任艷玲 沈志強(qiáng) 馬澤彬 李金林 肖 娜 董文艷 李忠順王建軍 楊占崗 劉吉山*

（①山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 256600 ②山東綠都生物科技有限公司 山東 濱州 ③山東無(wú)棣縣車(chē)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 ④山東省濱州市沾化區(qū)畜牧局 ⑤山東無(wú)棣華興渤海黑牛種業(yè)股份有限公司 山東 濱州）

試驗(yàn)研究

中渤海黑牛mtDNA cytb基因遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

任艷玲①沈志強(qiáng)①馬澤彬④李金林①肖 娜②董文艷②李忠順③王建軍①楊占崗⑤劉吉山①*

（①山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 256600 ②山東綠都生物科技有限公司 山東 濱州 ③山東無(wú)棣縣車(chē)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 ④山東省濱州市沾化區(qū)畜牧局 ⑤山東無(wú)棣華興渤海黑牛種業(yè)股份有限公司 山東 濱州）

為了了解無(wú)棣華興渤海黑牛原種場(chǎng)渤海黑牛種公牛的遺傳多樣性水平，確定個(gè)體之間的親緣關(guān)系，對(duì)無(wú)棣華興渤海黑牛原種場(chǎng)15頭渤海黑牛種公牛的細(xì)胞色素b基因(Cytb)全序列的測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)Cytb基因全長(zhǎng)1140bp，共檢測(cè)到了10種單倍型、34個(gè)核苷酸的多態(tài)位點(diǎn)，包括15個(gè)單變異位點(diǎn)和19個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，無(wú)插入和缺失。單倍型多樣度(Hd)為0.914，核苷酸多樣度(Pi)為0.01014，表明渤海黑牛具有豐富的遺傳多樣性。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建的結(jié)果表明15頭渤海黑牛聚為兩大類(lèi)。

渤海黑牛 線粒體DNA cytb基因 遺傳多樣性 親緣關(guān)系

渤海黑牛(Bohai Black Cattle)原稱(chēng)“無(wú)棣黑?！?、又稱(chēng)“抓地虎黑牛”，是我國(guó)唯一的黑毛黃牛品種，是世界上三大黑毛牛種之一，也是我國(guó)八大優(yōu)良地方黃牛品種之一。以被毛、口輪、蹄冠、角、鼻鏡全黑，低身廣軀而聞名，它具有體型結(jié)構(gòu)良好，育肥性能好、屠宰率高等特點(diǎn)。優(yōu)良的肉用性能可以和國(guó)外著名肉牛品種相媲美，尤其肉色鮮艷，脂肪雪白并分布均勻，大理石花紋明顯，烹調(diào)后香味濃郁為其它品種所不及，活牛及牛肉行銷(xiāo)香港，素有“黑金剛”的美譽(yù)。

渤海黑牛主要產(chǎn)地為山東省濱州市渤海一帶的無(wú)棣、沾化、陽(yáng)信、惠民等縣。在山東省東營(yíng)市、濰坊市、淄博市、德州市以及河北省滄州市也有分布，但數(shù)量較少。目前，尤以無(wú)棣縣存欄量為最多，質(zhì)量最好。20世紀(jì)的黃牛改良和肉牛改良，給渤海黑牛這一品種帶來(lái)很大的沖擊，中心產(chǎn)區(qū)存養(yǎng)量急劇下降，分布范圍日漸縮小。特別是進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，隨著農(nóng)業(yè)機(jī)械化水平的不斷提高，渤海黑牛在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的優(yōu)勢(shì)日趨淡化，再加上養(yǎng)殖成本的增加，農(nóng)戶(hù)不再?gòu)氖虏澈：谂５酿B(yǎng)殖繁育工作，致使渤海黑牛瀕臨絕種。為保護(hù)渤海黑牛這一畜禽遺傳資源，2002年濱州市畜牧獸醫(yī)局組建了山東省渤海黑牛原種場(chǎng)，2008年被國(guó)家農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為“國(guó)家級(jí)渤海黑牛保種場(chǎng)”。2011年10月，遷址到無(wú)棣縣車(chē)鎮(zhèn)山東無(wú)棣華興渤海黑牛種業(yè)股份有限公司，新建牛場(chǎng)位于縣城以北20公里處，靠近大義路，占地203畝?，F(xiàn)存欄渤海黑牛600頭，其中基礎(chǔ)母牛570頭，種公牛30頭。無(wú)棣縣以山東省渤海黑牛原種場(chǎng)為依托，充分發(fā)揮渤海黑牛原產(chǎn)地優(yōu)勢(shì)，在碣石山、柳堡和車(chē)王等三個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)建立了渤海黑牛保護(hù)區(qū)。2008年被認(rèn)定為“國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保

護(hù)區(qū)”。目前保護(hù)區(qū)內(nèi)渤海黑牛存欄量3000余頭。配種用凍精全部來(lái)自于山東省渤海黑牛原種場(chǎng)，保證了渤海黑牛的純種繁育。線粒體Cytb基因是線粒體中重要的蛋白編碼基因，包含從種內(nèi)到種間乃至到科間的進(jìn)化遺傳信息，在系統(tǒng)進(jìn)化和分類(lèi)研究中有著較強(qiáng)的適用性，被廣泛應(yīng)用于家畜起源進(jìn)化、親緣關(guān)系和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究[1,2]。本研究旨在分析華興渤海黑牛原種場(chǎng)內(nèi)的15頭種公牛的線粒體DNA的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為渤海黑牛保種育種資源保護(hù)提供理論技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、基因組DNA的提取 15頭渤海黑牛血樣，采自無(wú)棣華興渤海黑牛原種場(chǎng)。頸靜脈采血，ACD抗凝，全血基因組試劑盒(Takara，Code D9081)提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank中(EU177868.1)發(fā)布的牛Cytb基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物序列為：P1：5’TGAAAAACCATCGTTGTCAT 3’，P2：5’CAAAGACCT GTCTTCATTTTAGT 3’。

1.3 渤海黑牛Cytb基因擴(kuò)增及測(cè)序 PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5μl，dNTP 1.5μl，上下游引物各1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，模板DNA 1μl，加H2O至總體積25μl；PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，95 30s℃ ，59 30s℃ ，72 30s℃ ，循環(huán)29次，70℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其片段大小與濃度，試劑盒純化回收，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用ClustalX(1.83)軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，通過(guò)DnaSP5.0軟件分析渤海黑牛15條Cytb序列的變異位點(diǎn)及單倍型。用MEGA5軟件構(gòu)建渤海黑牛種公牛的親緣關(guān)系聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果

2.1 渤海黑牛線粒體DNA cytb基因序列 通過(guò)克隆測(cè)序，獲得15條渤海黑牛線粒體Cytb基因全序列，全長(zhǎng)均為1140bp，共檢測(cè)到34個(gè)突變位點(diǎn)，約占核苷酸總數(shù)的2.98%，其中包括15個(gè)單變異位點(diǎn)和19個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，無(wú)插入和缺失。15條序列共檢測(cè)到10種單倍型，單倍型多樣度Hd為0.914，核苷酸多樣度Pi值為0.01014。

表1 Cytb基因各單倍型變異位點(diǎn)

表2 Cytb基因單倍型的多樣性參數(shù)

2.2 mtDNA Cytb基因核酸組成 利用MEGA5.0基因序列平均核苷酸組成，結(jié)果見(jiàn)表3。渤海黑牛Cytb基因全序列平均堿基含量為T(mén)25.3%，C30.0%，A31.3%，G13.4%。其中G的含量低于其它堿基含量。A+T含量(56.6)高于G+C含量(43.4%)，這與動(dòng)物mtDNA富含AT的結(jié)論一致。

表3 Cytb基因序列平均核苷酸組成

2.3 渤海黑牛種公牛親緣關(guān)系聚類(lèi)圖 用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA5選用Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算15個(gè)種公牛之間的平均遺傳距離，見(jiàn)表4。15個(gè)個(gè)體間遺傳距離為0～0.021，平均值為0.012。引用野牦牛Cytb序列(AY955226)做外群，構(gòu)建了渤海黑牛15個(gè)個(gè)體、NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(附圖)，由圖可知，15頭種公牛聚為2大類(lèi)。

表4 渤海黑牛15 個(gè)個(gè)體之間的Kimura 雙參數(shù)遺傳距離

附圖 用NJ 法構(gòu)建的渤海黑牛15 個(gè)個(gè)體間的聚類(lèi)圖

3 討論

3.1 渤海黑牛的遺傳多樣性研究 從分子水平上分析地方品種的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)是實(shí)施保護(hù)和利用的基礎(chǔ)，近年來(lái)學(xué)者對(duì)渤海黑牛開(kāi)展了一些研究。王建英等[3]在渤海黑牛和日本和D-loop區(qū)遺傳變異研究中發(fā)現(xiàn)，渤海黑牛mtDNA D-loop區(qū)具有豐富的遺傳多樣性，二者的親緣關(guān)系很近；渤海黑牛含有普通牛和瘤牛的血統(tǒng)、受到過(guò)瘤牛血緣漸滲的影響。周芬娜等[4]和王敏強(qiáng)等[5]分析了渤海黑牛和魯西黃牛的遺傳多樣性，均表明渤海黑牛有豐富的遺傳變異，但是群體遺傳多樣性低于魯西黃牛。但是對(duì)渤海黑牛Cytb基因遺傳多樣性尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)對(duì)渤海黑牛mtDNA cytb基因分析，15個(gè)渤海黑牛個(gè)體單倍型多樣度Hd為0.914，核苷酸多樣度Pi值為0.01014，亦具有豐富的遺傳多樣性。

3.2 渤海黑牛種公牛親緣關(guān)系與保護(hù)建議 15個(gè)渤海黑牛個(gè)體間的遺傳距離為0～0.021，平均遺傳距離為0.012，說(shuō)明個(gè)體之間親緣關(guān)系較近。因此應(yīng)該多渠道、多投入，加強(qiáng)品種保護(hù)和利用。（1）渤海黑牛的品種資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用是一項(xiàng)高投入、長(zhǎng)時(shí)間的系統(tǒng)工程，一方面需要政府加大投入資金，另一方面需要積極吸引社會(huì)資金，鼓勵(lì)企業(yè)和個(gè)人及有關(guān)社會(huì)團(tuán)體參與。（2）擴(kuò)大保種群的數(shù)量，飼養(yǎng)一定數(shù)量的公牛和采取合理的公母比例，以維持渤海黑牛群體內(nèi)的遺傳多樣性。（3）適當(dāng)?shù)膶?dǎo)入外血，通過(guò)導(dǎo)入優(yōu)勢(shì)基因，在保護(hù)遺傳多樣性的同時(shí)提高生產(chǎn)性能。

[1] 蔡欣, 陳宏, 雷初朝等. 中國(guó)3個(gè)牛種Cytb基因多態(tài)性及其系統(tǒng)發(fā)育研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007, 35(2): 43-46.

[2] IRWIN D M，KOCHER T D，WILSON A C．Evolution of the eytochrome b gene of mammals[J]. Journal of Molecular Evolution, 1991, 32(2): 128-l44.

[3] 王建英, 張秀美, 蘭鄒然等. 渤海黑牛和日本和牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳變異研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009,14(3): 75-82.

[4] 周芬娜, 畢偉偉, 王慧等. 魯西黃牛和渤海黑牛群體遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 山東畜牧獸醫(yī), 2010, 31: 1-2.

[5] 王敏強(qiáng), 李麗萍, 陳禮學(xué)等. 用20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記研究魯西黃牛和渤海黑牛的遺傳多樣性[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 29(6): 75-81.

S823.2

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1007-1733(2017)05-0001-02

2017–01–11）

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