巴 根，呂雪蓮，王聰敏，丁 瀟，區(qū)敏儀，祝 賀，楊蓉婭

CARD9 基因敲除小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞對(duì)阿薩希毛孢子菌臨床株的免疫反應(yīng)缺陷

巴 根，呂雪蓮，王聰敏，丁 瀟，區(qū)敏儀，祝 賀，楊蓉婭

巴 根

目的初步探討CARD9基因敲除小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞（bone marrowderived dendritic cell, BMDC）對(duì)阿薩希毛孢子菌臨床株（Trichosporon asahii, T.asahii）的免疫反應(yīng)缺陷。方法體外培養(yǎng)野生型（wild type, WT）與CARD9基因敲除型（CARD9 knockout, CARD9-/-）小鼠BMDC并分別與熱滅活的T.asahii進(jìn)行共培養(yǎng)，比較兩者對(duì)菌體的黏附吞噬能力、表面共刺激分子的激活、細(xì)胞因子的表達(dá)以及兩種小鼠感染菌株后的生存率。結(jié)果共培養(yǎng)24 h后，WT與CARD9-/-小鼠BMDC對(duì)T.asahii的黏附吞噬情況比較未見明顯差異；經(jīng)T.asahii刺激的CARD9-/-小鼠BMDC的CD80、CD86激活情況以及白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)水平均明顯低于WT小鼠BMDC（P＜0.05）；感染T.asahii的CARD9-/-小鼠的生存率明顯低于WT小鼠（P＜0.05）。結(jié)論CARD9-/-小鼠BMDC對(duì)T.asahii的免疫反應(yīng)缺陷主要體現(xiàn)在共刺激分子的激活以及促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，但并未影響其對(duì)T.asahii的吞噬識(shí)別。

阿薩希毛孢子菌；基因，CARD9；樹突狀細(xì)胞

[J Pract Dermatol, 2017, 10(2):73-76]

阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii, T.asahii）是毛孢子菌?。╰richosporonosis）的主要致病菌，多引起免疫缺陷患者播散性感染[1]。本課題組在臨床上發(fā)現(xiàn)了國內(nèi)首例播散性阿薩希毛孢子菌病[2]，患者無腫瘤及人免疫缺陷病毒（human immunodef ciency virus，HIV）感染等獲得性免疫缺陷病史，長期抗真菌治療療效不理想。對(duì)該患者進(jìn)行全外顯子組測序分析顯示其CARD9基因存在錯(cuò)義點(diǎn)突變進(jìn)而造成了CARD9功能缺陷。CARD9即胱天蛋白酶募集域蛋白-9（caspase recruitment domain-containing protein 9，CARD9），是一種重要的接頭蛋白，能夠與B細(xì)胞淋巴瘤因子-10（BCL10）、胃腸黏膜相關(guān)淋巴組織-1（MALT1）結(jié)合形成CBM復(fù)合體，在抗真菌免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)作用，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞（dendritic cell, DC）[3]。而DC作為調(diào)動(dòng)并調(diào)節(jié)宿主抗真菌免疫反應(yīng)的關(guān)鍵，能夠在病原真菌入侵時(shí)將菌體黏附吞噬，同時(shí)激活表面共刺激分子，并表達(dá)多種細(xì)胞因子，從而對(duì)其進(jìn)行抗原提呈并誘導(dǎo)Th細(xì)胞（helper T cell）的分化，激活適應(yīng)性免疫將其殺滅[4,5]。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)?zāi)MDC對(duì)致病真菌的免疫識(shí)別過程，利用CARD9基因敲除型（CARD9 Knockout, CARD9-/-）小鼠CARD9功能缺陷的特點(diǎn)，分別將野生型（wild type，WT）與CARD9-/-小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞（bone marrow-derived dendritic cell, BMDC）與分離自播散性阿薩希毛孢子菌病患者的T.asahii進(jìn)行共培養(yǎng)，比較兩者對(duì)菌體的黏附吞噬能力、表面共刺激分子的激活、細(xì)胞因子的表達(dá)以及兩種小鼠感染菌株后的生存率，從微觀和宏觀角度初步探索CARD9基因敲除小鼠BMDC對(duì)T.asahii的免疫反應(yīng)缺陷，為研究CARD9功能缺陷及播散性阿薩希毛孢子菌病患者的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 IX73型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、普通光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司）、LRH-150-MS型真菌培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）、5810R冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）、LSRFortessa型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.1.2 試劑 胎牛血清（香港BIOCIO公司），RPMI-1640液體培養(yǎng)基（美國Gibco公司），磷酸鹽緩沖液PBS（美國Hyclone公司），鏈霉素-青霉素（美國Gibco公司），重組小鼠GM-CSF、重組小鼠IL-4（美國PeProtech公司），APC標(biāo)記的小鼠CD11c單抗、PE標(biāo)記的小鼠CD80單抗、FITC標(biāo)記的小鼠CD86單抗、小鼠Fc block（美國BD公司），4%多聚甲醛、紅細(xì)胞裂解液（北京索萊寶生物科技有限公司），YPD干粉（北京奧博星生物技術(shù)有限公司），AimPlex小鼠Th1/Th2/Th17-16因子試劑盒（北京曠博生物技術(shù)股份有限公司）。

1.1.3 菌株 T.asahii分離自播散性阿薩希毛孢子菌病患者頸部皮損，通過基因測序并比對(duì)GenBank/ EMBL/DDBJ國際核酸序列數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)該菌株rRNA大亞基D1/D2區(qū)域堿基序列與阿薩希毛孢子菌標(biāo)準(zhǔn)株完全相同，證實(shí)為阿薩希毛孢子菌并保藏于陸軍總醫(yī)院皮膚科實(shí)驗(yàn)室（菌藏號(hào)：BM1403）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取WT（C57BL/6）與CARD9-/-純系小鼠，雄性，周齡6～8 w，體重18～20 g，由清華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0007]。

1.2 方法

1.2.1 WT與CARD9-/-小鼠BMDC誘導(dǎo)培養(yǎng) 將WT與CARD9-/-小鼠頸椎脫臼處死，無菌取股骨及脛骨骨髓。加入紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，離心（1 500 r/min, 5 min）后棄上清。RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）懸浮細(xì)胞，以每孔2×106密度接種于6孔培養(yǎng)板，加入細(xì)胞因子GM-CSF（終濃度20 ng/ml）、IL-4（終濃度10 ng/ml），置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日半量換液并補(bǔ)足細(xì)胞因子。培養(yǎng)至8 d時(shí)，各取1×104的WT與CARD9-/-小鼠懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測其CD11c（小鼠BMDC的特異性標(biāo)志）表達(dá)率分別為（96.37 ±0.92）%和（97.11±1.84）%，說明誘導(dǎo)培養(yǎng)成功。收獲剩余懸浮及半懸浮細(xì)胞，并以相同濃度重新鋪入6孔板中待用。

1.2.2 菌懸液配制 將凍存于-80℃甘油中的T.asahii復(fù)溫后接種于20 ml液體YPD培養(yǎng)基中，35℃振蕩培養(yǎng)18 h，增殖產(chǎn)生大量孢子。取10 ml熱滅活（121℃，15 min）并離心（1 500 r/min, 5 min）棄掉YPD培養(yǎng)基，以無菌生理鹽水配制濃度為1×107/ml的熱滅活菌懸液；另10 ml直接離心（1 500 r/min, 5 min），棄掉YPD培養(yǎng)基并以無菌生理鹽水配制相同濃度的成活T.asahii菌懸液待用。

1.2.3 BMDC對(duì)T.asahii的吞噬率測定 將圓形細(xì)胞粘附載玻片（直徑1cm）置于24孔板中，以每孔1 ×105密度分別鋪入WT與CARD9-/-小鼠BMDC，貼壁2 h后加入熱滅活T.asahii菌懸液（細(xì)胞與菌體濃度比例為1:5）。置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h后棄掉上清，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定10～20 min后取出圓形蓋玻片置于載玻片上。經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后用倒置相差顯微鏡觀察BMDC對(duì)T.asahii的吞噬現(xiàn)象，至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，吞噬率=吞噬T.asahii的BMDC細(xì)胞個(gè)數(shù)/所計(jì)數(shù)的BMDC細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 BMDC表面共刺激分子檢測 將培養(yǎng)有WT與CARD9-/-小鼠BMDC的6孔板中分別加入熱滅活T.asahii菌懸液（細(xì)胞與菌體濃度比例為1:5），以未加入菌懸液的WT與CARD9-/-小鼠BMDC作為對(duì)照組，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h。收集各組BMDC，調(diào)整單個(gè)待測樣本細(xì)胞數(shù)至5× 105，以50 μl的Fc-block冰上孵育5 min，PBS洗滌1次。分別加入APC-CD11c、FITC-CD86與PE-CD80單抗各1 μl，4℃避光孵育30 min，用PBS洗滌1次，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.2.5 BMDC產(chǎn)生細(xì)胞因子檢測 收集上一步實(shí)驗(yàn)中各組上清液，采用AimPlex小鼠Th1/Th2/Th17-16因子試劑盒檢測小鼠BMDC細(xì)胞因子IL-1β、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-23和腫瘤壞死因子(TNF)-α的產(chǎn)生水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，每組設(shè)1個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 感染小鼠生存率分析 分別取WT小鼠與CARD9-/-小鼠各3只（生存率分析要求樣本含量為觀察協(xié)變量的5～20倍。本實(shí)驗(yàn)的觀察協(xié)變量僅有小鼠生存時(shí)間1項(xiàng)，樣本含量為WT小鼠與CARD9-/-小鼠共6只，樣本含量為觀察協(xié)變量的6倍，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求），采用1 ml注射器將成活T.asahii菌懸液經(jīng)尾靜脈對(duì)每只小鼠各接種0.1 ml。每日觀察小鼠，連續(xù)觀察16 d，記錄小鼠生存情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖表制作，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析（oneway ANOVA）比較各組間均值，采用Log-rank檢驗(yàn)比較小鼠生存率。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMDC形態(tài)及其對(duì)T.asahii的吞噬比較

經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色可見，培養(yǎng)至8 d時(shí)WT與CARD9-/-小鼠BMDC在光鏡下分布較均勻，表面可見典型的樹枝樣突起，其形態(tài)比較未見明顯差異（圖1a）。與T.asahii共培養(yǎng)24 h后可見，WT與CARD9-/-小鼠BMDC對(duì)菌體均具有黏附吞噬作用，且兩者吞噬形態(tài)相似（圖1b），兩組吞噬率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1c）。

2.2 BMDC表面共刺激分子的活化比較

共培養(yǎng)24 h后，以CD11c陽性的細(xì)胞圈門檢測各組BMDC表面共刺激分子表達(dá)情況。結(jié)果顯示，未經(jīng)T.asahii刺激的WT與CARD9-/-小鼠BMDC均低表達(dá)CD80與CD86，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而經(jīng)T.asahii刺激的WT與CARD9-/-小鼠BMDC的CD80與CD86表達(dá)水平均明顯升高，但CARD9-/-小鼠BMDC的表達(dá)水平明顯低于前者（P＜0.05）（圖2）。

2.3 BMDC各細(xì)胞因子的表達(dá)比較

共培養(yǎng)24 h后，未經(jīng)T.asahii刺激的WT與CARD9-/-小鼠BMDC均低表達(dá)IL-6和TNF-α，且表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；而經(jīng)T.asahii刺激的WT小鼠BMDC表達(dá)IL-6和TNF-α水平均明顯高于CARD9-/-小鼠BMDC（P＜0.05）（圖3）。

圖1 WT與CARD9-/-小鼠BMDC及其對(duì)T.asahii吞噬功能的比較（HE染色）

圖2 對(duì)照組與T.asahii刺激組共刺激分子的表達(dá)比較

圖3 對(duì)照組與T.asahii刺激組細(xì)胞因子表達(dá)比較

2.4 感染小鼠生存率比較

連續(xù)觀察16 d，感染T.asahii的CARD9-/-小鼠全部死亡，分別于9 d死亡2只，11 d死亡1只；而感染T.asahii的WT小鼠則全部存活。Log-rank生存率分析提示兩組小鼠生存率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 感染小鼠生存率比較

3 討論

新近研究顯示，CARD9功能缺陷可以導(dǎo)致白念珠菌、疣狀瓶霉、皮炎外瓶霉以及紅色毛癬菌等多種真菌播散性感染[6-8]。而真菌感染后宿主免疫細(xì)胞對(duì)致病真菌反應(yīng)的第一步就是將其吞噬，但這一功能信號(hào)在胞內(nèi)的傳遞并不依賴于CARD9的介導(dǎo)[9,10]。本實(shí)驗(yàn)中可以看到WT與CARD9-/-小鼠BMDC對(duì)菌體均具有黏附吞噬作用，且兩組吞噬率比較未見明顯差異，說明CARD9功能缺陷同樣并未影響B(tài)MDC對(duì)T.asahii的吞噬作用。

DC攝取致病真菌后便通過模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）對(duì)菌壁各種抗原成分進(jìn)行識(shí)別，這其中dectin-1（DC-associated C-type lectin）受體能夠識(shí)別真菌菌壁的重要抗原成分β-葡聚糖（β-glucan），其后在脾酪氨酸酶（spleen tyrosine kinase, Syk）作用下促使CARD9與BCL10、MALT1形成CBM復(fù)合體，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclear factor kappa B）促進(jìn)共刺激分子CD80和CD86的活化[10,11]。本實(shí)驗(yàn)以小鼠BMDC的特異性標(biāo)志CD11c圈門，可以看到經(jīng)T.asahii刺激的WT與CARD9-/-小鼠BMDC其共刺激分子表達(dá)水平均明顯升高，但后者明顯低于前者。這說明盡管兩者均能夠識(shí)別T.asahii，但CARD9功能缺陷影響了CBM復(fù)合體的形成，進(jìn)而降低了共刺激分子的表達(dá)，從而阻礙了抗原提呈過程。

另外本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)T.asahii刺激的WT小鼠BMDC表達(dá)IL-6和TNF-α水平明顯高于CARD9-/-小鼠，這其中TNF-α能夠趨化中性粒細(xì)胞早期殺滅真菌；而IL-6則介導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化，通過適應(yīng)性免疫效應(yīng)進(jìn)一步清除真菌[12]。Th17細(xì)胞在宿主對(duì)抗真菌感染中具有重要作用，而多數(shù)文獻(xiàn)[3,6-8,10]報(bào)道CARD9功能缺陷主要引起IL-6低表達(dá)進(jìn)而影響了Th17細(xì)胞的分化，從而造成宿主對(duì)各種機(jī)會(huì)性致病真菌易感。本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示感染T.asahii的CARD9-/-小鼠全部死亡，而WT小鼠則全部存活，兩者生存率存在明顯差異，從宏觀角度證實(shí)了CARD9功能缺陷的確會(huì)導(dǎo)致宿主對(duì)T.asahii免疫功能下降。但由于CARD9在中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中均有表達(dá)且同樣影響二者抗真菌效應(yīng)的發(fā)揮，與此同時(shí)Th1與Th2細(xì)胞也參與了適應(yīng)性免疫反應(yīng)過程，因此上述通路缺陷是否直接造成了宿主感染T.asahii還有待研究[6,12-13]。

綜上所述，該研究初步表明，CARD9-/-小鼠BMDC對(duì)T.asahii的免疫反應(yīng)缺陷主要影響共刺激分子的激活以及促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，但并未影響其對(duì)T.asahii的吞噬識(shí)別。這也為研究CARD9功能缺陷及播散性阿薩希毛孢子菌病患者的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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The impairment of immune response against Trichosporon asahii clinical isolate in CARD9 knockout murine bone marrow-derived dendritic cell

BA Gen，LV Xue-lian，WANG Cong-min，et al
Department of Dermatology, PLA Army General Hospital & Second Military Medical University, Beijing 100700, China

ObjectiveTo investigate the impairment of immune response against Trichosporon asahii(T.asahii) clinical isolate in CARD9 knockout murine bone marrow-derived dendritic cell(BMDC).MethodsAfter in vitro co-culture of BMDCs from wild type mice(WT) and CARD9 knockout mice(CARD9-/-) with heat-killed T.asahii, the phagocytotic ability, costimulatory molecules activation and cytokines production of BMDCs between WT and CARD9-/- were compared.ResultsCompared with the WT BMDC, the phagocytotic ability of CARD9-/- BMDC was not signif cantly impaired, but its activation of CD80 and CD86 and the production of IL-6 and TNF-α were significantly lower after co-cultured with T.asahii for 24h. After having been infected by T.asahii, the CARD9-/- mice showed remarkable lower survival rate than the WT mice.ConclusionCARD9-/- BMDC exhibited the defects in costimulatory molecules activation and inf ammatory cytokines production but not the phagocytotic ability against T.asahii.

Trichosporon asahii；Gege，CARD9；Dendritic cell

R756.9

A

1674-1293(2017)02-0073-04

2016-10-10

2017-01-18）

（本文編輯 祝賀）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20170203

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81471928；81571972）；全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項(xiàng)目（14QNP010）

100700 北京，陸軍總醫(yī)院（第二軍醫(yī)大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院）皮膚科（巴根，王聰敏，丁瀟，區(qū)敏儀，祝賀，楊蓉婭）；首都醫(yī)科大學(xué)附屬安貞醫(yī)院皮膚科（呂雪蓮）

巴根，在讀碩士研究生，主要研究方向：阿薩希毛孢子菌與宿主天然免疫，E-mail: 1311571168@qq.com

楊蓉婭，E-mail: yangrya@sina.com