袁偉曦喻云梅胡春財(cái)趙祖國(guó)

（1. 廣東醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，湛江 524023；2. 解放軍第422中心醫(yī)院，湛江 524023）

CRISPR/Cas9技術(shù)存在的問(wèn)題及其改進(jìn)措施的研究進(jìn)展

袁偉曦1喻云梅2胡春財(cái)1趙祖國(guó)1

（1. 廣東醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，湛江 524023；2. 解放軍第422中心醫(yī)院，湛江 524023）

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種RNA引導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，能對(duì)基因進(jìn)行精確性敲除、敲入、替換等，從而實(shí)現(xiàn)探究基因功能、修復(fù)致病基因等目的。該技術(shù)憑借操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、可對(duì)基因位點(diǎn)進(jìn)行編輯、可拓展性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，在近幾年迅速發(fā)展完善，已成為繼鋅指核酸酶技術(shù)和類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)之后的第三大基因組編輯技術(shù)。在簡(jiǎn)單介紹CRISPR/ Cas9技術(shù)的作用機(jī)制后，主要針對(duì)該技術(shù)現(xiàn)階段面臨的精確修復(fù)比例低、PAM限制識(shí)別序列、脫靶現(xiàn)象、馬賽克現(xiàn)象的問(wèn)題以及相應(yīng)的改進(jìn)措施進(jìn)行闡述，旨在讓研究者客觀的認(rèn)識(shí)CRISPR/Cas9技術(shù)存在的不足之處，為合理使用或改進(jìn)該技術(shù)提供系統(tǒng)的文獻(xiàn)綜述。

CRISPR/Cas9；基因編輯；精確編輯；脫靶；馬賽克現(xiàn)象

目前基因編輯技術(shù)主要包括鋅指核酸酶技術(shù)（zinc finger nucleases，ZFNs）、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列）/Cas9（CRISPR-associatedprotein 9，CRISPR相關(guān)蛋白）技術(shù)。ZFNs技術(shù)和TALENs技術(shù)分別借助鋅指蛋白和類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物識(shí)別特異DNA，再利用FokⅠ核酸內(nèi)切酶切割靶目標(biāo)。CRISPR/Cas9技術(shù)依靠sgRNA識(shí)別序列，Cas9蛋白切割序列。雖然ZFNs技術(shù)和TALENs技術(shù)在基因、序列、細(xì)胞、物種限制和特異性方面比CRISPR/Cas9技術(shù)有優(yōu)勢(shì)，但隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的日趨完善，其優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯：（1）操作簡(jiǎn)單，設(shè)計(jì)靈活，價(jià)格低廉；（2）能實(shí)現(xiàn)多點(diǎn)編輯［1］；（3）可擴(kuò)展性更強(qiáng)，可與 piggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)［2］或Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)［3］等聯(lián)用。本文介紹CRISPR/Cas9技術(shù)及其作用機(jī)制，主要針對(duì)該技術(shù)目前存在的問(wèn)題及相應(yīng)的改進(jìn)措施進(jìn)行綜述，為合理使用或改進(jìn)該技術(shù)提供思路。

1 CRISPR/Cas9簡(jiǎn)介

CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物特有的一種天然免疫系統(tǒng)，用于抵抗病毒或外源性質(zhì)粒的侵害［4］。根據(jù)Cas蛋白的特點(diǎn)，可將CRISPR /Cas系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)需要借助復(fù)雜的蛋白復(fù)合體發(fā)揮作用，而Ⅱ型系統(tǒng)僅借助Cas9蛋白和導(dǎo)向RNA（guide RNA，gRNA）即可對(duì)靶目標(biāo)進(jìn)行編輯，結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單且易于操作，因此目前基因編輯中使用的主要是Ⅱ型化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes，Sp）CRISPR/Cas9系統(tǒng)（圖1）。

2 CRISPR/Cas9作用機(jī)制

圖1 CRISPR/Cas9技術(shù)原理圖

CRISPR/Cas9主要由兩部分組成：gRNA和Cas9蛋白。gRNA由CRISPR RNA（crRNA）與反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）組成，crRNA的一部分序列能與tracrRNA配對(duì)，形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)；一部分序列與靶目標(biāo)互補(bǔ)區(qū)域，以此識(shí)別靶序列。tracr RNA不僅可穩(wěn)定crRNA，還可參與Cas9蛋白與DNA的結(jié)合與切割［5］?；蚓庉嫊r(shí)可使用單獨(dú)的crRNA和tracr RNA，也可使用二者嵌合而成的單鏈向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA），單獨(dú)的Cas9蛋白是一個(gè)二葉片結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)葉片為核酸酶葉片，包括HNH結(jié)構(gòu)域、RuvC結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域；另一個(gè)葉片由α螺旋結(jié)構(gòu)域組成［6］。Cas9蛋白先與gRNA形成復(fù)合體，使Cas9蛋白構(gòu)象變化，產(chǎn)生一條通道，使其更易與DNA結(jié)合［7］。該復(fù)合體隨機(jī)碰撞DNA，若未識(shí)別到PAM序列，則會(huì)快速離開(kāi)DNA，發(fā)生下一次碰撞［8］；若識(shí)別PAM序列，Cas9蛋白的Arg1333和Arg1335會(huì)與二核苷酸鳥(niǎo)嘌呤結(jié)合，此時(shí)，Ser1109和Lys1107形成磷酸鎖（phosphate lock）結(jié)構(gòu)，與PAM序列旁的+1位核苷酸發(fā)生相互作用，促使雙鏈DNA解旋，利用RNA-DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，核對(duì)序列與crRNA的互補(bǔ)情況［9］，若在種子序列出現(xiàn)較多錯(cuò)配，則序列識(shí)別過(guò)程終止，從而確保Cas9在正確的目標(biāo)處發(fā)揮作用。若完成對(duì)靶序列的識(shí)別，則可激活HNH結(jié)構(gòu)域，使其發(fā)生構(gòu)象改變，目標(biāo)鏈進(jìn)入其活性位點(diǎn)。蛋白和核酸的相互作用，使非目標(biāo)鏈進(jìn)入RuvC結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)中［10］，使Cas9蛋白對(duì)目標(biāo)鏈和非目標(biāo)鏈進(jìn)行切割作用，從而完成基因編輯。

3 CRISPR/Cas9存在的問(wèn)題及其改進(jìn)方法

3.1 精確修復(fù)比例低

CRISPR/Cas9切斷基因組雙鏈DNA后，斷裂處的修復(fù)方式主要是非同源末端連接（non-homologous End Joining，NHEJ）［11］，這是一種錯(cuò)誤率極高的修復(fù)方式，讀框移碼的插入或刪除，導(dǎo)致基因功能喪失；而能在目標(biāo)位點(diǎn)精確插入期望序列的修復(fù)方式—同源介導(dǎo)的雙鏈DNA修復(fù)（homology directed repair，HDR）所占比例常不足10%［12-14］（圖2）。CRISPR/ Cas9技術(shù)若要成為基因治療的手段之一，必須實(shí)現(xiàn)精確定點(diǎn)編輯。研究表明，可通過(guò)抑制NHEJ修復(fù)或者增強(qiáng)HDR修復(fù)來(lái)提高精確修復(fù)的效率。

圖2 雙鏈斷裂DNA修復(fù)原理圖

NHEJ修復(fù)主要借助Ku蛋白和DNA連接酶Ⅳ實(shí)現(xiàn)，而Scr7以DNA連接酶Ⅳ的DNA結(jié)合域?yàn)榘袠?biāo)，降低其與雙鏈斷裂的結(jié)合能力，從而抑制NHEJ修復(fù)。研究表明，將Scr7與CRISPR/Cas9系統(tǒng)共同作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞和小鼠，可大幅降低NHEJ修復(fù)，將精確編輯的效率提高數(shù)倍，甚至十幾倍［15-17］。

而直接增強(qiáng)HDR修復(fù)以提高精確編輯的方法主要有調(diào)控細(xì)胞周期、引入外源性DNA、化學(xué)修飾sgRNA或小分子激活HDR等。NHEJ修復(fù)雖然可貫穿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期，但其在G1期占主要地位，而HDR主要在S期和G2期發(fā)揮作用。因此對(duì)阻滯在G2/M期的細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，可大幅提高精確編輯的效率。研究表明，利用藥物將細(xì)胞周期同步化在G2/M期，可將精確編輯的數(shù)量增加數(shù)倍［18，19］。Cas9從雙鏈斷裂DNA上解離的過(guò)程是緩慢的，在完全解離之前，Cas9先釋放非目標(biāo)鏈的3'端，這使得非目標(biāo)鏈更容易接受與其互補(bǔ)的外源性單鏈DNA，從而激活HDR修復(fù)。研究者通過(guò)導(dǎo)入一條與先釋放的非目標(biāo)鏈互補(bǔ)的單鏈DNA，可將HDR修復(fù)的比例提高至60%［20］。對(duì)sgRNA進(jìn)行化學(xué)修飾也是一種有效可行的方法。研究表明，以2'-O-methyl（M）、2'-O-methyl 3'phosphorothioate（MS） 或 2'-O-methyl 3'thioPACE（MSP）修飾sgRNA，可增大HDR修復(fù)比例，若進(jìn)一步增加修飾sgRNA的數(shù)量，精確編輯效率最高可達(dá)83.3%［21］。這一現(xiàn)象可能是由于這些化學(xué)基團(tuán)可增加sgRNA在血清中的穩(wěn)定性和改變核苷酸的免疫刺激能力。還有研究者在對(duì)小分子進(jìn)行高通量掃描后，篩選出能提高HDR比例的2種小分子—β3腎上腺素受體激動(dòng)劑L755507和胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑布雷非德菌素A［22］。

此外，利用胞嘧啶核苷脫氨酶［23］或堿基修飾酶APOBEC1［24］修飾Cas9蛋白，可實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)核苷酸的精確編輯。雖然實(shí)現(xiàn)單個(gè)核苷酸編輯使CRISPR/Cas9技術(shù)的精確編輯發(fā)生質(zhì)的飛躍，但是目前僅限于將胞嘧啶更換為胸腺嘧啶。遺傳性疾病的基因突變種類(lèi)繁多，僅一種核苷酸的替換尚不能滿(mǎn)足其要求，在日后的研究中，可繼續(xù)改造CRISPR/Cas9系統(tǒng)，以期能實(shí)現(xiàn)對(duì)核苷酸的精確隨意替換。

3.2 PAM識(shí)別序列的限制

前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）是一個(gè)位于靶DNA 3'端的短核苷酸基序，可被Cas9蛋白特異性識(shí)別?；撔枣溓蚓勺R(shí)別標(biāo)準(zhǔn)PAM NGG和非標(biāo)準(zhǔn)PAM NAG。理論上，生物基因組中NGG每隔8 bp堿基出現(xiàn)一次；NRG則每4 bp堿基出現(xiàn)一次。但由于不同基因序列上的差異，并非所有的基因都能有合適的PAM。分析玉米的全基因組，在有注釋的外顯子中僅30%能找到特異性切割位點(diǎn)［25］。這表明，PAM在一定程度上限制了Cas9剪切位點(diǎn)的選擇。為了減弱PAM對(duì)Cas9蛋白的限制，可對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行改造和使用Cas9直系同源酶。

有學(xué)者主張改造Cas9蛋白，擴(kuò)大其PAM的識(shí)別范圍。化膿性鏈球菌Cas9突變體VQR（D1135V/ R1335Q/T1337R）識(shí)別的PAM為NGAN和NGCG，突 變 體 VRER（D1135V/G1218R/R1335E/T1337R）識(shí)別的PAM為NGC，突變體D1135E特異性識(shí)別NGG，突變體QQR1特異性識(shí)別NAAG［26］。這些變更了識(shí)別PAM的突變體，無(wú)疑擴(kuò)大靶位點(diǎn)的選擇。而研究也證實(shí)，這些突變體可以在野生型SpCas9無(wú)法找到編輯序列的斑馬魚(yú)和人類(lèi)內(nèi)源性基因位點(diǎn)中，找到合適的編輯位點(diǎn)［27］。

也有學(xué)者主張利用Cas9直系同源酶減弱PAM對(duì)Cas9蛋白靶位點(diǎn)的限制。目前通過(guò)序列比對(duì)等方法發(fā)現(xiàn)Cas9的直系同源酶已超過(guò)1 000種［28］，但已確定PAM序列的Cas9直系同源酶僅有弗朗西絲菌（PAM為NGG）［29］、金黃色葡萄球菌（PAM為NGGRRT）［30］、腦膜炎雙球菌（PAM為NNNNGATT）［31］、嗜熱鏈球菌CRISPR1（PAM為NAAGAAW）［32］、嗜熱鏈球菌CRISPR3（PAM為NGGNG）［33］等少數(shù)幾種。這意味著Cas9直系同源酶是一個(gè)巨大的侯選庫(kù)，可以用于克服化膿性鏈球菌Cas9在一些物種應(yīng)用上的局限性。為了充分利用Cas9直系同源酶，研究者不僅利用生物信息學(xué)與PAM文庫(kù)結(jié)合的方法確定更多Cas9直系同源酶的PAM序列［34］，而且對(duì)已知PAM序列的Cas9直系同源酶加以改造。研究表明，弗朗西絲菌和金黃色葡萄球菌的突變體能將靶向范圍擴(kuò)大2-4倍［35，36］。

此外，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了靶向RNA的C2c2蛋白［37］，這無(wú)疑將進(jìn)一步擴(kuò)大CRISPR/Cas技術(shù)的應(yīng)用范圍。

3.3 脫靶現(xiàn)象

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)依靠sgRNA的識(shí)別序列與靶向序列特異性結(jié)合。由于基因組極為復(fù)雜，sgRNA可能與其他非靶向序列局部匹配，這種局部匹配也會(huì)激活Cas9內(nèi)切酶活性，從而產(chǎn)生脫靶（圖3）。此外，Cas9不僅識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)PAM，也可識(shí)別非標(biāo)準(zhǔn)PAM，設(shè)計(jì)靶向序列時(shí)忽略了非標(biāo)準(zhǔn)PAM，這也可能會(huì)引起一定程度的脫靶。脫靶可能影響正常基因的功能表達(dá)，甚至激活致癌因子、抑制抑癌基因，造成安全隱患。目前主要通過(guò)改造Cas9蛋白和優(yōu)化sgRNA兩方面降低脫靶現(xiàn)象。

改造Cas9蛋白以提高特異性的方法主要分為以下幾類(lèi)：（1）使Cas9蛋白的核酸內(nèi)切酶活性降低或喪失。無(wú)論是使用降低HNH或RuvC結(jié)構(gòu)域功能的突變體H840A和D10A［38］，或是構(gòu)建使Cas9蛋白喪失核酸內(nèi)切酶活性，僅保留其核酸識(shí)別能力，借助其他核酸內(nèi)切酶實(shí)現(xiàn)基因編輯的CRISPRi［39］和FokⅠ-dCas9［40，41］，這兩種方法均根據(jù)Cas9蛋白能被一定錯(cuò)配范圍內(nèi)的非靶向序列激活，從而發(fā)揮切割作用這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)，使其核酸內(nèi)切酶活性降低或喪失，一定程度上可提高激活Cas9所需要的序列匹配度，從而大幅提高特異性。（2）降低Cas9蛋白結(jié)合DNA的能力。對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行定點(diǎn)突變形成eSpCas9［42］和SpCas9-HF1［43］，突變體減弱了Cas9蛋白與DNA的非特異性結(jié)合的能力，增強(qiáng)靶向序列與Cas9蛋白結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)力。（3）調(diào)控Cas9蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)量。通過(guò)使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子［44］、插入4-HT依賴(lài)的內(nèi)含肽［45］等方法構(gòu)建誘導(dǎo)型Cas9蛋白，減少基因組暴露于Cas9與sgRNA復(fù)合體的時(shí)間，即Cas9與非靶向序列的結(jié)合概率，進(jìn)而降低脫靶率。（4）增強(qiáng)Cas9蛋白對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PAM序列的識(shí)別能力。突變體D1135E［27］對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PAM的識(shí)別更加特異，從而降低因識(shí)別非標(biāo)準(zhǔn)PAM序列而引起脫靶。

圖3 脫靶機(jī)制

而通過(guò)優(yōu)化sgRNA降低脫靶效應(yīng)的策略主要有（1）改變sgRNA的長(zhǎng)度，截?cái)?'端的2-3個(gè)堿基［46］或在識(shí)別序列前加2個(gè)鳥(niǎo)嘌呤［47］，切割活性不變，脫靶率降低5 000倍。（2）增加sgRNA的穩(wěn)定性。如在gRNA中增加一對(duì)A-U堿基配對(duì)等方法。此外，有研究表明Cas9直系同源酶對(duì)某些位點(diǎn)的特異性較SpCas9高［48，49］，這無(wú)疑為提高特異性提供了一條新思路。通過(guò)對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的改進(jìn)，脫靶現(xiàn)象大幅降低，但離完全無(wú)脫靶還有一定距離。

3.4 馬賽克現(xiàn)象（Mosacism）

基因編輯技術(shù)日趨完善，研究者期望借助基因編輯來(lái)闡述基因在早期發(fā)育過(guò)程中的作用，以及修復(fù)胚胎中的突變基因，以避免疾病的發(fā)生。目前，將Cas9和sgRNA導(dǎo)入受精卵多是通過(guò)電轉(zhuǎn)化［50］或者顯微鏡下注射［51］的方式，而且多是轉(zhuǎn)入Cas9 mRNA。但這些方式獲得的突變體多存在馬賽克現(xiàn)象（圖4）。馬賽克現(xiàn)象是指將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于多細(xì)胞生物的受精卵基因編輯時(shí)，受精卵分裂成不同的卵裂球，而Cas9蛋白對(duì)不同卵裂球的編輯能力和修復(fù)方式可能不同，從而出現(xiàn)帶有不同編輯類(lèi)型的細(xì)胞的嵌合個(gè)體，或是同時(shí)帶有編輯細(xì)胞與未編輯細(xì)胞的嵌合個(gè)體。馬賽克現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是從受精成功到基因組第一次復(fù)制的時(shí)間極為有限，而Cas9 mRNA翻譯為蛋白質(zhì)需要時(shí)間長(zhǎng)［52］，錯(cuò)過(guò)了在單細(xì)胞受精卵發(fā)生編輯的時(shí)機(jī)，且Cas9蛋白和sgRNA半衰期較長(zhǎng)［53］，能對(duì)一定時(shí)間范圍內(nèi)新分裂生成的細(xì)胞進(jìn)行不同的編輯。不論是觀察基因的作用還是避免遺傳病的發(fā)生，都要求生成非鑲嵌的突變體。為避免鑲嵌現(xiàn)象出現(xiàn)，必須使Cas9蛋白在細(xì)胞基因組第一次復(fù)制之前發(fā)揮作用，且之后不再發(fā)揮作用。雖然近期研究表明將Cas9蛋白和sgRNA以電轉(zhuǎn)的方式導(dǎo)入體外受精的早期受精卵中，可大大降低攜帶鑲嵌基因個(gè)體的出現(xiàn)［54］。但使該技術(shù)完全避免鑲嵌現(xiàn)象，尚有一定難度。

圖4 馬賽克現(xiàn)象

4 結(jié)語(yǔ)

雖然CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)尚存在一些問(wèn)題，但是研究者一直致力于尋找解決方法，通過(guò)改造修飾Cas9蛋白、使用Cas9直系同源酶、化學(xué)物質(zhì)輔助等一系列措施，已然提高了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)精確修復(fù)斷裂DNA能力，降低其脫靶率，減弱PAM導(dǎo)致的靶位點(diǎn)限制，在一定程度上控制了鑲嵌現(xiàn)象的發(fā)生。研究者在尋找彌補(bǔ)不足的方法的同時(shí)，也在不斷拓展該技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。在器官移植領(lǐng)域，利用該技術(shù)已成功去除多種豬器官中的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒［55］，使豬器官移植成為可能。在治療病毒感染領(lǐng)域，體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示將該技術(shù)已能成功去除HIV［56］、乙型肝炎病毒［57］等多種病毒，為這些疾病的治療翻開(kāi)新篇章。在植物育種［58］、遺傳性疾病治療［59］等多個(gè)領(lǐng)域CRISPR/Cas9技術(shù)均取得重要成果。CRISPR/Cas9技術(shù)還在不斷發(fā)展，期待它能在更多的領(lǐng)域發(fā)揮作用。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Current Issues and Progress in the Application of CRISPR/Cas9 Technique

YUAN Wei-xi1YU Yun-mei2HU Chun-cai1ZHAO Zu-guo1
（1. Department of Microbiology and Immunology，Guangdong Medical University，Zhanjiang 524023；2. Central Hospital of PLA，Zhanjiang 524023）

CRISPR/Cas9［clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9］is a RNA-guided genome-editing technique，which can be applied in the deletion，insertion or replacement of specific DNA sequence thus to verify the function of genes or remedy pathogenic genes. Owing to its simplicity，affordability，multiple-site editing and scalability，the technique of CRISPR/ Cas9 is undergoing rapid development and perfection and has been one of the first three prevailing genome-editing technology following that of Zinc finger nucleases and transcription activator-like effector nucleases. In this review，we focus on the current issues of CRISPR/Cas9，including low efficiency of precise-editing，sequence-recognizing limitation from PAM，off-target，unavoidable mosaicism，together with corresponding tactics for improvement. Our aim is to provide the objective understanding on the current disadvantage of CRISPR/Cas9 technique to researchers and the systematic review for reasonable application and improvement of this technology.

CRISPR/Cas9；genome-editing；precise-editing；off-target；mosaicism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.009

2016-08-12

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（509164770054），廣東省自然科學(xué)基金（2015A030313522，2014A030313538）

袁偉曦，女，碩士研究生，研究方向：基于CRISPR-Cas9技術(shù)的鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜相關(guān)蛋白定點(diǎn)敲除；E-mail：binglingxi1991@163.com

趙祖國(guó)，男，博士，研究方向：微生物耐藥性及分子機(jī)制；E-mail：zuguozhao@126.com