劉永鑫，鄭和義

光動力療法對尖銳濕疣皮損朗格漢斯細(xì)胞的影響

劉永鑫，鄭和義

劉永鑫

目的觀察光動力療法（PDT）對尖銳濕疣（CA）患者皮損中朗格漢斯細(xì)胞（LC）的影響，進(jìn)一步探尋PDT治療CA的免疫機(jī)制。方法應(yīng)用免疫組化標(biāo)記方法，對15例PDT治療前后的CA皮損及5例正常包皮組織對照進(jìn)行染色，在高倍光鏡下觀察LC的形態(tài)、分布及數(shù)量等的變化。結(jié)果15例CA皮損較正常對照組織[(18.8 ± 4.0)個 /高倍視野] LC數(shù)量明顯降低（P＜0.01），表皮內(nèi)LC分布不規(guī)則，大部分LC結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞突減少、縮短甚至消失，缺少LC的典型特征，點(diǎn)狀或條索狀。個別皮損表皮內(nèi)LC缺失，而其真皮內(nèi)見到不典型的LC。PDT治療后即刻組LC數(shù)量[(9.2 ± 2.0)個/高倍視野]較治療前組[(6.2 ± 1.8)個/高倍視野]明顯升高（P＜0.05），治療后7 d組LC數(shù)量[（6.4± 1.1）個/高倍視野]回落接近治療前水平（P＞0.05），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論CA患者皮損局部細(xì)胞免疫功能低下，作為抗原提呈細(xì)胞的LC，其數(shù)量和形態(tài)發(fā)生改變。PDT能誘導(dǎo)CA皮損局部LC數(shù)量及形態(tài)發(fā)生明顯改變，具有調(diào)節(jié)局部免疫的作用。

尖銳濕疣；光動力療法；朗格漢斯細(xì)胞；免疫組化

[J Pract Dermatol, 2017, 10(2):70-72]

尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）是由于感染人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）而引發(fā)的一種常見的性傳播疾病。有研究顯示[1]，CA皮損部位的朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cell，LC）數(shù)量減少，形態(tài)發(fā)生改變，無法將表皮內(nèi)的病毒抗原提呈給存在于真皮的免疫活性細(xì)胞，因此不能形成HPV相關(guān)的特異性免疫反應(yīng)，使皮損持續(xù)存在或在治療后易于復(fù)發(fā)。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是近年來興起的一種治療方法，用于治療多種腫瘤[2,3]及良性皮膚病變[4]，取得了顯著療效。該方法能夠改善局部的免疫應(yīng)答[5,6]，通過細(xì)胞因子、生長因子、補(bǔ)體系統(tǒng)分子和急性期蛋白[7]等相關(guān)炎癥遞質(zhì)釋放，產(chǎn)生或增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)[8]。PDT對改善HPV感染治療現(xiàn)狀具有重要意義[9]。本文應(yīng)用免疫組化的方法對初發(fā)CA皮損中的LC進(jìn)行研究，觀察PDT治療前后皮損中LC的分布及形態(tài)學(xué)改變，同時對LC數(shù)量進(jìn)行半定量分析，從而揭示PDT治療CA的免疫學(xué)機(jī)制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

2012年4月—2013年4月，在北京世紀(jì)壇醫(yī)院皮膚性病門診就診的15例初發(fā)CA患者，均經(jīng)臨床和組織病理確診為CA。15例患者中男7例，女8例，年齡16～42歲，病程1～8周。15例患者隨機(jī)分為3組，每組5例，即PDT治療前組、治療后即刻組及治療后7 d組，每組性別、年齡分布較一致，具有可比性。正常對照組為5例行包皮環(huán)切術(shù)的健康人。本研究已通過北京世紀(jì)壇醫(yī)院科學(xué)研究倫理委員會同意。

1.2 方法

1.2.1 PDT治療前后的取材與染色 CD1a鼠抗人單克隆抗體（英國Novocastra Laboratiories 有限公司），NovoLinkTM Polymer檢測系統(tǒng)（上海泉暉生物技術(shù)有限公司）。治療前組的5例患者在進(jìn)行PDT治療前皮損局部取材，用10%福爾馬林固定后制成蠟塊，切成4 μm薄片，置于多聚賴氨酸處理過的玻片上，依照CD1a免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行染色；15例患者均進(jìn)行PDT治療，PDT治療后即刻組在治療后即刻、治療后7 d組在治療后7 d，分別在治療部位取材并染色，具體方法同前。5例正常對照為包皮環(huán)切術(shù)后的正常皮膚組織，以Tris鹽酸緩沖液代替一抗。

1.2.2 PDT 用5-氨基酮戊酸散（ALA，商品名：艾拉，每瓶118 g，上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司）配置20%ALA溶液。用0.4%的氯己定溶液對疣體及周邊黏膜進(jìn)行常規(guī)消毒；在疣體部位放置適當(dāng)大小的滴有ALA溶液的脫脂棉球，并覆于疣體上，范圍覆蓋至皮損周邊2 cm內(nèi)正常外觀的皮膚黏膜；ALA外用封包3 h后，局部給予照射能量100 mW的100 J/cm2的半導(dǎo)體激光垂直照射。

1.2.3 光鏡下觀察 鏡下見細(xì)胞膜或胞質(zhì)呈黃褐色樹枝狀突起的細(xì)胞即CD1a染色陽性的LC。觀察其分布及形態(tài)特點(diǎn)，每張切片任取5個LC分布最為密集的高倍視野，計數(shù)LC的數(shù)量，并計算陽性細(xì)胞密度= 5個視野陽性細(xì)胞總數(shù)/5 個視野總細(xì)胞數(shù)，以其作為最終的結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

觀察對比PDT各組與正常對照組的LC的分布及形態(tài)，各組間結(jié)果采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

圖1 正常對照組與PDT各組LC變化的比較（SP法×400）

2 結(jié)果

2.1 光鏡下LC的分布及形態(tài)學(xué)改變

正常對照組表皮中可見較多CD1a染色陽性的細(xì)胞，胞體圓形、橢圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞膜或胞質(zhì)呈黃褐色，具有3～4個細(xì)長的樹枝狀突起，亦呈黃褐色，細(xì)胞位于基底細(xì)胞間或棘細(xì)胞間，少數(shù)LC結(jié)構(gòu)不完整或突起不明顯（圖1a）。

PDT各組：LC分布不規(guī)則，數(shù)量明顯減少，胞體較正常組小，結(jié)構(gòu)不完整，樹突明顯減少、縮短或消失，二級突起極少見到，胞突呈點(diǎn)狀或條索狀，典型的樹突狀結(jié)構(gòu)的LC少見。細(xì)胞多位于表皮下部，個別病損表皮中LC消失，真皮淺層見到不典型的LC。相對于PDT治療前組，PDT治療后即刻組及治療后7 d組真皮中CD1a染色陽性的LC數(shù)量明顯增多，但缺少典型的樹突狀結(jié)構(gòu)，這種形態(tài)學(xué)改變在治療后7 d組更明顯（圖1b-1d）。

LC含量在正常對照組和PDT各組分別為[(18.8 ± 4.0)個/高倍視野]和[(7.3 ± 2.1)個/高倍視野]，后者的LC含量均顯著低于前者（表1），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療后7 d組與治療前組相比不具有顯著性差異，LC數(shù)量回落接近治療前水平，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 正常對照組及PDT各組皮損LC數(shù)量（個/高倍視野，±s）

表1 正常對照組及PDT各組皮損LC數(shù)量（個/高倍視野，±s）

組 別 例數(shù) 數(shù)量范圍 LC數(shù)量 陽性細(xì)胞密度（%）正常對照 5 15～25 18.8 ± 4.0 6.42 PDT治療前組 5 4～8 6.2 ± 1.8 2.00 PDT治療后即刻組 5 7～12 9.2 ± 2.0 3.07 PDT治療后7 d組 5 5～8 6.4± 1.1 2.27

2.2 各組間均數(shù)單因素方差分析

CA各組與正常對照組間經(jīng)均數(shù)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但各組間應(yīng)用Q檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

LC是來源于骨髓及脾的樹突狀細(xì)胞，主要位于表皮內(nèi)，具有較強(qiáng)的抗原提呈作用，向T淋巴細(xì)胞提呈抗原的同時，激活T淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫應(yīng)答[10,11]，在病毒性皮膚病中起著重要的防御和傳遞病毒抗原的作用。

自20世紀(jì)70年代末問世以來，PDT應(yīng)用于HPV相關(guān)性疾病取得了顯著效果[12,13]。PDT能夠有效改善CA患者皮損的免疫抑制狀態(tài)[14]，而其中LC發(fā)揮的作用有待進(jìn)一步研究。

CD1a是LC細(xì)胞表面最重要的標(biāo)志，且LC是皮膚內(nèi)惟一能與CD1a抗體相結(jié)合的細(xì)胞。本試驗(yàn)采用免疫組化的方法，利用CD1a單克隆抗體對正常包皮組織及CA皮損進(jìn)行染色，觀察LC在治療前后的變化?？紤]到復(fù)發(fā)CA患者存在明顯的局部免疫功能低下，由此產(chǎn)生的治療抵抗可能會干擾進(jìn)一步的分析，因此，本試驗(yàn)僅選取了15例初發(fā)CA患者。

結(jié)果顯示，對照組正常表皮中可見較多典型的樹突狀LC細(xì)胞，分布較均勻，而CA皮損表皮內(nèi)LC分布不規(guī)則，數(shù)量明顯減少，大部分LC結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞突減少、縮短甚至消失，缺少LC的典型特征，點(diǎn)狀或條索狀，個別皮損表皮內(nèi)LC缺失，而其真皮內(nèi)見到不典型的LC。說明感染HPV時，可能通過HPV的直接作用使LC發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變，局部病毒抗原刺激LC從表皮游走至真皮，進(jìn)而介導(dǎo)激活免疫應(yīng)答反應(yīng)。PDT治療后即刻組及治療后7 d組，其真皮中CD1a染色陽性的LC數(shù)目明顯增多，提示免疫介導(dǎo)作用明顯加強(qiáng)。

研究中，15例CA患者無論治療與否，皮損中LC數(shù)量均顯著低于正常對照組（P＜0.01）。PDT治療前組皮損中的LC變化與文獻(xiàn)報道相似[15]；PDT治療后即刻組，皮損真皮內(nèi)的LC數(shù)量明顯增多，這可能與PDT直接或間接（細(xì)胞因子或趨化因子等）活化LC、激活局部細(xì)胞免疫或使真皮內(nèi)LC受到炎癥趨化遷移至PDT反應(yīng)局部有關(guān)；治療后7 d組，LC數(shù)量回落，接近治療前水平，但LC分布發(fā)生了明顯變化，其分布以真皮為主，表皮內(nèi)少見或罕見，這可能與LC活化后不斷向引流淋巴結(jié)遷移以完成抗原提呈過程或通過PDT誘發(fā)表皮內(nèi)LC發(fā)生細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，重新分布的LC其活性有待進(jìn)一步研究[1]。

HPV感染后存在于角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)，釋放的病毒顆粒位于角質(zhì)層上方，而通常LC分布于表皮中下層，以上特點(diǎn)使得LC對HPV的免疫應(yīng)答受到限制，LC趨化所需的抗原和炎癥信號也十分有限。PDT誘發(fā)皮損局部產(chǎn)生炎癥和免疫應(yīng)答，使亞臨床狀態(tài)下的HPV病毒顆粒更好地暴露在LC面前，免疫應(yīng)答受限得到明顯改善。這對于徹底清除HPV，最終獲得臨床治愈有著重要的意義。

綜上所述，PDT能夠誘導(dǎo)LC重新分布，使其數(shù)量和形態(tài)學(xué)發(fā)生顯著變化，通過加強(qiáng)LC對HPV的抗原提呈作用，加強(qiáng)局部的細(xì)胞免疫，對減少隨后持續(xù)存在的HPV感染、降低復(fù)發(fā)、獲得臨床治愈具有重要意義。

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Effect of photodynamic therapy on Langerhans cells in lesion area of condyloma acuminatum

LIU Yong-xin，ZHENG He-yi
Department of Dermatology and Venereology, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China

ObjectiveTo investigate the alteration of Langerhans cells (LCs) in local lesions of Condyloma Acuminatum(CA) patients around PDT.MethodsThe CD1a staining in 15 specimens of CA before and after the PDT was evaluated by immunohistochemical technique, as well as 5 positive controls. The morphology changes of LCs were observed through high power lens.ResultsThe alteration of Langerhans cells in local lesions of CA patients around PDT including: histopathological study showed far fewer LCs in all CA lesions(P＜0.01) compared with normal controls (18.8 ± 4.0 / highpower f eld); the dendritic structure of LCs reduced, shortened or even completely disappeared; atypical LCs without distinctive dendritic structure were detected in the dermis in some specimens; the number of LCs instantly after PDT (9.2±2.0/highpower field) was remarkable higher than the level before the treatment (6.2±1.8 /highpower f eld)(P＜0.05). Meanwhile, 7 days after the treatment, the number of LCs (6.4±1.1/ highpower f eld) declined approaching to the level before the PDT(P＞0.05, without statistic difference).ConclusionThe cellular immunity was impaired in CA lesions. The PDT could improve the local immune state through modifying the characteristics of LCs, which might act as an immunologic regulator in the cure of CA.

Condylomata acuminata；Photodynamic therapy；Langerhans cell；Immunohistochemistry

R752.53

A

1674-1293(2017)02-0070-03

2016-10-10

2017-01-18）

（本文編輯 耿建麗）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20170202

100038北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院皮膚性病科（劉永鑫）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院皮膚性病科（鄭和義）

劉永鑫，醫(yī)學(xué)博士，醫(yī)師，從事皮膚性病科臨床工作，E-mail: lyx3179@163.com