合防治植物病害的最有效措施［5-7］。王小慧等［8］篩選到一株類芽胞桿菌將其制成新型生物有機(jī)肥，西瓜枯萎病防治率達(dá)75%。吳洪生［9］篩選到一株哈茨木霉，將其有機(jī)肥（菜子餅發(fā)酵產(chǎn)物）混和處理，進(jìn)行溫室條件下西瓜枯萎病的防治實(shí)驗(yàn)，防治效果良好。

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心微生物研究室經(jīng)多年實(shí)驗(yàn)，從田間分離篩選到一株芽胞桿菌Lh-1。對(duì)菌株Lh-1進(jìn)行了鑒定和抑菌譜檢測(cè)。在溫室條件下進(jìn)行盆栽防治西瓜枯萎病試驗(yàn)并對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)評(píng)價(jià)，以期為菌株Lh-1的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試拮抗菌株 菌株Lh-1，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 供試病原菌株 西瓜枯萎病菌由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所提供；番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、大白菜黑腐病菌和辣椒炭疽病菌由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心提供。

1.1.3 供試土壤 試驗(yàn)所用土壤來(lái)自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽(yáng)基地（山西省晉中市）從未種植西瓜的地塊（上一季種植玉米）。

1.1.4 供試作物 西瓜種子為當(dāng)?shù)刂髁髌贩N“京欣”，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心西甜瓜研究室提供。

1.1.5 供試培養(yǎng)基、試劑與肥料 PDA 培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基與尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基配方見(jiàn)參考文獻(xiàn)［10］。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。有機(jī)肥由永濟(jì)市天力生物肥料制造有限公司提供（有機(jī)質(zhì)＞30%、N 54 g/kg、P2O549 g/kg和K2O 23 g/kg）。

1.2 方法

1.2.1 菌株Lh-1的鑒定 對(duì)菌株Lh-1進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化檢測(cè)，參考文獻(xiàn)［11］。

16S rRNA 基因的序列分析：用基因組DNA提取試劑盒提取菌株Lh-1的基因組DNA，以其為模板采用16S rDNA通用引物（24f）AGAGTTTGATCCTGGCTCAG與（1492r）TACGGYTACCTTGTTACGACTT擴(kuò)增16S rDNA基因片段［12］。PCR反應(yīng)采用25 μL體系：10×緩沖液2.5 μL；2 μL（25 mmol/L）MgCl2；4 μL（1.25 mmol/L）dNTP；2 μL（100 μmol/L）引物；0.4 μL（5 U/μL）Taq酶；DNA模板1 μL（0.05-1 μg/μL）；去離子水13.1 μL 。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min；50℃退火1 min； 72℃延伸3min，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增序列由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)定得到的16S rDNA的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)序列用Clustal X1.8進(jìn)行比對(duì)分析，并利用Mega4.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)［13，14］。

1.2.2 菌株Lh-1的抑菌譜測(cè)定 選擇西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、大白菜黑腐病菌和辣椒炭疽病菌作為指示病原菌，利用平板對(duì)峙培養(yǎng)法檢測(cè)菌株Lh-1的植物病原菌抑制能力。具體方法：將保藏的植物病原菌進(jìn)行活化并轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板上，用滅菌打孔器（直徑5 mm）在病原菌菌落邊緣打孔，菌片轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基平板中央，30℃靜置培養(yǎng)24 h，將菌株Lh-1點(diǎn)接在距離病菌片20 mm處，做4個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（不接種拮抗菌）。28℃靜置培養(yǎng)2 d，觀察拮抗效果，計(jì)算抑菌率［15］。

抑菌率（%）=（對(duì)照病原菌直徑-對(duì)峙拮抗菌的病原菌直徑）/對(duì)照病原菌直徑×100%

1.2.3 防治西瓜枯萎病盆栽實(shí)驗(yàn) 西瓜枯萎病菌F. oxysporum f. sp. niveum（FON）孢子懸液制備：將FON接種到PDA培養(yǎng)基平板上，30℃，培養(yǎng)5 d。在平板內(nèi)加入10 mL無(wú)菌水，然后收集保存孢子懸液，懸液中FON孢子終濃度為5×106CFU/mL［16］。Lh-1發(fā)酵液制備：向NA液體培養(yǎng)基中接種Lh-1，28℃，200 r/min搖床培養(yǎng)48 h，菌體濃度大于109CFU/mL。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：營(yíng)養(yǎng)缽育苗后移栽盆缽培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)缽裝土300 g，盆缽裝土10 kg，盆缽中按1%（V/W）的接菌量向土壤中接入FON孢子懸液（土壤終濃度＞104CFU/g）。設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)小區(qū)，試驗(yàn)組各小區(qū)隨機(jī)分布，每個(gè)小區(qū)20個(gè)重復(fù)：1）對(duì)照組（CK），向土壤中施入化肥；2）試驗(yàn)組1（T1）向土壤中施入有機(jī)肥；3）實(shí)驗(yàn)組2（T2）向土壤中施入有機(jī)肥，按1%（V/W）的接菌量向土壤中接入Lh-1發(fā)酵液。其中，有機(jī)肥按2%（W/W）的施肥量施入，CK中等量添加化肥，不足的部分以尿素、硫酸鉀及過(guò)磷酸鈣補(bǔ)足。每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中播種1粒西瓜種子，待瓜苗長(zhǎng)出3-4片真葉后移栽，常規(guī)管理進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)［17］。

1.2.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)測(cè)定 西瓜枯萎病病情的調(diào)查統(tǒng)計(jì)：從各小區(qū)出現(xiàn)第一株枯萎病株開(kāi)始，統(tǒng)計(jì)枯萎病的發(fā)病情況，西瓜移栽35 d后，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

發(fā)病率= 發(fā)病株數(shù)/總重復(fù)株數(shù)×100%

病情指數(shù)計(jì)算：0級(jí)為整株無(wú)癥狀；1級(jí)整株無(wú)變黃葉片；2級(jí)為1-2個(gè)葉片萎蔫；3級(jí)為全株＞1/3葉片萎蔫；4級(jí)為全株＞1/2葉片萎蔫；5級(jí)為全株＞3/4葉片萎蔫或死亡［18］。

DSI=Σ（病害等級(jí)×該級(jí)對(duì)應(yīng)植株數(shù)）/供試植株數(shù)

防治率=（對(duì)照組發(fā)病率-處理組發(fā)病率）/對(duì)照組發(fā)病率×100%

西瓜植株生物量及生理生化檢測(cè)：西瓜移栽35 d后，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選擇5株瓜苗，測(cè)定植株株高、鮮重及干重，其中干重測(cè)量方法為：105℃條件下殺青30 min，75℃條件下烘干至衡重。每株采集5片葉片測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量，方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［19］。

西瓜植株根際微生物區(qū)系調(diào)查：西瓜移栽35 d后，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選擇5株瓜苗根際土壤，混勻后4℃保存于自封袋內(nèi)運(yùn)回。采用梯度稀釋法，分別對(duì)樣品中的細(xì)菌、放線菌、真菌和尖孢鐮刀菌統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)［20］。

2 結(jié)果

2.1 菌株Lh-1的形態(tài)特征及生理生化特性

菌株Lh-1革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌體為桿狀，有鞭毛，具有運(yùn)動(dòng)性，好氧生長(zhǎng)，可形成內(nèi)生芽胞，在NA培養(yǎng)基上呈黃褐色不透明菌落，表面褶皺，邊緣不規(guī)則。菌株Lh-1的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 菌株Lh-1生理生化特性

2.2 菌株Lh-1 16S rDNA序列同源性的鑒定

經(jīng)測(cè)序分析菌株Lh-1的16S rDNA的序列長(zhǎng)度為1 490 bp。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，以16S rDNA序列同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1）。如圖所示，菌株Lh-1與解淀粉芽胞桿菌聚為一群，具有99%的相似性，綜合形態(tài)特征與生理生化特性分析，將菌株Lh-1鑒定為解淀粉芽胞桿菌。

2.3 菌株Lh-1的抑菌譜測(cè)定

利用平板對(duì)峙培養(yǎng)法檢測(cè)菌株Lh-1的植物病原菌抑制能力。結(jié)果（表2，圖2）顯示，解淀粉芽胞桿菌Lh-1對(duì)西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、大白菜黑腐病菌和辣椒炭疽病菌均具有抑制作用，說(shuō)明解淀粉芽胞桿菌Lh-1具有廣譜抗菌性能。

圖1 基于16S rDNA部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表2 解淀粉芽胞桿菌Lh-1的抑菌譜檢測(cè)結(jié)果

圖2 解淀粉芽胞桿菌Lh-1拮抗西瓜枯萎病菌

2.4 解淀粉芽胞桿菌Lh-1對(duì)西瓜枯萎病的防治效果

盆栽試驗(yàn)中，不同處理對(duì)西瓜枯萎病的防治情況如圖3所示。統(tǒng)計(jì)不同處理中西瓜枯萎病的發(fā)病率與病情指數(shù)可知（表4），與對(duì)照CK相比施加有機(jī)肥后瓜苗發(fā)病率（78.5%）沒(méi)有顯著降低，病情指數(shù)與CK相當(dāng)；而添加Lh-1的T2與CK相比瓜苗發(fā)病率僅為17.2%，病情指數(shù)下降3.6，防治效果高達(dá)78.5%。T2實(shí)驗(yàn)組能顯著降低西瓜枯萎病的發(fā)病率，防治效果突出。

圖3 不同處理對(duì)西瓜枯萎病的防治效果

表4 不同處理防治西瓜枯萎病效果

2.5 不同處理對(duì)瓜苗生物量的影響

不同處理對(duì)瓜苗生物量的影響顯著（表5）。由表可知，T2（添加Lh-1）的生長(zhǎng)情況最好，植株高度、鮮重和干重指標(biāo)均顯著高于CK；有機(jī)肥處理（T1）次之，但是除株高指標(biāo)外植株鮮重與干重與CK相比差別不大；而T2處理的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于T1。

表5 不同處理對(duì)西瓜生長(zhǎng)的影響

2.6 不同處理對(duì)瓜苗抗性相關(guān)酶的影響

盆栽結(jié)果顯示（表6），不同處理間瓜苗抗性相關(guān)酶的差異顯著。其中，SOD、POD和CAT 活性以T2最高，T1次之，CK最低；MDA含量以CK最高，T1與CK相比差別不大，T2明顯低于CK。 2.7 不同處理對(duì)瓜苗根際微生物區(qū)系的影響

盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示（表7），瓜苗移栽35 d后，T1與T2根際的細(xì)菌與放線菌數(shù)量與對(duì)照相比都有顯著提高，其中T1最高，T2次之；T2根際的真菌數(shù)量尤其是尖孢鐮刀菌數(shù)量明顯少于T1與CK，而T1與CK相比，差別不大。結(jié)果說(shuō)明，與對(duì)照相比添加Lh-1顯著改變了瓜苗根際的微生物區(qū)系組成，抑制了病原菌尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)。

3 討論

根際-土壤中生命活動(dòng)最為活躍的關(guān)鍵區(qū)域，是“土壤-植物”生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)和能量交換的界面，而根際微生物的活動(dòng)是“土壤-植物”物質(zhì)和能量循環(huán)的重要介質(zhì)［21］。西瓜枯萎病的爆發(fā)，正是由于尖孢鐮刀菌激增導(dǎo)致根際微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)失衡引起的。當(dāng)根際微生態(tài)區(qū)系結(jié)構(gòu)越合理，物種越豐富，多樣性越高時(shí)，植株抵御病害侵染的綜合能力就越強(qiáng)［22］。向根際中添加功能微生物可在一定程度上改善微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，增加有益微生物，抑制病原微生物，提高微生物群落多樣性，提高植物的抗病能力。

表6 不同處理對(duì)西瓜葉片SOD、POD、CAT 活性及MDA 含量的影響

表7 不同處理對(duì)西瓜根際土微生物數(shù)量的影響

本課題組經(jīng)多年試驗(yàn)篩選到一株對(duì)西瓜枯萎病菌具有強(qiáng)烈抑制作用的菌株Lh-1（抑菌率65.25%），經(jīng)鑒定為解淀粉芽胞桿菌，其在pH5-9，溫度15-50℃的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境要求不嚴(yán)苛。該菌對(duì)西瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、草莓灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、大白菜黑腐病菌和辣椒炭疽病菌等多種植物病原菌均有拮抗作用，具有廣譜抗菌活性。作為一種拮抗功能菌，解淀粉芽胞桿菌可以保護(hù)植株免受多種病原菌的侵染。張亮等［23］分離到一株解淀粉芽孢桿菌SR22，該菌具有桿菌溶素基因（bacA）和脂肽基因（srfAA）能有效拮抗番茄枯萎病。Jiang等［24］得到一株解淀粉芽胞桿菌，對(duì)細(xì)菌性果斑病有顯著防治效果。

解淀粉芽胞桿菌Lh-1對(duì)西瓜枯萎病的防治效果顯著。盆栽實(shí)驗(yàn)中，添加Lh-1后發(fā)病率僅為17.2%，與對(duì)照相比防治效果達(dá)到78.5%。解淀粉芽胞桿菌Lh-1對(duì)瓜苗的促生作用明顯，T2的植株高度、鮮重和干重指標(biāo)均為最高；許多文獻(xiàn)報(bào)道有機(jī)肥對(duì)西瓜等作物也有一定的促生作用［25，26］，但在本實(shí)驗(yàn)中，由于添加有機(jī)肥后T1的發(fā)病率（78.5%）和病情指數(shù)（4.5）與CK相比沒(méi)有明顯差異，發(fā)病情況較為嚴(yán)重導(dǎo)致在植株高度、鮮重和干重指標(biāo)上T1與CK沒(méi)有顯著差異。添加Lh-1后瓜苗中的SOD、POD和CAT 活性顯著提高而MDA含量明顯下降，說(shuō)明瓜苗的抗逆能力顯著增強(qiáng)。韋巧婕等［10］通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)也證明，施用芽孢桿菌B顯著提高黃瓜植株的生物量及其體內(nèi)SOD、POD 及CAT 的活性，植株系統(tǒng)抗性明顯提高。通過(guò)分析瓜苗根際的微生物區(qū)系可知，當(dāng)西瓜枯萎病爆發(fā)時(shí)，根際微生物區(qū)系中的真菌尤其是尖孢鐮刀菌顯著增加而細(xì)菌含量明顯下降（表7），根際微生物區(qū)系由“細(xì)菌型”向 “真菌型”轉(zhuǎn)變［27］；而添加Lh-1后細(xì)菌與放線菌含量上升，有效抑制了尖孢鐮刀菌的數(shù)量，瓜苗根際微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)得到明顯改善，植株抗病能力進(jìn)一步增強(qiáng)。Shen等［28］通過(guò)分析連續(xù)2年種植香蕉的根際土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)也得到相同結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究對(duì)菌株Lh-1進(jìn)行鑒定、測(cè)定了抑菌譜，并通過(guò)盆栽試驗(yàn)對(duì)其防治西瓜枯萎病的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明添加Lh-1后發(fā)病率僅為17.2%，與對(duì)照相比防治效果達(dá)到78.5%，植株高度、鮮重和干重指標(biāo)均為最高；瓜苗中的SOD、POD和CAT 活性顯著提高而MDA含量明顯下降；瓜苗根際的微生物區(qū)系中細(xì)菌與放線菌含量上升，真菌特別是尖孢鐮刀菌的數(shù)量下降，瓜苗根際微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)得到明顯改善。菌株Lh-1能夠有效防治西瓜枯萎病。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Identification and Biological Efficacy of Antagonistic Strain Lh-1 Suppress Watermelon Fusarium Wilt

ZHAO Jia1HUANG Jing1CHEN Zhe1NIE Yuan-jun2LIANG Hong1
（1.Biotechnology Research Center，Shanxi Provincial Academy of Agricultural Sciences；2. Institute of Agricultural Resource and Economic，Shanxi Provincial Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031）

Aims：Identify the strain Lh-1 and evaluate its capability to suppress watermelon Fusarium wilt. Methods：Test the morphological，physiological and 16S rRNA gene sequence characteristics of strain Lh-1. Detect its antagonistic spectrum. A pot experiment was designed to evaluate the effects of applying strain Lh-1 combined with organic fertilizer（T2），compared with an organic fertilizer（T1）and a chemical fertilizer（CK）. Results：the strain Lh-1 was identified as Bacillus amyloliquefaciens. It can suppress a variety of plant pathogens with a broad-spectrum antimicrobial activity，especially for F. oxysporum f. sp. niveum. Pot experiment showed that the disease incidence is only 17.2%，the control efficacy reached 78.5%，the SOD，POD and CAT activity increased significantly and the MDA content reduced obviously. The number of bacteria and actinomycetes increased but the number of fungi，especially Fusarium oxysporum decreased obviously in the rhizosphere microflora after Lh-1 treated. Conclusion：the application of the Bacillus amyloliquefaciens Lh-1 can suppressed watermelon Fusarium wilt.

B. Amyloliquefaciens；watermelon Fusarium wilt；F. Oxysporum；rhizosphere microflora

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.016

2016-09-21

山西省科技自主創(chuàng)新能力提升項(xiàng)目（2015zzcx-22），山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技攻關(guān)項(xiàng)目（YGG1414）

趙佳，男，碩士，助理研究員，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：zhaojia.00@163.com

梁宏，男，副研究員，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：815336057@qq.com