李亞楠趙潔張傲哲譚琰華茜張子劍

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，北京 100029）

核酸適配體的體外篩選方法的最新研究進(jìn)展

李亞楠1趙潔1張傲哲1譚琰1華茜1張子劍2

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，北京 100029）

核酸適配體是用配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）在體外篩選得到的一小段寡核苷酸序列，能夠選擇性的與不同的靶標(biāo)特異性的結(jié)合，包括蛋白質(zhì)、小分子、有機(jī)物、金屬離子、藥物等，具有高親和力和高特異性。這項技術(shù)的諸多優(yōu)勢，使其迅速得到重視，核酸適配體在生物傳感器、基因芯片、新藥開發(fā)、納米技術(shù)等諸多方面應(yīng)用廣泛。但是傳統(tǒng)的SELEX方法操作繁瑣，篩選周期長，需要幾個月的時間才能篩選出與靶標(biāo)具有高特異性的核酸適配體。隨著SELEX的快速發(fā)展，近年來出現(xiàn)了很多新型的篩選方法，這些新的方法大大提高了篩選周期，極大的提高了篩選效率，拓展了核酸適配體的應(yīng)用?？偨Y(jié)介紹了近三年來出現(xiàn)的幾種新型的核酸適配體的篩選方法，包括氧化石墨烯SELEX（Multiple GO-SELEX）、單壁碳納米管輔助細(xì)胞SELEX（SWCNTs-assisted cell-SELEX）、基于芯片的細(xì)胞SELEX（on-chip Cell-SELEX）、序列構(gòu)造SELEX（Sequence-constructive SELEX）、高保真SELEX（High-Fidelity SELEX），有助于人們進(jìn)一步了解、認(rèn)識核酸適配體篩選技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，更好促進(jìn)核酸適體在各個領(lǐng)域中的應(yīng)用前景。

核酸適配體；SELEX；篩選方法

核酸適配體是能夠與特定靶分子結(jié)合且具有高親和力和高特異性的寡核苷酸［1］。與抗體相比，核酸適配體具有很獨特特點［2］。第一核酸適配體高親和力和高特異性，核酸適配體與靶分子的結(jié)合力很強(qiáng)，對靶分子的結(jié)合具有很高的特異性，能夠識別分辨不同配基上的一個基團(tuán)差別，甚至能夠識別同一種蛋白分子不同構(gòu)象的不同功能狀態(tài)；第二靶分子范圍具有廣泛性，核酸適配體不僅能夠與蛋白質(zhì)、酶、生長因子、抗體等生物大分子結(jié)合，還能與金屬離子、核苷酸、氨基酸等小分子物質(zhì)特異性結(jié)合；第三容易修飾和標(biāo)記，核酸適配體能夠在體外通過化學(xué)合成的方法合成，可進(jìn)行特定的位點修飾，如酶、生物素、放射性同位素、生物素等；第四具有良好的穩(wěn)定性，核酸適配體本質(zhì)是核酸，對溫度、酸堿度、離子強(qiáng)度具有一定的耐受性，便于長期保存、運(yùn)輸和應(yīng)用，與抗體相比，具有更好的穩(wěn)定性。第五核酸適配體能夠通過聚合酶鏈反應(yīng)大量擴(kuò)增，一旦篩選得到特異性的核酸適配體，就可擴(kuò)增出更多純度很高的產(chǎn)物［3-5］。

典型的核酸適配體的篩選過程主要包括三個步驟：（1）結(jié)合：即靶標(biāo)與隨機(jī)寡核苷酸文庫孵育，形成核酸適配體-靶標(biāo)復(fù)合物。（2）分離：即通過特定的方法，如離心、濾膜過濾等分離結(jié)合靶標(biāo)和未結(jié)合靶標(biāo)的核酸適配體分離開。（3）擴(kuò)增：即對獲得的能與靶標(biāo)特異性結(jié)合的核酸適配體序列進(jìn)行擴(kuò)增，生成次級文庫，進(jìn)行下一輪的篩選［6，7］。

然而傳統(tǒng)的SELEX方法操作繁瑣，篩選周期長，需要幾個月的時間才能篩選出與靶標(biāo)具有特異性的核酸適配體［8］。隨著SELEX的快速發(fā)展，近年來出現(xiàn)了很多新型的篩選方法，這些新的方法大大提高了篩選周期和篩選效率，拓展了核酸適配體的應(yīng)用，如以提高核酸適配體選擇性為目的的篩選方法：反向篩選（counter SELEX）、消減篩選（subtractive SELEX）、光交聯(lián)篩選（photo SELEX）、負(fù)篩選（negative SELEX）；以提高核酸適配體普適性為目的的核酸適配體篩選方法：混合篩選（blended SELEX）、復(fù)合靶篩選（complex targets SELEX）、表達(dá)盒篩選（expression SELEX）、切換篩選（toggling SELEX）；以縮短篩選周期為目的的高效篩選方法：自動化篩選（automated SELEX）、不放大篩選（non-SELEX）、熒光磁珠篩選（FluMag SELEX）；不同結(jié)合庫相結(jié)合以增加目標(biāo)核酸適配體篩選機(jī)率的方法：加尾篩選（tailored SELEX）、基因篩選（genomic SELEX）等［4，6，9-14］。本文將介紹幾種近3年來發(fā)展的新的篩選方法，這不僅有助于人們進(jìn)步了解、認(rèn)識核酸適配體篩選技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，同時能更好地促進(jìn)核酸適配體在各個領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 氧化石墨烯SELEX（Multiple GO-SELEX）

氧化石墨烯（graphene oxide）是一種性能優(yōu)異的新型碳材料，具有較高的比表面積和表面豐富的官能團(tuán)，材料在多領(lǐng)域應(yīng)用范圍廣泛，近些年一直是一個研究熱點［15，16］。Multiple GO-SELEX方法正是采用石墨烯氧化物進(jìn)行篩選的一種簡單，快速，高通量的核酸適配體的篩選方法，有效地降低了篩選成本，縮短了SELEX的篩選時間。這是一種對蛋白質(zhì)，對病毒顆粒都適用的篩選方法。氧化石墨烯能夠與核酸適配體通過π-π鍵結(jié)合，但當(dāng)靶標(biāo)到GO表面上時，其與核酸適配體結(jié)合，結(jié)合后具有高親和力的單鏈DNA結(jié)構(gòu)就會被改變，在GO表面的π-π鍵被破壞后折疊成新的空間結(jié)構(gòu)，結(jié)果導(dǎo)致從GO表面釋放出來，而非特異性的核酸適配體仍然結(jié)合在GO表面，從而能夠快速有效的將特異性與非特異性核酸適配體分開。其篩選方法如圖1所示，篩選第一步首先先進(jìn)行反篩選，去除假陽性結(jié)合，然后加入氧化石墨烯進(jìn)行篩選。2014年，Nguyen等［17］第一次報道了這種Multiple GO-SELEX篩選方法，這種方法可以同時篩選多個靶標(biāo)的核酸適配體。他們利用此方法在3種農(nóng)藥中成功獲得的10種不同的單鏈DNA核酸適配體，其親和力在10-100 nmol/L的范圍內(nèi)。除了每個靶標(biāo)的核酸適配體外，他們發(fā)現(xiàn)了幾個靈活的多目標(biāo)核酸適配體，能與2個或3個不同的分子結(jié)合。這些能與多種靶標(biāo)結(jié)合的適體不但對小分子的快速結(jié)合有重要意義，而且也有利于核酸適配體生物傳感器的發(fā)展。Gu等［18］研究報道，用GO-SELEX篩選方法篩選出了能夠與岡田酸（okadaic acid，OA）特異性結(jié)合的核酸適配體，并將這種核酸適配體應(yīng)用于酶連適配體檢測（ELAA）方法中，該方法可用于檢測具有高靈敏度的特點，不僅可以用于檢測海產(chǎn)品中的岡田酸，還可能適用于其他小分子分析物的測定。隨著不斷地發(fā)展與提高，現(xiàn)如今，氧化石墨烯已經(jīng)成為核酸適配體領(lǐng)域研究的一個熱點。但是氧化石墨烯在生物效應(yīng)和安全性能方面的研究目前還是比較少，如果其運(yùn)用于生物體，是否會結(jié)合DNA等生物大分子，影響生物體正常的生理功能，這些問題仍需解決［19］。

圖1 氧化石墨烯SELEX篩選技術(shù)示意圖

2 單壁碳納米管輔助細(xì)胞SELEX（SWCNTsassisted cell-SELEX）

碳納米管作為一維納米材料，其廣闊的應(yīng)用前景不斷地被探索。單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）在生物醫(yī)學(xué)中已經(jīng)被廣泛研究，核酸、蛋白質(zhì)以及其他一些難溶性的含芳環(huán)藥物等能夠通過物理包埋和π-π吸附等方式加載到碳納米管表面［20，21］。單壁碳納米管輔助細(xì)胞SELEX這是一種采用單壁碳納米管輔助的細(xì)胞篩選方法，具有很高的篩選效率，能夠有效的縮短篩選周期，與普通Cell-SELEX相比，此法僅需6輪篩選，而傳統(tǒng)的Cell-SELEX需要15輪的篩選過程。傳統(tǒng)的Cell-SELEX方法采用簡單的洗脫方法來分離特異性與非特異性結(jié)合的核酸適配體，這種分離方法會導(dǎo)致分離不完全，而SWCNTs-assisted cell-SELEX這種方法能夠在單壁碳納米管輔助下，快速有效的將特異性與非特異性結(jié)合的核酸適配體分離開來。單鏈的DNA能夠通過π-π堆積力而成螺旋形的包裹在單壁碳納米管上，因此在分離這一步時加入單壁碳納米管。加入后，不能與靶分子結(jié)合的或者結(jié)合力較弱的核酸適配體都能夠吸附于納米管上，而特異性的核酸適配體由于與靶標(biāo)的特異性結(jié)合而仍然留在細(xì)胞表面，從而達(dá)到了有效的分離目的。2014年，Tan等［22］第一次報道了這種篩選方法，他們選用兩種鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）的細(xì)胞系CNE2細(xì)胞和HONE 細(xì)胞分別作為靶細(xì)胞和陰性對照的細(xì)胞，結(jié)果只用了六輪的篩選過程就篩選到了對CNE2細(xì)胞具有高特異性和高親和力的核酸適配體，這引起了關(guān)于鼻咽癌的臨床診斷和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的高度關(guān)注。同時，這種方法為癌癥分化和癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供了一個有效的工具。

3 基于芯片的細(xì)胞SELEX（on-chip Cell-SELEX）

以整個細(xì)胞作為靶標(biāo)來篩選出與其特異性結(jié)合的核酸適配體的技術(shù)稱為細(xì)胞SELEX（cell-SELEX）［23］。隨著核酸適配體在各個領(lǐng)域的普遍關(guān)注，核酸適配體在生物醫(yī)學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。on-chip Cell-SELEX這種篩選方法是在Cell-SELEX篩選方法基礎(chǔ)上發(fā)展改進(jìn)的一種更快速的篩選方法，在細(xì)胞篩選的基礎(chǔ)上，增加微流控芯片。這種篩選方式只需要5輪的篩選，這與傳統(tǒng)的篩選方法相比，大大的縮短了篩選過程。Hung等［24］用這種自動化的芯片SELEX篩選方法篩選得到了13種卵巢癌細(xì)胞（Ovarian cancer）的高特異性核酸適配體，其中3種核酸適配體與靶標(biāo)的解離常數(shù)達(dá)到1.8、8.3和1.3 nmol/L，這種篩選系統(tǒng)將來可能用于靶向治療和檢測。Hung等［25］用這種芯片細(xì)胞SELEX自動篩選系統(tǒng)成功的篩選出了8種結(jié)直腸癌細(xì)胞（CRCSC/CRC）的特異性核酸適配體，其中有3種具有很高的特異性，與靶標(biāo)的解離常數(shù)達(dá)到27.4、28.5 和12.3 nmol/L。

4 序列構(gòu)造SELEX（sequence-constructive SELEX）

序列構(gòu)造SELEX，這是一種通過在篩選過程中，對核酸適配體序列進(jìn)行一定修飾，從而使其提高對靶標(biāo)的親和力和特異性，這種篩選過程的分離步驟在被鏈霉親和素包被的磁珠的幫助下完成的。2014年，Wang等［26］報道了這種篩選方法。他們用這種新的階梯序列構(gòu)造的篩選方法用于Globo H（一種和腫瘤相關(guān)的表面抗原）篩選，并篩選出了對Globo H具有高親和力和高特異性的核酸適配體。篩選過程如圖2所示，每一步的篩選過程都包含7輪的篩選步驟。第一步篩選中起始的寡核苷酸文庫選擇了中間部分具有15個隨機(jī)核苷酸，兩端為固定序列，經(jīng)過7輪的篩選，得到了37種不同的寡核苷酸，對其與Globo H的親和力進(jìn)行測定后，選擇了4種特異性的親和力較高的寡核苷酸用于下1步的篩選。在第2步的篩選中，先將第1步得到的4種寡核苷酸分別用四種含有14個隨機(jī)序列的寡核苷酸進(jìn)行修飾，修飾后通過七輪的篩選得到高親和力的特異性核酸適配體用于第3輪的篩選。第3步的篩選過程同第2步的。經(jīng)過3輪篩選，將得到的適體進(jìn)行克隆，測序并對其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。分析發(fā)現(xiàn)，延長序列被修飾鹽延長后，其特異性顯著增加。但是這種篩選方法篩選周期長，每一步的篩選，都需要7輪篩選，因此這種方法的應(yīng)用還有待于進(jìn)一步研究與完善。

圖2 序列構(gòu)造SELEX方法示意圖

5 高保真SELEX（High-Fidelity SELEX）

高保真SELEX即Hi-Fi SELEX，這種篩選方式有3個主要的特點。第一，在篩選過程中引用了一種固定區(qū)封閉元件即互補(bǔ)序列，從而能增加起始文庫的功能多樣性，這是因為通常情況下，兩種常見的側(cè)翼序列會干擾核酸適配體的空間折疊和功能，從而降低了起始文庫的多樣性。第二，靶標(biāo)固定在涂有吸附鈍化的聚乙二醇和表面活性劑的微量滴定板上，大大增加了靶分子與核酸適配體結(jié)合特異性。這種化學(xué)修飾表面不僅大大的減少了非特異性結(jié)合，而且可以在核酸適配體和鄰近靶分子之間起到一個橋接的作用。第三，擴(kuò)增時用數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（dPCR）的方法，擴(kuò)增更具有特異性和準(zhǔn)確性，能夠?qū)崿F(xiàn)絕對定量。2015年，Ouellet等［27］首次報道了這種新的篩選方法，并用這種方法以凝血酶α、人因子 IXa、人因子X及人因子 D為靶標(biāo)篩選出其特異性核酸適配體。用這種方法篩選3輪之后，靶分子與核酸適配體間的解離常數(shù)（Kd）值就達(dá)到了nM水平。他們用Hi-Fi SELEX篩選體系確定了能夠抑制補(bǔ)體因子D的結(jié)構(gòu)相關(guān)的核酸適配體，其能夠抑制補(bǔ)體系統(tǒng)激活途徑中的旁路途徑，這有助于旁路途徑相關(guān)疾病的治療研究和發(fā)展。

6 展望

近年來，關(guān)于核酸適配體的篩選方法發(fā)展迅速，在很多領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用，隨著不斷地發(fā)展，研究者將很多新型的材料應(yīng)用于核酸適配體的篩選上，使得很多新的篩選技術(shù)不斷被發(fā)現(xiàn)、優(yōu)化和完善，從篩選速度、特異性、準(zhǔn)確性、高效性等各方面都不斷提高。從傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)，發(fā)展到光交聯(lián)篩選（photo SELEX）、自動化篩選（automated SELEX）、熒光磁珠篩選（FluMag SELEX）等新的篩選方法，再到本文介紹到的更優(yōu)化的篩選技術(shù)氧化石墨烯SELEX（Multiple GO-SELEX）、單壁碳納米管輔助細(xì)胞SELEX（SWCNTs-assisted cell-SELEX）、基于芯片的細(xì)胞SELEX（on-chip Cell-SELEX）、序列構(gòu)造SELEX（Sequence-constructive SELEX）、高保真SELEX（High-Fidelity SELEX）。如今，核酸適配體作為一種有效的工具，在化學(xué)生物學(xué)、分析化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、疾病診斷，疾病治療、藥物研發(fā)等研究中廣泛應(yīng)用。未來，核酸適配體不僅會在疾病治療和診斷上發(fā)揮重要的作用，而且會在基礎(chǔ)研究中扮演重要角色，為生物分子間相互作用和功能的研究帶來前所未有的準(zhǔn)確性。核酸適配體還有許多潛在的應(yīng)用有待發(fā)展，需要我們開闊自己的想象力，去不斷的探索與發(fā)現(xiàn)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

The Latest Progress on the Methods for in Vitro Screening Aptamers

LI Ya-nan1ZHAO Jie1ZHANG Ao-zhe1TAN Yan1HUA Qian1ZHANG Zi-jian2
（1. Basic Medical College，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029；2. Research Laboratory Center of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029）

Aptamers are single-stranded oligonucleotides that are screened by systematic evolution of ligands by exponential enrichment（SELEX）in vitro，which can selectively bind to different target with high affinity and high specificity，including protein，small molecules，organic compound，metal ions，drugs，etc. This technology has attracted more attentions for its advantages and thus it has been applied widely in many aspects such as biological sensor，gene chip，new drug development，nano technology，etc. However，the traditional SELEX method is cumbersome，which usually takes several months to screen out the target of nucleic acid in high specificity. With the rapid development of SELEX，many novel screening methods have emerged in recent years. The screening cycle and the screening efficiency are improved with these new methods，and the application of aptamers is expanded. This review introduces several new screening methods in recent three years，including multiple GO-SELEX，SWCNTs-assisted cell-SELEX，on-chip Cell-SELEX，Sequence-constructive SELEX and High-Fidelity（HI FI）SELEX，It is helpful for us to know more about the latest progress on the methods for in vitro screening aptamers and to promote the application of aptamers in various fields..

aptamer；SELEX；screening method

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.010

2016-09-09

國家自然科學(xué)基金項目（81403180）

李亞楠，女，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：18101297818@163.com

張子劍，男，助理研究員，研究方向：中藥藥理學(xué)；E-mail：zhangzijianqq1012@163.com