軒丹丹孫廉平張沛沛 張迎信 吳瑋勛 楊正福 占小登 沈希宏 曹立勇程式華

(中國水稻研究所/水稻生物學(xué)國家重點實驗室/浙江省超級稻研究重點實驗室，杭州311401；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人，E-mail:caoliyong@caas.cn，shcheng@mail.hz.zj.cn)

水稻無花粉型核雄性不育突變體whf41的鑒定與基因定位

軒丹丹#孫廉平#張沛沛 張迎信 吳瑋勛 楊正福 占小登 沈希宏 曹立勇*程式華*

(中國水稻研究所/水稻生物學(xué)國家重點實驗室/浙江省超級稻研究重點實驗室，杭州311401；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人，E-mail:caoliyong@caas.cn，shcheng@mail.hz.zj.cn)

【目的】水稻花藥角質(zhì)層和蠟質(zhì)層是花粉囊發(fā)育重要的結(jié)構(gòu)支撐和安全屏障。對花粉囊發(fā)育相關(guān)基因進行表型分析和遺傳定位，為進一步克隆相關(guān)基因和分子機制研究提供基因資源和理論基礎(chǔ)?！痉椒ā繌亩i稻中恢8015輻射誘變(60Co-γ)突變體庫中分離鑒定出了一個無花粉型雄性不育突變體whf41。對野生型和突變體不同發(fā)育時期的花藥進行半薄切片觀察；并對其成熟期的花藥進行掃描電鏡觀察。將突變體分別與中恢8015和02428雜交，構(gòu)建BC1F1、F1株系和BC1F2、F2群體，對該表型進行遺傳分析，采用圖位克隆的方法精細定位目的基因?！窘Y(jié)果】表型分析結(jié)果顯示，whf41突變體的花藥瘦小且呈透明乳白色，花藥中不包含花粉粒細胞；半薄切片結(jié)果顯示，突變體的小孢子無法形成正常的花粉外壁，絨氈層細胞異常膨大而不進行程序性死亡，最終膨脹的絨氈層和花粉細胞碎片逐漸融合并充滿藥室；掃描電鏡結(jié)果進一步發(fā)現(xiàn)突變體花藥內(nèi)外壁均呈平滑狀而缺乏脂類物質(zhì)，花粉細胞逐漸破碎并降解。遺傳分析表明，whf41突變體的無花粉型雄性不育性狀受一對隱性核基因控制，我們將該基因精細定位于第3染色體短臂XD-5和XD-11兩個標(biāo)記之間，物理距離45.6 kb，其中包含9個開放閱讀框。序列分析顯示該區(qū)間內(nèi)細胞色素P450基因LOC_Os03g07250的第4個外顯子處存在1個單堿基替換和3個堿基的缺失，導(dǎo)致其翻譯序列發(fā)生一個氨基酸的替換(天冬氨酸→甲硫氨酸)和一個氨基酸(纈氨酸)的缺失，致使其功能改變進而出現(xiàn)該表型。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，whf41突變體中CYP704B2和一系列花藥脂質(zhì)合成與轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達水平均發(fā)生了顯著下調(diào)。【結(jié)論】根據(jù)本研究結(jié)果可推斷，OsWHF41是CYP704B2的新等位基因，相關(guān)結(jié)果進一步明確CYP704B2在水稻花藥脂質(zhì)合成與花粉壁形成過程中的重要作用。

水稻；whf41；隱性核雄性不育；基因定位

雄性不育是指雄蕊發(fā)育不正常、不能形成有功能的花粉細胞，但雌蕊發(fā)育正常，能接受正常花粉而受精結(jié)實的現(xiàn)象[1]。根據(jù)其遺傳機制的不同，可將其分為細胞質(zhì)雄性不育、細胞核雄性不育以及核質(zhì)互作雄性不育三類。其中，核雄性不育一般屬于功能性不育，由核基因突變造成，表現(xiàn)為小孢子在發(fā)育過程中出現(xiàn)異常，不能形成有活力的花粉粒甚至無花粉，其突變性狀可通過雌配子或雄配子穩(wěn)定遺傳[2-6]。

水稻作為單子葉植物的模式植物，對其雄性生殖發(fā)育的過程及相關(guān)基因的功能研究就顯得尤為重要。遺傳分析表明，大多數(shù)雄性不育性狀是由隱性核基因突變造成的，目前已有20個以上水稻隱型核不育基因陸續(xù)被克隆[7-8]，但它們在調(diào)控水稻雄性生殖發(fā)育的時期和功能等方面存在很大差異，大致可分為控制小孢子母細胞發(fā)育時期、減數(shù)分裂時期、絨氈層發(fā)育時期、花粉囊和花粉外壁發(fā)育時期以及花藥開裂時期等相關(guān)的基因。第1個被報道控制早期小孢子細胞發(fā)育的基因MSP1(multiple sporocyte 1)，編碼由1294個氨基酸組成的富亮氨酸重復(fù)受體蛋白激酶(LRR receptor-like protein kinase)，該基因主要控制初生壁細胞(PPC,primary parietal cell)和初生造孢細胞(PSC,primary sporogenous cell)的發(fā)育，能抑制孢母細胞的周邊細胞再度分化成孢母細胞，起到控制大、小孢子母細胞數(shù)目的作用，同時影響花粉囊壁的發(fā)育。MSP1缺失或變異將導(dǎo)致水稻花粉徹底敗育而雌蕊發(fā)育正常，小穗完全不育[9]。調(diào)控水稻減數(shù)分裂的基因包括PAIR(pairing aberration in rice)系列基因PAIR1、PAIR2、PAIR3，主要控制同源染色體的聯(lián)會與配對[10-12]；而ZEP1(zeaxanthin epoxidase1)[13]和MEL1[14]主要參與小孢子早期減數(shù)分裂階段染色體的正常濃縮；此外PSS1[15]也是調(diào)控水稻減數(shù)分裂的重要基因，對水稻花藥減數(shù)分裂的染色體動力學(xué)、雄配子形成以及花粉囊開裂具有重要意義。水稻F-box基因MEIOTIC F-BOX(MOF)，對于雄性減數(shù)分裂進程至關(guān)重要，主要活躍在有絲分裂前期Ⅰ的細線期到粗線期，對于雙鏈DNA斷裂的末端處理和修復(fù)至關(guān)重要[16]。已報道的與水稻花藥絨氈層發(fā)育過程相關(guān)的基因主要包括TDR(tapetum degenerationretardation)[17]、UDT1(undeveloped tapetum1)[18]、GAMYB[19]、PTC1(persistent tapetal cell)[20]、API5(apoptosis inhibitor 5)[21]、EAT1(eternal tapetum 1)[22]、TIP2(TDR interacting protein2)[23]，ABCG15[24]以及ABCG26[25]等，這些基因在花藥絨氈層細胞程序性死亡、絨氈層細胞與花藥室之間孢子花粉素的合成和轉(zhuǎn)移以及花粉粒的形成過程中起重要調(diào)控作用。

花粉囊壁外的角質(zhì)蠟質(zhì)等物質(zhì)既是小孢子發(fā)育過程中形成完整內(nèi)部結(jié)構(gòu)的基本保障，又是孢粉素等必需營養(yǎng)物質(zhì)傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；調(diào)控此類物質(zhì)發(fā)育的OsC6[26]、WDA1(wax-defi-cient anther 1)[27]、DPW(defective pollen wall)[28]、DPW2(defective pollen wall 2)[29]等基因的突變都會導(dǎo)致花粉囊蠟質(zhì)顯著減少，花粉粒皺縮，花粉敗育。此外，細胞色素P450基因家族的CYP704B2[30]、CYP703A3[31]通過調(diào)控脂肪酸的ω-羥基化在控制花粉外壁形成方面也起著至關(guān)重要的作用。最后，水稻花藥開裂過程，大約55%的AID1(anther indehiscence1)[32]的隱性突變小穗雖可形成可育的花粉，但花藥不能開裂，并且(或者)花藥隔膜退化和花藥裂口破損導(dǎo)致花藥裂開時間同花期不一致，導(dǎo)致不育。在水稻花藥發(fā)育過程中的各個時期，雄性不育相關(guān)基因功能的正常行使和有序分工保證了花藥每個部分的發(fā)育和小孢子的形成等過程有條不紊地進行。其中，脂質(zhì)代謝在花粉外壁和花粉囊蠟質(zhì)生物合成過程中有重要作用。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，CYP704B2編碼的細胞色素P450蛋白作用C16/C18脂肪酸在ω碳位置發(fā)生羥基化，這些羥基化后的脂肪酸一部分用于絨氈層發(fā)育中的脂質(zhì)代謝/轉(zhuǎn)運，一部分作為花藥發(fā)育過程所需的孢粉素、角質(zhì)的單體，蠟質(zhì)前體物質(zhì)通過后續(xù)一系列相關(guān)基因的調(diào)控最終參與形成花粉外壁和花藥角質(zhì)層。而另一個細胞色素P450蛋白CYP703A3則作為一種鏈式羥化酶，作用于特異底物月桂酸，使其形成七羥基月桂酸；其表達受TDR直接調(diào)控，在水稻花藥表皮角質(zhì)層和花粉外壁的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用；單堿基插入突變體cyp703a3-2花藥中的角質(zhì)單體和蠟質(zhì)組分含量明顯減少，表現(xiàn)為花藥表面角質(zhì)層和花粉外壁發(fā)育缺陷，花藥變小，呈白黃色，無花粉，完全不育。

水稻雄配子體發(fā)育過程的調(diào)控機制廣泛，內(nèi)容復(fù)雜，目前對其并未了解透徹。本研究中，我們對一個無花粉型雄性不育突變體whf41進行了花藥發(fā)育過程的初步探究，并對該雄性不育基因進行了定位與克隆，以期更詳細全面地了解水稻雄配子體發(fā)育的分子機制，為未來利用制種技術(shù)[33-34]將隱性核雄性不育株系應(yīng)用在雜交水稻育種生產(chǎn)中提供理論基礎(chǔ)和基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及田間管理

秈型水稻恢復(fù)系中恢8015經(jīng)60Co-γ輻射誘變，在其M1代中分離鑒定出一個無花粉型雄性不育突變體whf41，通過挖稻樁的方式進行材料保存。2013年春季，在海南陵水以whf41為母本，分別與野生型和粳稻品種02428配制雜交組合，獲得BC1F1和F1種子；夏季在中國水稻研究所富陽實驗基地種植BC1F1和F1并觀察其表型，單株收獲種子。2014年夏季在浙江富陽種植BC1F2和F2群體，統(tǒng)計突變型與野生型的分離比，用于遺傳分析和基因定位。所有親本材料于2014年夏季種植于中國水稻研究所富陽實驗基地，種植管理與大田生產(chǎn)相同。

1.2 花粉育性調(diào)查

開花當(dāng)日，田間取回野生型和突變體的穎花，在高級立體熒光顯微鏡(德國蔡司，型號為SteRED Lumar V12)下觀察野生型和突變體的花藥表型并拍照。參照Sun[35]的方法用1%I2-KI溶液進行花藥和花粉染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 花藥發(fā)育的半薄切片觀察

取野生型和突變體不同發(fā)育時期的小花，于FAA固定液(V38%甲醛∶V冰乙酸∶V50%乙醇=90∶5∶5)中固定24 h后，梯度酒精脫水、飽和番紅溶液中處理2～3 h，再采用Technovit 7100樹脂滲透包埋，60℃恒溫烘烤4～5 d。于半薄切片機(德國徠卡,微系統(tǒng)型號為RM2265)上橫切花藥，切片厚度為2 μm，甲苯胺藍染色后用光學(xué)顯微鏡(德國徠卡,微系統(tǒng)型號為DM2000)觀察拍照[28]。

1.4 掃描電鏡觀察

用鑷子將突變體的花藥從穎殼中剝出，迅速置于2.5%戊二醛中，4℃固定24 h。用0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)沖洗3次，每次10 min，經(jīng)過30%、50%、70%、80%、90%乙醇分別脫水10～15 min后，再用無水乙醇脫水兩次，每次20 min，乙酸異戊酯置換20～30 min后，CO2臨界點干燥，真空鍍膜后在掃描電鏡(日立臺式電鏡TM-1000)上選擇不同倍數(shù)視野下觀察、拍照并記錄結(jié)果。

1.5 DNA的提取和基因定位

用簡易的CTAB法分單株提取野生型、whf41突變體以及F2群體中突變型單株的DNA[28]。檢測本實驗室保存的SSR標(biāo)記和InDel標(biāo)記[36-37]在中恢8015和02428之間的多態(tài)性，選取133對平均分布于水稻12條染色體上的多態(tài)引物對8株突變型單株進行染色體連鎖分析，進一步利用78個突變性單株對突變?yōu)辄c進行初步定位。根據(jù)Gramene(http://www.gramene.org)中公布的日本晴和9311的全基因組序列，對初定位區(qū)間內(nèi)的基因組序列進行對比，尋找插入/缺失位點，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計新的InDel分子標(biāo)記，對突變基因進行精細定位，所用引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

PCR擴增采用北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司的10 μL反應(yīng)體系：模板DNA 1 μL、引物(20 μmol/L)1 μL、2×Taq PCR無色混合液5 μL、ddH2O 3 μL；PCR程序如下：94℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性30 s，58℃下退火30 s，72℃下延伸45 s，共計32個循環(huán)；最后72℃下延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.1% AgNO3染色，甲醛和NaOH顯色后拍照并統(tǒng)計帶型。

1.6 候選基因分析

在水稻基因組注釋計劃數(shù)據(jù)庫(http://rapdb. dna.affrc.go.jp)中查閱精細定位區(qū)間內(nèi)的所有開放閱讀框，并對可能的候選基因進行分析。根據(jù)候選基因的全長基因組序列，設(shè)計測序引物(由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成)，采用高保真DNA聚合酶KOD-FX分別擴增突變體whf41和野生型的全部候選基因，PCR產(chǎn)物送往杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果通過Contig Express軟件拼接，并用DNAStar-MegAlign進行序列比對，從而確定突變位點。

1.7 實時熒光定量PCR分析

采用TOYOBO公司的包含去基因組酶的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit)，分別提取野生型和突變體處于花藥發(fā)育第8、9、11和12期等4個時期的花藥總RNA，以O(shè)ligo(dT)18為反應(yīng)引物進行第1鏈cDNA合成。利用qPCR分析調(diào)控花藥發(fā)育的關(guān)鍵基因CYP704B2、CYP703A3、GAMYB、WDA1、OsC4、OsC6以及CYP704家族的兩個基因(LOC-Os04g48460和LOC-Os06g03930)在野生型和突變體中的表達量。實時熒光定量PCR體系(20 μL)包括蒸餾水6.4 μL、2×SYBR qPCR混合液10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、cDNA模板2 μL，每個樣品3個重復(fù)。PCR擴增程序為95℃下30 s；95℃下5 s，58℃下30 s，72℃下15 s，共計35個循環(huán)。

表1 本研究所用引物Table 1.Primers used in the research.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體表型分析

突變體whf41的營養(yǎng)生長及其主要農(nóng)藝性狀與其野生型中恢8015基本無顯著差異，而且突變體的花器官組成和幼穗發(fā)育進程也與野生型基本相同。唯一的差異在于，野生型的花藥飽滿呈金黃色，而突變體的花藥瘦小呈透明乳白色(圖1-A、B)?；ǚ坨R檢結(jié)果也顯示，野生型中恢8015的花藥內(nèi)充滿成熟的花粉粒，且為典型的飽滿圓形、能被I2-KI完全染色成深黑色(圖1-C、D)，表明野生型花粉育性正常；而突變體whf41花藥經(jīng)過染色壓片顯示，其花藥內(nèi)室為空腔，并無花粉粒釋放出來，花粉細胞I2-KI染色也并未發(fā)現(xiàn)花粉粒細胞，完全不育(圖1-C、D)。

2.2 花藥半薄切片分析

野生型和突變體在花藥發(fā)育過程中的細胞學(xué)差異主要通過花藥半薄橫切來觀察。張大兵等[4]將花藥發(fā)育過程劃分為14個時期，在whf41中，突變體花藥發(fā)育形態(tài)在第1～8期與野生型均無顯著差異，花粉母細胞進行正常的減數(shù)分裂并形成四分體(圖2-A、F)。但在第9期，野生型小孢子細胞(花粉粒)從四分體中分離，絨氈層濃縮且染色加深，中間層逐漸消失不見(圖2-B)；然而在此時期的whf41突變體花藥中，小孢子細胞(花粉粒)雖正常分離，但絨氈層皺縮不明顯(圖2-G)。到第10期，野生型小孢子細胞(花粉粒)逐漸由液泡化形態(tài)轉(zhuǎn)變成去液泡化狀態(tài)，花粉外壁形成，絨氈層繼續(xù)降解(圖2-C)；而突變體whf41花藥內(nèi)小孢子細胞(花粉粒)并未發(fā)生液泡化，呈現(xiàn)的形態(tài)是花粉細胞破碎、發(fā)育中止，無花粉外壁結(jié)構(gòu)，絨氈層開始膨脹，顏色變淺(圖2-H)。至第11期，野生型小孢子經(jīng)過一次不對稱的有絲分裂形成一個生殖細胞和一個營養(yǎng)細胞(圖2-D)，但突變體whf41的花藥膨脹、絨氈層和破碎的花粉細胞碎片混為一體(圖2-I)。最終到了第12期，野生型的二胞花粉又經(jīng)過一次有絲分裂形成兩個精核，至此，形成了由兩個精核和一個營養(yǎng)核組成的成熟花粉粒(圖2-E)；但在whf41突變體的花藥中，膨脹的絨氈層和花粉細胞碎片逐漸充滿藥室，花藥形狀由原來的圓形變成橢圓形，并在后續(xù)發(fā)展階段一直保持此種狀態(tài)(圖2-J)。

圖1 野生型中恢8015(WT)與突變體whf41的表型分析Fig.1.Phenotypic comparison of wild type Zhonghui 8015(WT)and the whf41 mutant.

圖2 野生型中恢8015和whf41突變體野生型不同發(fā)育時期花藥半薄橫切觀察Fig.2.Transverse section of anthers of the wild type and whf41 at different developmental stages.

2.3 花藥和花粉外壁的掃描電鏡觀察

圖3 野生型和whf41花藥和花粉結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察Fig.3.SEM observation of the anther and pollen grains in wild type and the whf41 mutant.

表2 whf41突變位點的遺傳分析Table 2.Genetic analysis of the whf41 locus.

為更細致了解whf41花藥和花粉發(fā)育畸形的特點，我們采用掃描電鏡對野生型中恢8015和whf41突變體第13期的花藥內(nèi)外壁和花粉外表面進行了詳細的觀察、比較和分析。由圖3可以看出，突變體whf41的花藥較野生型明顯短小，且從花藥外表皮結(jié)構(gòu)來看，野生型的成熟花藥表面較為飽滿，由線狀物質(zhì)組成；而突變體花藥外表面呈光滑圓潤狀態(tài)，蠟質(zhì)和角質(zhì)等線狀物質(zhì)排列明顯平滑(圖3-A～D，G、H)；更明顯的是，野生型成熟花藥的內(nèi)壁的烏氏體單體等結(jié)構(gòu)分布均勻且結(jié)構(gòu)規(guī)則，表面光滑，前烏氏體結(jié)構(gòu)暴露于藥室，而突變體的內(nèi)壁仍然是光滑平面狀態(tài)，只存在極小的小孔，而未觀察到烏氏體和孢粉素等物質(zhì)(圖3-E、F和I、J)。進一步對野生型和whf41的花粉結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，野生型的花粉粒呈飽滿的圓球狀，其外表皮質(zhì)地均勻且孢粉素充分得以利用，并以相對規(guī)則的顆粒形式積累(圖3-K、M、O)，而whf41突變體的花粉明顯小于野生型，且為皺縮的干癟狀，緊貼在平滑的花藥內(nèi)壁上(圖3-L)，進一步放大倍數(shù)對第13期花粉外壁進行觀察發(fā)現(xiàn)，whf41花粉外壁存在顯著地裂縫，而且越往后期越明顯(圖3-N、P)，這很可能是因為突變體內(nèi)的花粉粒細胞由于營養(yǎng)不足而最終逐漸斷裂、破碎并消化，最終溶入花藥內(nèi)室，這與半薄切片觀察結(jié)果一致。進一步證明，突變體的花藥內(nèi)壁的物質(zhì)和花粉外壁的孢粉素、烏氏體合成與轉(zhuǎn)運均產(chǎn)生了障礙。

2.4 突變體遺傳分析

以whf41為母本，分別與02428和中恢8015配制雜交組合，得到F1和BC1F1家系，對其花藥、花粉和小穗育性進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)其F1植株花粉育性和小穗育性均正常；經(jīng)卡方檢驗，F(xiàn)2群體中的野生型與突變型植株數(shù)量的比值，符合3∶1的遺傳分離比(表2)。同期，我們還統(tǒng)計了野生型中恢8015和02428雜交BC1F1代結(jié)實率及其F2群體內(nèi)的所有單株，其中并未發(fā)現(xiàn)無花粉型雄性不育植株(表2)。以上情況表明whf41的突變性狀受一對隱性核基因控制的，且與遺傳背景無關(guān)。

圖4 突變基因的圖位克隆Fig.4.Positional cloning of the whf41 mutated gene.

2.5 目的基因的定位與序列分析

為定位控制突變體whf41無花粉性狀的雄性不育基因，選取了平均分布于12條染色體上的133對多態(tài)性引物，利用78株突變型單株將控制該性狀的基因初步定位于第3染色體短臂上的InD40到InD41兩個InDel標(biāo)記之間，物理距離490 kb(圖4-A)。進一步擴大定位群體后，并參考Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/)公布的日本晴和9311全基因組序列，在這兩個標(biāo)記之間設(shè)計了InDel標(biāo)記，最終將目的基因定位于XD-5和XD-11標(biāo)記之間，物理距離為45.6 kb(圖4-B)。

根據(jù)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和水稻基因組注釋計劃數(shù)據(jù)庫(http://rapdb.dna.affrc.go. jp)提供的水稻基因組注釋序列，在XD-5和XD-11兩個標(biāo)記之間的45.6 kb區(qū)間內(nèi)包含9個注釋基因(圖4-C)。對突變體中此候選區(qū)域的ORF進行功能預(yù)測、擴增PCR產(chǎn)物直接回收測序并與野生型測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)，其中LOC_Os03g07250基因的第4外顯子區(qū)發(fā)生了1個堿基的替換和緊接著的3個堿基的缺失。該閱讀框為一個細胞色素P450氧化還原酶基因，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成(圖4-D)，全長2.332 kb，編碼區(qū)長度1.635 kb，編碼一個由544個氨基酸組成、含有跨膜結(jié)構(gòu)域的細胞色素P45家族蛋白。在whf41突變體中，該基因從ATG開始的第1273位置發(fā)生了一個由G到A的單堿基替換，緊接著從第1274個堿基開始發(fā)生了3個堿基的缺失，導(dǎo)致接下來翻譯的多肽鏈中出現(xiàn)一個氨基酸的替換(天冬氨酸→甲硫氨酸)和一個氨基酸(纈氨酸)的缺失(圖4-E)，此突變可能導(dǎo)致其蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而失去原有的功能。因此，whf41的候選基因很有可能是LOC_Os03g07250。

2.6 花藥發(fā)育相關(guān)基因的表達分析

圖5 野生型與whf41突變體中水稻花藥發(fā)育相關(guān)基因的表達Fig.5.Expression profile of the genes involved in anther development in wild type and whf41 plants.

通過qPCR分析比較了whf41與野生型中已克隆的相關(guān)隱性核不育基因的相對表達量，包括細胞色素P450家族基因CYP704B2、CYP703A3及CYP704B2在水稻中的同源基因LOC_Os04g48460、LOC_Os06g03930、調(diào)控花藥絨氈層PCD的GAMYB、調(diào)控花粉蠟質(zhì)形成的WDA1、調(diào)控花藥脂質(zhì)轉(zhuǎn)移的基因OsC4和OsC6。如圖5所示，除了LOC-Os04g48460在whf41突變體中花藥發(fā)育中后期的表達量有所提高以外，其他基因在突變體whf41的第9期之后其相對表達量均顯著降低。與前文半薄切片和掃描電鏡觀察結(jié)果一致，這些表達模式的變化進一步證實了whf41突變體中LOC_Os03g07250的突變在花藥內(nèi)外壁和花粉發(fā)育過程中角質(zhì)和蠟質(zhì)等脂肪酸的合成與轉(zhuǎn)運中的重要作用。但突變體中LOC-Os04g48460的表達量在花藥發(fā)育后期卻有略微的上調(diào)，推測其可能存在一定的反饋調(diào)節(jié)，但仍需進一步驗證。

3 討論

本研究對一個無花粉型雄性不育突變體whf41進行了表型分析和基因定位，結(jié)果表明，該突變體受一對隱性核基因控制，位于第3染色體短臂的XD-5和XD-11兩個標(biāo)記之間，物理距離45.6 kb。該區(qū)域中的細胞色素P450家族基因LOC-Os03g07250內(nèi)第4外顯子的1個單堿基替換和隨后的3個堿基的缺失導(dǎo)致該基因蛋白序列發(fā)生1個氨基酸的替換和1個氨基酸缺失，導(dǎo)致該基因在突變體花藥發(fā)育后期表達量顯著下調(diào)，可能是引起whf41突變無花粉表型的原因。

本研究中的無花粉型雄性不育突變體whf41與之前報道的cyp704b2表型相似[30]，但二者的表型和突變位點均存在明顯差異。cyp704b2突變體，由粳稻9522輻射誘變得來，雖然也是由LOC-Os03g07250基因的突變導(dǎo)致，但該突變體中LOC-Os03g07250基因的第4外顯子之前(1-1112 bp)及其外啟動子部分和后一開放閱讀框(LOC-Os03g07260)的258 bp全部缺失，共3.1 kb，導(dǎo)致其蛋白序列出現(xiàn)了大片段的氨基酸缺失。而本研究中的whf41突變體由秈稻恢復(fù)系輻射誘變而來，其突變位置僅發(fā)生在該基因的第4外顯子(包含1個堿基和隨后的3個堿基的缺失)，導(dǎo)致蛋白序列出現(xiàn)1個氨基酸的替換和1個氨基酸的缺失。從表型上看，cyp704b2花藥變小且呈淡黃色，表達分析結(jié)果顯示該基因在花藥發(fā)育的第8～10期的絨氈層和小孢子中特異表達[30]，至花藥發(fā)育的第10期，小孢子發(fā)育就終止并與絨氈層一起充滿花藥內(nèi)腔。而本研究中whf41突變體內(nèi)的花藥則更加瘦小且呈透明的乳白色，可見其表型更加明顯；花藥半薄切片結(jié)果也表明，突變體whf41減數(shù)分裂正常，能形成正常的四分體和小孢子(圖2-F)，最明顯的突變從花藥發(fā)育的第9期開始，whf41中的小孢子液泡化不明顯且表面不能形成花粉外壁，絨氈層細胞異常膨脹，中間層并未降解，后續(xù)過程中絨氈層未進行正常的PCD過程，而且小孢子細胞開始破裂，并未發(fā)生液泡化，退化的小孢子碎片(DM)與膨脹的絨氈層逐漸融合并充滿整個花藥腔室，該過程一直持續(xù)到第12期。掃描電鏡結(jié)果也進一步顯示，本文中無花粉型雄性不育突變體whf4中的花粉細胞外壁破碎及降解是發(fā)生在有絲分裂后期(第11期和第12期)，且一直延續(xù)至花粉粒成熟期，甚至花藥內(nèi)壁也呈平滑狀而缺乏孢粉素等成分，因此，其異常發(fā)育過程比cyp704b2更久且徹底，是該基因一個敗育更加徹底的等位突變體?？梢?，LOC-Os03g07250不同位點發(fā)生突變對水稻花藥和花粉發(fā)育過程的影響具有一定差異。

水稻中已發(fā)現(xiàn)的有功能的植物細胞色素P450家族基因有300多個，植物細胞色素P450具有廣泛的催化活性，其催化作用的共同特點是在作用物分子中加入一個氧原子，其主要功能是參與生物合成和生物解毒途徑[38]。CYP704B2屬于植物Ⅰ型細胞色素P450家族蛋白基因，其蛋白酶主要催化代謝外源底物，具有E類基因功能，參與花藥角質(zhì)層、小孢子外壁形成所需脂肪酸的羥基化過程[38]，whf41突變體花藥內(nèi)外壁以及花粉外壁破碎、降解和異化證實了此結(jié)論。qRT-PCR結(jié)果表明LOC-Os03g07250的突變對花藥發(fā)育過程絨氈層發(fā)育和花藥囊壁角質(zhì)蠟質(zhì)成分發(fā)育相關(guān)基因的表達量均顯著下調(diào)。但突變體中的另一個CYP704A3基因(LOC-Os04g48460)的表達量在花藥發(fā)育后期卻有略微的上調(diào)，該基因主要參與調(diào)控幼穗發(fā)育，與粒長有關(guān)[39]，推測該基因與CYP704B2可能存在一定的反饋調(diào)節(jié)，但仍需進一步驗證。上述結(jié)果證明，植物細胞色素P450家族基因CYP704B2對于水稻花藥囊壁角質(zhì)層、花粉外壁以及絨氈層程序性死亡等過程具有重要意義。此外，依據(jù)最新報道的雄性不育雜交體系和種子生產(chǎn)技術(shù)[33-34]，未來我們也可進行相關(guān)試驗，將OsWHF41與特異的花粉致死基因和熒光蛋白基因串聯(lián)，采用熒光標(biāo)記篩選、批量生產(chǎn)而獲得非轉(zhuǎn)基因的雄性不育系，既避免光溫影響，可靠性顯著提高，有效解決水稻隱性核雄性不育材料的制繁種難題，又可擴大父本選擇范圍，增加未來水稻雜種優(yōu)勢利用的選擇空間，而且該技術(shù)體系獲得的雄性不育系不帶有任何轉(zhuǎn)基因成分、制種產(chǎn)量和純度大大提高。因此，本研究可為未來利用該技術(shù)進行隱性核雄不育系的雜交水稻育種新途徑提供理論基礎(chǔ)和新的基因資源。

[1]朱英國.水稻雄性不育生物學(xué).武漢:武漢大學(xué)出版社,2000:1-2. Zhu Y G.Biology of Male Sterility in Rice.Wuhan: Wuhan University Press,2000:1-2.(in Chinese)

[2]Raghavan V.Anther developmental biology in molecular embryology of flowering plants.Plant Physiol,1997: 17-60.

[3]Ma H.Molecular genetic analyses of microsporogenesis and microgametogenesis in flowering plants.Annu Rev Plant Boil,2005,56:393-434.

[4]Zhang D B,Wilson Z A.Stamen specification and anther development in rice.Chin Sci Bull,2009,54:2342-2353.

[5]Zhang D B,Luo X,Zhu L.Cytological analysis and genetic control of rice anther development.J Gen Genom, 2011,38(9):379-390.

[6]Kinoshita T.Gene symbols and information on male sterility.Rice Genet Newsl,1997,14:13-22.

[7]Okamuro J K,Boer B G,Jofuku K D.Regulation of Arabidopsis flower development.Plant Cell,1993,5: 1183-1193.

[8]馬西青,方才臣,鄧聯(lián)武,萬向元.水稻隱性核雄性不育研究進展及育種應(yīng)用探討.中國水稻科學(xué)，2012, 25(5):511-520. Ma X Q,Fang C C,Deng L W,Wan X Y.Research progress and breeding application of recessive genic male sterility gene in rice.Chin J Rice Sci,2012,25(5): 511-520.(in Chinese with English abstract)

[9]Nonomura K I,Miyoshi K,Eiguchi M,Suzuki T,Miyao A,Hirochika H,Kurata N.The MSP1 gene is necessary to restrict the number of cells entering into male and female sporogenesis and to initiate anther wall formation in rice.Plant Cell,2003,15(8):1728-1739.

[10]Nonomura K I,Nakano M,Fukuda T,Eiguchi M,Miyao A,HirochikaH,KurataN.Thenovelgene HOMOLOGOUSPAIRINGABERRATIONINRICE MEIOSIS1 of rice encodes a putative coiled-coil protein required for homologous chromosome pairing in meiosis. Plant J,2004,16(4):1008-1020.

[11]Nonomura K I,Nakano M,Murata K,Miyoshi K, Eiguchi M,Miyao A,Hirochika H,Kurata N.An insertional mutation in the rice PAIR2 gene,the ortholog of Arabidopsis ASY1,results in a defect in homologous chromosome pairing during meiosis.Mol Gen Genom, 2004,271(2):121-129.

[12]Yuan W Y,Li X W,Chang Y X,Wen R Y,Chen G X, Zhang Q F,Wu C.Mutation of the rice gene PAIR3 results in lack of bivalent formation in meiosis.Plant J, 2009,59(2):303-315.

[13]Wang M,Wang K J,Tang D,Wei C X,Li M,Shen Y, Chi Z C,Gu M H,Cheng Z K.The central element protein ZEP1 of the synaptonemal complex regulates the number of crossovers during meiosis in rice.Plant Cell, 2010,22:417-430.

[14]Nonomura K,Morohoshi A,Nakano M,Eiguchi M, Miyao A,Hirochika H,Kurata N.A germ cell-specific gene of the ARGONAUTE family is essential for the progression of premeiotic mitosis and meiosis during sporogenesis in rice.Plant Cell,2007,19(8):2583-2594.

[15]Wang C,Yue W,Ying Y,Wang S,Secco D,Liu Y, Whelan J,Tyerman S D,Shou H.Rice SPX-Majorfacilitysuperfamily3,avacuolarphosphateefflux transporter,isinvolvedinmaintainingphosphate homeostasisinrice.PlantPhysiol,2015,169(4): 2822-2831.

[16]He Y,Wang C,Higgins J D,Yu J,Zong J,Lu P,Zhang D,Liang W.MEIOTIC F-BOX is essential for male meiotic DNA double-strand break repair in rice.Plant Cell,2016,28(8):1879-1893.

[17]Li L,Li Y,Song S,Deng H,Li N,Fu X,Chen G,Yuan L. An anther development F-box(ADF)protein regulated by tapetum degeneration retardation(TDR)controls rice anther development.Planta,2015,241(1):157-166.

[18]Jung K H,Han M J,Lee Y S,Kim Y W,Hwang I,Kim M J,Kim Y K,Nahm B H,An G.Rice Undeveloped Tapetum1isamajorregulatorofearlytapetum development.Plant Cell,2005,17(10):2705-2722.

[19]Liu Z,Bao W,Liang W,Yin J,Zhang D.Identification of gamyb-4 and analysis of the regulatory role of GAMYB in rice anther development.J Integr Plant Biol,2010,52(7): 670-678.

[20]Li H,Yuan Z,Vizcay-Barrena G,Yang C,Liang W, Zong J,Wilson Z A,Zhang D.PERSISTENT TAPETAL CELL1 encodes a PHD-Finger protein that is required for tapetal cell death and pollen development in rice.Plant Physiol,2011,156(2):615-630.

[21]Li X,Gao X,Wei Y,Deng L,Ouyang Y,Chen G,Li X, Zhang Q,Wu C.Rice APOPTOSIS INHIBITOR5 coupled withtwoDEAD-boxadenosine5′-triphosphatedependent RNA helicases regulates tapetum degeneration. Plant Cell,2011,23(4):1416-1434.

[22]Niu N,Liang W,Yang X,Jin W,Wilson Z A,Hu J, Zhang D.EAT1 promotes tapetal cell death by regulating aspartic proteases during male reproductive development in rice.Nat Comm,2013,4:1445.

[23]Fu Z,Yu J,Cheng X,Zong X,Xu J,Chen M,Li Z, Zhang D,Liang W.The rice basic Helix-Loop-Helix transcription factor TDR INTERACTING PROTEIN2 is a central switch in early anther development.Plant Cell, 2014,26(4):1512-1524.

[24]Niu B X,He F R,He M,Ren D,Chen L T,Liu Y G.The ATP-binding cassette transporter OsABCG15 is required for anther development and pollen fertility in rice.J Integr Plant Biol,2013,55(8):710-720.

[25]Zhao G,Shi J,Liang W,Xue F,Luo Q,Zhu L,Qu G, Chen M,Schreiber L,Zhang D.Two ATP binding cassette G transporters,rice ATP binding cassette G26 and ATP binding cassette G15,collaboratively regulate rice male reproduction.Plant Physiol,2015,169(3): 2064-2079.

[26]Zhang D,Liang W,Yin C,Zong J,Gu F,Zhang D.OsC6, encodingalipidtransferprotein,isrequiredfor postmeiotic anther development in rice.Plant Physiol, 2010,154(1):149-162.

[27]Jung K H,Han M J,Lee D Y,Lee Y S,Schreiber L, Franke R,Faust A,Yephremov A,Saedler H,Kim Y W, Hwang I,An G.Wax-Deficient Anther1 is involved in cuticle and wax production in rice anther walls and is required for pollen development.Plant Cell,2006,18(11): 3015-3032.

[28]Shi J,Tan H,Yu X H,Liu Y,Liang W,Ranathunge K, Franke R B,Schreiber L,Wang Y,Kai G,Shanklin J,Ma H,Zhang D.Defective Pollen Wall is required for anther and microspore development in rice and encodes a fatty acyl carrier protein reductase.Plant Cell,2011,23(6): 2225-2246.

[29]Xu D W,Shi J X,Rautengarten C,Yang L,Qian X L, Uzair M,Zhu L,Luo Q,An G,Wa?mann F,Schreiber L, Heazlewood J L,Scheller H V,Hu J P,Zhang D B,Liang W Q.Defective Pollen Wall 2(DPW2)encodes an acyl transferase required for rice pollen development.Plant Physiol,2017,173(1):240-255.

[30]Li H,Pinot F,Sauveplane V,Werck-Reichhart D,Diehl P, Schreiber L,Franke R,Zhang P,Chen L,Gao Y,Liang W,ZhangD.CytochromeP450familymember CYP704B2 catalyzes the ω-hydroxylation of fatty acids and is required for anther cutin biosynthesis and pollen exine formation in rice.Plant Cell,2010,22(1):173-190.

[31]Yang X,Wu D,Shi J,He Y,Pinot F,Grausem B,Yin C, Zhu L,Chen M,Luo Z,Liang W,Zhang D.Rice CYP703A3,a cytochrome P450 hydroxylase,is essential for development of anther cuticle and pollen exine.J Integr Plant Biol,2014,56(10):979-994.

[32]Zhu Q H,Ramm K,Shivakkumar R,Dennis E S, Upadhyaya N M.The ANTHER INDEHISCENCE1 gene encoding a single MYB domain protein is involved in anther development in rice.Plant Physiol,2004,135(3): 1514-1525.

[33]Kent B,Erin C,Nina D,David H,Young J K,Zhong Cathy X Y.Plant genomic DNA flanking SPT event and methods for identifying SPT event.United States Patent, US008257930B2,20120904.

[34]Chang Z Y,Chen Z F,Wang N,Xie G,Lu J W,Yan W, Zhou J L,Tang X Y,Deng X W.Construction of a male sterility system for hybrid rice breeding and seed production using a nuclear male sterility gene.Proc Natl Acad Sci USA,2016,113(49):14145.

[35]Sun L P,Zhang Y X,Zhang P P,Yang Z F,Zhan X D, Shen X H,Zhang Z H,Hu X,Xuan D D,Wu W X,Li Z H,Cao L Y,Cheng S H.K-Domain splicing factor OsMADS1 regulates open hull male sterility in rice.Rice Sci,2015,22(5):207-216.

[36]Orjuela J,Garavito A,Bouniol M,Arbelaez J D,Moreno L,Kimball J,Wilson G,Rami J F,Tohme J,McCouch S R,Lorieux M.A universal core genetic map for rice. Theor Appl Genet,2010,120:563-572

[37]Wu D H,Wu H P,Wang C S,Tseng H Y,Hwu K K. Genome-wide InDel marker system for application in rice breeding and mapping studies.Euphytica,2013,192: 131-143

[38]Yamanaka S,Suzuki E,Tanaka M,Takeda Y,Watanabe J A,Watanabe K N.Assessment of cytochrome P450 sequences offers a useful tool for determining genetic diversity in higher plant species.Theor Appl Genet,2003, 108(1):1-9.

[39]Tang W,Wu T,Ye J,Sun J,Jiang Y,Yu J,Tang J,Chen G,Wang C,Wan J.SNP-based analysis of genetic diversity reveals important alleles associated with seed size in rice.BMC Plant Biol,2016,16(1):93.

Characterization and Gene Mapping of a No-pollen Genic Sterile Mutant whf41 in Rice

XUAN Dandan#,SUN Lianping#,ZHANG Peipei,ZHANG Yingxin,WU Weixun,YANG Zhengfu, ZHAN Xiaodeng,SHEN Xihong,CAO Liyong*,CHENG Shihua*

(China National Rice Research Institute/State Key Laboratory of Rice Biology/Key Laboratory for Zhejiang Super Rice Research,Hangzhou 311401;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author,E-mail:caolycgf@mail.hz.zj.cn,shcheng@mail.hz.zj.cn)

【Objective】The anther cuticle and wax layer act as structural support and protective barriers for the development of pollen sac in rice.Phenotypic analysis and genetic mapping of the related genes can provide genetic resources and lay theoretical basis for further cloning and molecular mechanism analysis.【Method】We identified a no-pollen male sterile mutant whf41 from the mutant progeny of60Co-γ-treated indica cultivar Zhonghui 8015.Anthers of the wild-type and whf41 mutant at different development stages were fixed for transverse section analysis and mature anthers of which were randomly selected for scanning electron microscopy analysis.BC1F1,F1lines and BC1F2,F2populations derived from whf41/Zhonghui 8015 and whf41/02428 were used for genetic analysis and fine-mapping of the mutation site.【Result】Comparing with wild type，the whf41 mutant exhibited thin and transparent milky anther without mature pollen grains.Transverse section analysis showed that the whf41 mutant displayed aborted pollen grains，none detectable exine and swollen tapetal layer without expected PCD(programmed cell death),finally resulting in fragments of tapetal layer and pollen grains in the chamber.Scanning electron microscopy analysis further revealed the mutant had smoother anther wall,fewer lipids both on the inner and outer sides and fragments of degragated pollens. Genetic analysis revealed that whf41 was controlled by a single recessive genic gene,which was fine-mapped to a 45.6-kb region that harbored nine Open Reading Frames(ORFs)on the short arm of chromosome 3 between markers XD-5 and XD-11.Sequence analysis revealed that the whf41 mutant carried a nucleotide substitution and three nucleotide deletion,which led a substitution of one amino acid(D to M)and a deletion of one amino acid(V)in the fourth exon of one Cytochrome P450 family gene,LOC_Os03g0725,which is named as OsWHF41 and probably responsible for the no-pollen male sterility phenotype.Furthermore,qPCR analysis showed that the expression level of CYP704B2 and seven anther lipid synthesis and transportation related regulators changed significantly in whf41.【Conclusion】Based on all these results,we deduced that the OsWHF41 gene was a new allelic to CYP704B2 gene and this further confirmed the important role of CYP704B2 in anther lipid synthesis and pollen exine formation.

rice;whf41;recessive genic male sterility;gene mapping

Q343.5;S511.01

：A

：1001-7216-(2017)03-0247-10

2016-12-01；修改稿收到日期：2017-02-06。

國家公益性農(nóng)業(yè)科技研究專項(20140302,20150308)；國家轉(zhuǎn)基因重大專項(2014ZX08001-002)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程超級稻育種創(chuàng)新團隊、水稻雜種優(yōu)勢研究機理研究創(chuàng)新團隊資助項目(CAAS-ASTIP-2013-CNRRI)。