沈蘭李健付亞萍王俊杰華宇峰焦曉真嚴(yán)長(zhǎng)杰王克劍,*

(1揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)/江蘇省現(xiàn)代糧食作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009；2中國(guó)水稻研究所水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006；3連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇連云港222000；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人，E-mail：cjyan@yzu.edu.cn；wangkejian@caas.cn)

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向改良水稻粒長(zhǎng)和穗粒數(shù)性狀

沈蘭1,2,#李健3,#付亞萍2王俊杰2華宇峰2焦曉真2嚴(yán)長(zhǎng)杰1,*王克劍2,*

(1揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)/江蘇省現(xiàn)代糧食作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009；2中國(guó)水稻研究所水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006；3連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇連云港222000；#共同第一作者；*通訊聯(lián)系人，E-mail：cjyan@yzu.edu.cn；wangkejian@caas.cn)

【目的】基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)已成為分子育種的重要手段。本研究擬對(duì)GS3和Gn1a功能缺失突變對(duì)目標(biāo)性狀的改良效應(yīng)進(jìn)行分析，以期為培育高產(chǎn)水稻提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坷肅RISPR/Cas9系統(tǒng)，以控制粒型基因GS3和控制每穗粒數(shù)基因Gn1a為編輯對(duì)象，構(gòu)建了共敲除載體pC1300-2×35S::Cas9-gGS3-gGn1a，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化4個(gè)優(yōu)質(zhì)水稻品種，分析了基因突變的特征和相應(yīng)農(nóng)藝性狀?！窘Y(jié)果】構(gòu)建的敲除載體成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)GS3和Gn1a基因的定點(diǎn)編輯。在4個(gè)轉(zhuǎn)化受體的T0代均分別獲得了gs3和gs3gn1a的移碼突變體。對(duì)T1代中無(wú)選擇標(biāo)記突變體的農(nóng)藝性狀分析表明，突變體gs3和gs3gn1a與野生型相比粒長(zhǎng)變長(zhǎng)，千粒重增加；突變體gs3gn1a與突變體gs3相比，每穗粒數(shù)顯著增加?！窘Y(jié)論】利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行水稻基因編輯可以快速改良品種的目標(biāo)性狀，在水稻品種的定向改良方面具有巨大的潛力。

CRISPR/Cas9；基因編輯；水稻；GS3；Gn1a

在傳統(tǒng)水稻品種改良過(guò)程中，常見(jiàn)的方法是通過(guò)雜交、回交的方式將目標(biāo)基因?qū)胧荏w品種，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因的聚合。然而，傳統(tǒng)的育種方法周期長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)耗力；加上不可避免存在連鎖累贅，在將目標(biāo)基因?qū)霑r(shí)往往會(huì)帶入其他不利基因，因而育種的效率較低。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的定點(diǎn)修飾，克服傳統(tǒng)育種中的連鎖累贅，將會(huì)大大提高育種的效率。近年來(lái)，基因組編輯技術(shù)的興起，為水稻實(shí)現(xiàn)基因的編輯帶來(lái)了新的契機(jī)?；蚪M定點(diǎn)編輯技術(shù)是通過(guò)編碼核酸酶切割基因組特定位點(diǎn)，進(jìn)而誘導(dǎo)基因組定點(diǎn)突變。近幾年由微生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)展而來(lái)的一種基因編輯工具CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系統(tǒng)[1-3]已經(jīng)在微生物[1,4,5]、動(dòng)物[6-10]和植物[11-14]中得到廣泛應(yīng)用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要包括Cas9蛋白和sgRNA兩個(gè)重要組分，sgRNA主要識(shí)別靶向的DNA序列并引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)識(shí)別的位點(diǎn)進(jìn)行切割，引起DNA雙鏈斷裂，并通過(guò)非同源重組方式和同源重組方式對(duì)DNA雙鏈斷裂進(jìn)行修復(fù)形成堿基插入、堿基缺失、堿基替換等突變類型。Shan等[3]利用CRISPR/Cas9技術(shù)首次成功地編輯水稻OsPDS-P1和OsBADH2基因；Wang等[15]結(jié)合同尾酶連接的原理建立水稻中CRISPR/Cas9多基因敲除系統(tǒng)；Zhang等[16]、Ma等[17,18]結(jié)合Golden Gate克隆和Gibson組裝技術(shù)建立水稻、擬南芥CRISPR/ Cas9多基因敲除系統(tǒng)。這些CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展使該技術(shù)在水稻基因編輯中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[19-21]。

前人研究表明，GS3是控制水稻粒重和粒長(zhǎng)的主效QTL，同時(shí)也是控制水稻粒寬和籽粒充實(shí)度的主效QTL[22,23]。位于GS3基因N端的調(diào)節(jié)器官大小的結(jié)構(gòu)域(OSR)的功能缺失導(dǎo)致水稻籽粒變長(zhǎng)以及產(chǎn)量增加[22,23]。Gn1a是影響水稻每穗實(shí)粒數(shù)的主效QTL,Gn1a基因的表達(dá)量降低引起花序分生組織中細(xì)胞分裂素的積累，促進(jìn)穎花的分化，最終導(dǎo)致產(chǎn)量增加[24]。已有研究表明，部分秈稻品種同時(shí)帶有這兩個(gè)主效QTL座位上的有利等位基因gs3和gn1a，而在粳稻品種中卻很少[25]。

本研究選取4個(gè)東北優(yōu)質(zhì)粳型常規(guī)的栽培水稻品種吉粳102、墾鑒稻6號(hào)、空育131和長(zhǎng)白25為研究受體，以GS3和Gn1a為靶基因，運(yùn)用CRISPR/ Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因的定點(diǎn)編輯，分析了GS3和Gn1a功能缺失突變對(duì)目標(biāo)性狀改良的效應(yīng)，旨在為培育高產(chǎn)水稻品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及種植

轉(zhuǎn)基因受體材料為4個(gè)優(yōu)質(zhì)東北栽培品種，分別為中熟粳稻品種吉粳102和中早熟粳稻品種長(zhǎng)白25，中早熟粳稻品種墾鑒稻6號(hào)，以及早熟粳稻品種空育131。所有受體材料和轉(zhuǎn)基因受體均種植于浙江杭州中國(guó)水稻所實(shí)驗(yàn)基地。常規(guī)水肥管理。

1.2 靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

GS3(Os03g0407400)和Gn1a(Os01g0197700)靶序列參照已有研究設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)[25]，在GS3第1外顯子上設(shè)計(jì)19 bp靶位點(diǎn)序列AGTGACATGGC AATGGCGG，PAM序列為CGG（圖1）。同樣在Gn1a第1外顯子上設(shè)計(jì)19 bp靶位點(diǎn)序列AATGA AGCAAGAGCAGGTC,PAM序列為AGG（圖1）。其中GS3,Gn1a靶位點(diǎn)中都包含了ATG啟動(dòng)密碼子以便更容易獲得基因功能缺失的突變體。GS3和Gn1a基因靶序列利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序進(jìn)行篩選，未找到脫靶序列。

1.3 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

圖1 GS3和Gn1a靶點(diǎn)位置Fig.1.Schematic diagram of the targeted sites in GS3 and Gn1a.

表1 本研究所用的引物Table 1.Primers used in this research.

圖2 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建流程Fig.2.Flow diagram of CRISPR/Cas9 system for construction.

利用合成引物(表1)，GS3-g＋＋/GS3-g--和 Gn1a-g＋＋/Gn1a-g--分別制成靶位點(diǎn)接頭GS3和Gn1a。用AarⅠ酶切SK-gRNA載體，再用T4連接酶將GS3和Gn1a接頭連接AarⅠ酶切回收過(guò)的SK-gRNA載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用SK-gRNA上的引物T3分別與引物GS3-g--和Gn1a-g--進(jìn)行菌落PCR，挑選陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序，篩選正確的中間載體SK-gRNA-GS3和SK-gRNA-Gn1a。分別用KpnⅠ/SalⅠ和XhoⅠ/BglⅡ酶切兩個(gè)中間載體，用KpnⅠ/BamHⅠ酶切CRISPR/Cas9載體,回收酶切產(chǎn)物，再通過(guò)T4連接酶連接，構(gòu)建pC1300-2×35S::Cas9-gGS3-gGn1a表達(dá)載體，通過(guò)酶切和測(cè)序的方法確認(rèn)植物表達(dá)載體構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。載體構(gòu)建的具體流程見(jiàn)圖2。研究所用的中間載體SK-gRNA和轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體CRISPR/Cas9由實(shí)驗(yàn)室保存[15]。

陽(yáng)性的農(nóng)桿菌菌株用于轉(zhuǎn)化受體品種，獲得轉(zhuǎn)基因T0代苗。用載體上特異引物(Hyg-F1/Hyg-R1和Cas9-F2/pC1300-R2)鑒定組培苗中是否成功整合T-DNA區(qū)，不能擴(kuò)增出目的條帶的為假陽(yáng)性苗。

1.4 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株的獲得

用陽(yáng)性農(nóng)桿菌株轉(zhuǎn)化吉粳102、墾鑒稻6號(hào)、空育131和長(zhǎng)白25愈傷組織。提取T0代植株的基因組DNA，用載體pC1300-2×35S::Cas9特異引物Hyg-F1/Hyg-R1和Cas9-F2/pC1300-R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為615 bp和600 bp(表1)，能擴(kuò)增出目的片段的植株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

1.5 測(cè)序檢測(cè)靶位點(diǎn)

為了檢測(cè)靶位點(diǎn)的突變情況，在GS3和Gn1a的靶位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)檢測(cè)引物GS3-JC-F/GS3-JC-R和 Gn1a-JC-F/Gn1a-JC-R（表1），擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為326 bp和334 bp。用引物GS3-JC-F/GS3-JC-R和Gn1a-JC-F/Gn1a-JC-R擴(kuò)增T0代陽(yáng)性株的目的條帶，將目的條帶送杭州擎科測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)劉耀光課題組研發(fā)的序列解碼方法[18]進(jìn)行分析(http://dsdecode.scgene.com/)。以吉粳102、墾鑒稻6號(hào)、空育131和長(zhǎng)白25水稻品種基因組為模板，擴(kuò)增目的條帶的比對(duì)模板序列。

1.6 T1代無(wú)選擇標(biāo)記基因突變株的獲得

對(duì)挑選出靶基因突變株用引物Hyg-F1/Hyg-R1和Cas9-F2/pC1300-R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，兩對(duì)引物都不能擴(kuò)增出目的條帶的植株為無(wú)選擇標(biāo)記基因的突變株，Actin基因?yàn)閷?duì)照。

1.7 主要農(nóng)藝性狀考查與分析

于成熟期選擇每個(gè)水稻背景中野生型和突變株各5株，取所選單株的主穗5個(gè)，考查植株每穗粒數(shù)。烘干種子，每個(gè)單株隨機(jī)選30粒飽滿的種子測(cè)量粒長(zhǎng)、粒寬；隨機(jī)稱取200粒飽滿種子的質(zhì)量并換算成千粒重。利用SAS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的獲得

用帶有表達(dá)載體pC1300-2×35S::Cas9-gGS3-gGn1a的農(nóng)桿菌分別轉(zhuǎn)化吉粳102、墾鑒稻6號(hào)、空育131和長(zhǎng)白25，獲得的轉(zhuǎn)基因T0苗[26]用載體上特異引物Hyg-F1/Hyg-R1和Cas9-F2/pC1300-R2(表1)鑒定轉(zhuǎn)化體中是否成功整合T-DNA區(qū)。結(jié)果表明在吉粳102、墾鑒稻6號(hào)、空育131和長(zhǎng)白25中分別獲得42株、29株、52株和30株組培苗，其中吉粳102有38株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗，墾鑒稻6號(hào)有20株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗，空育131有42株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗，長(zhǎng)白25有28株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗。

2.2 GS3和Gn1a基因靶位點(diǎn)突變類型分析

為了解4個(gè)水稻品種中GS3和Gn1a基因的突變情況，將轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗進(jìn)行測(cè)序分析(圖3)。測(cè)序分析結(jié)果表明，4個(gè)水稻品種中均篩選到gs3和gn1a突變，所有T0代突變株GS3基因的突變率都是100%，且均為純合突變，而Gn1a的突變類型包括雜合突變和純合突變。因此，綜合兩個(gè)基因位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)基因后代中獲得了gs3和gs3gn1a兩種類型的突變體。從T0陽(yáng)性植株中選擇在GS3和Gn1a基因座位上發(fā)生移碼突變的植株用于農(nóng)藝性狀分析。GS3的突變類型包括單堿基(A,T,G,C)插入,1個(gè)堿基、2個(gè)堿基、4個(gè)堿基和11個(gè)堿基缺失。Gn1a基因的突變類型包括單堿基(A,T,G)插入和單堿基缺失。

2.3 T1代無(wú)選擇標(biāo)記基因突變株的獲得

將T1代所有的gs3和gs3gn1a突變體用兩對(duì)引物篩選T-DNA片段，一對(duì)引物Hyg-F1/Hyg-R1擴(kuò)增潮霉素上615 bp片段，另一對(duì)引物Cas9-F2/ pC1300-R2擴(kuò)增的600 bp片段包含Cas9基因和pC1300載體上的部分序列（圖4）。兩對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增不出條帶的為無(wú)選擇標(biāo)記基因的突變株，其中OsActin基因?yàn)閷?duì)照。利用該P(yáng)CR方法分別篩選吉粳102、長(zhǎng)白25、墾鑒稻6號(hào)和空育131背景的轉(zhuǎn)基因后代113、114、104和102株，選出gs3和gs3gn1a無(wú)選擇標(biāo)記基因的突變株植株數(shù)量分別為吉粳102背景18株，長(zhǎng)白25背景23株，墾鑒稻6號(hào)背景10株和空育131背景20株。篩選出來(lái)的無(wú)選擇標(biāo)記基因的突變株進(jìn)一步進(jìn)行小區(qū)試驗(yàn)，分析植株的粒長(zhǎng)和每穗粒數(shù)等性狀。

圖3 4個(gè)水稻品種T0代GS3和Gn1a突變類型分析Fig.3.Mutation types at the GS3 and Gn1a loci of the four varieties in T0generation.

圖4 PCR鑒定無(wú)選擇標(biāo)記基因的突變株Fig.4.PCR identification of the marker-free transgenic plants.

圖5 4個(gè)品種T1代株型Fig.5.Grass morphology of the plants of the four varieties in T1generation.

2.4 T1代植株性狀分析

利用測(cè)序的方法篩選T1所有的移碼突變gs3和gs3gn1a突變體，GS3和Gn1a是控制粒形和每穗粒數(shù)的主效QTL,前人的研究結(jié)果表明這兩個(gè)主效基因不影響植株的正常生長(zhǎng)，4個(gè)水稻品種中無(wú)論是單敲GS3還是共敲除GS3和Gn1a，植株的株型正常(圖5)。選擇T1代后代中生長(zhǎng)狀況良好的植株進(jìn)行粒型、每穗粒數(shù)的分析。

我們統(tǒng)計(jì)并分析了4個(gè)粳稻品種中g(shù)s3和gs3gn1a突變體的粒形和每穗粒數(shù)等性狀?？偟膩?lái)說(shuō)，4個(gè)粳稻品種中g(shù)s3和gs3gn1a突變體的粒長(zhǎng)較野生型植株增加8%～18%，并且都達(dá)到了極顯著水平(圖6)。值得注意的是水稻品種長(zhǎng)白25和空育131中g(shù)s3gn1a突變體的粒長(zhǎng)比gs3突變體長(zhǎng)1%～4%；吉粳102和墾鑒稻6號(hào)中g(shù)s3gn1a突變體的粒長(zhǎng)比gs3突變體短4%(圖6)。而在相同品種中，不同基因型植株的粒寬變化都未達(dá)到顯著水平，吉粳102、長(zhǎng)白25和空育131的突變體的粒寬相比野生型的短0%～4%；而墾鑒稻6號(hào)中g(shù)s3gn1a突變體的粒寬比野生型增加2%(圖6-C,F,I,L)。千粒重的分析結(jié)果表明，4個(gè)品種中突變體的千粒重較對(duì)應(yīng)野生型植株均增加，gs3突變體千粒重增加2%～21%，gs3gn1a突變體千粒重增加7%～16%(圖7)。

圖6 T1代4個(gè)水稻品種及其突變體粒型Fig.6.Grain size of the four varieties and their mutants in T1generation.

圖7 T1代4個(gè)水稻品種及其突變體的千粒重Fig.7.1000-grain weight among the four varietiesand their mutantsin T1generation.

比較gs3gn1a突變體和gs3突變體的每穗粒數(shù)發(fā)現(xiàn)(圖8)，4個(gè)水稻品種中g(shù)s3gn1a突變體的每穗粒數(shù)比gs3突變體增加11%～51%，而結(jié)實(shí)率出現(xiàn)相反的結(jié)果。4個(gè)水稻品種中g(shù)s3gn1a突變體的結(jié)實(shí)率比gs3突變體下降1%～8%。4個(gè)品種中突變體的結(jié)實(shí)率都比野生型的低，而且單突變體結(jié)實(shí)率降幅比雙突變體小。

圖8 T1代4個(gè)水稻品種及其突變體的每穗粒數(shù)和結(jié)實(shí)率Fig.8.Grain number per panicle and the seed-setting rate among the four varieties in T1generation and their mutants.

3 討論

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)具有成本低，操作簡(jiǎn)單，技術(shù)門檻低等優(yōu)點(diǎn)。利用該基因編輯技術(shù)來(lái)獲得植物基因功能缺失型突變體的方法已經(jīng)成功地應(yīng)用到許多作物中，如水稻[25,27]、玉米[28,29]、小麥[30,31]、大麥[32]、大豆[33,34]等。Shen等[25]敲除5個(gè)江浙水稻栽培品種的GS3和Gn1a基因，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因在不同遺傳背景下對(duì)產(chǎn)量的影響是多樣的。本研究中，我們?yōu)榱搜芯縂S3和Gn1a基因功能缺失在東北品種中的效應(yīng)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)在吉粳102、墾鑒稻6號(hào)、空育131和長(zhǎng)白25水稻品種中同時(shí)敲除GS3和Gn1a基因，成功獲得功能缺失的突變體gs3和gs3gn1a，并在T1代考查粒形相關(guān)和穗型相關(guān)性狀，發(fā)現(xiàn)敲除突變體的粒長(zhǎng)和每穗粒數(shù)都與預(yù)期結(jié)果一致，且突變體的種子千粒重都比各自品種的野生型增加。

本研究中將設(shè)計(jì)的GS3和Gn1a的兩個(gè)靶位點(diǎn)序列并聯(lián)連入CRISPR/Cas9表達(dá)載體中，T0代植株中Gn1a的突變類型有純合突變（包括純合突變和雙等位突變）和雜合突變，而GS3的突變類型均為純合突變，且突變效率在4個(gè)水稻品種中都高達(dá)100%，以至于后代未能獲得單敲除的gn1a突變體。有研究表明，靶序列的GC含量影響突變效率[17]，GS3靶序列的GC含量(61%)比Gn1a(50%)高22%，因此，GS3靶序列的高GC含量可能是GS3基因突變效率高的原因之一。

我們發(fā)現(xiàn)敲除GS3和Gn1a基因產(chǎn)生的效應(yīng)在不同地區(qū)的水稻背景中表現(xiàn)不同。Shen等[25]的研究結(jié)果表明，在5個(gè)江浙水稻品種中，突變體gs3和gs3gn1a植株的粒長(zhǎng)與野生型相比增加1%～4%；同時(shí)gs3gn1a突變體的每穗粒數(shù)相較于gs3突變體增加3%～15%。而本研究在4個(gè)東北水稻品種中g(shù)s3和gs3gn1a突變株的粒長(zhǎng)與野生型相比差異都達(dá)到極顯著水平，增幅為8%～18%(表2)，遠(yuǎn)大于5個(gè)江浙水稻品種；每穗粒數(shù)的增幅也比江浙水稻品種大，gs3gn1a突變體的每穗粒數(shù)相較于gs3突變體增加11%～51%(表2)。此外，東北品種gs3和gs3gn1a突變體的千粒重與野生型相比增幅為2%～21%，遠(yuǎn)大于5個(gè)江浙品種(0%～8%)[25]。以上結(jié)果表明，通過(guò)基因編輯技術(shù)對(duì)GS3和Gn1a進(jìn)行編輯，在理論上可以選育出更加高產(chǎn)的品種。

產(chǎn)量是作物最為重要和最復(fù)雜的性狀之一，產(chǎn)量的決定因素主要有三個(gè)方面：千粒重、每穗實(shí)粒數(shù)和有效穗數(shù)[35]。GS3主要控制粒長(zhǎng)，進(jìn)而影響籽粒的千粒重[22,23]，Gn1a增加穗粒數(shù)[24]。理論上結(jié)合這兩個(gè)主效QTL可以獲得千粒重和每穗粒數(shù)都增加的水稻株系，然而我們發(fā)現(xiàn)突變株系的結(jié)實(shí)率下降，長(zhǎng)白25號(hào)轉(zhuǎn)基因背景中g(shù)s3gn1a突變體的每穗總粒數(shù)比gs3突變體增加11%（表2），而gs3gn1a突變體的每穗實(shí)粒數(shù)比gs3突變體僅增加2%（表2），其他的水稻背景下也是同樣的變化趨勢(shì)。結(jié)合水稻栽培中的源庫(kù)流理論，我們推測(cè)可能是因?yàn)樵黾恿怂咀蚜５膸?kù)容量，而光合作用產(chǎn)生的源不夠充足，使得每穗上的癟粒數(shù)增加，從而降低了結(jié)實(shí)率。當(dāng)然，環(huán)境條件也可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)化體結(jié)實(shí)率降低的因素之一。

傳統(tǒng)的雜交育種技術(shù)通過(guò)雜交、回交進(jìn)行遺傳改良，周期長(zhǎng)，耗費(fèi)大量的人力和物力資源，且難以突破基因連鎖帶來(lái)的連鎖累贅。CRISPR/Cas9技術(shù)不但可以較容易地獲得單個(gè)或多個(gè)基因定向改良的植株，而且在自交后代中獲得無(wú)選擇標(biāo)記的株系，極大地加快了育種的進(jìn)程。本研究利用基因編輯技術(shù)定向敲除4個(gè)東北品種中GS3和Gn1a基因，在T0代獲得gs3和gs3gn1a突變體，通過(guò)對(duì)突變體T1代株系考查發(fā)現(xiàn)突變體除了目標(biāo)性狀得到改良外，其他性狀未受到明顯影響，說(shuō)明通過(guò)基因編輯技術(shù)定向改良水稻品種是完全可行的。當(dāng)然，由于本研究中選擇的轉(zhuǎn)基因受體均是來(lái)自于東北的粳稻品種，在浙江杭州試驗(yàn)基地種植會(huì)縮短生育期，因此本研究沒(méi)有詳細(xì)分析轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量水平，需要將gs3和gs3gn1a突變體種植于吉林和黑龍江等東北地區(qū)進(jìn)一步研究其產(chǎn)量性狀。

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Orientation Improvement of Grain Length and Grain Number in Rice by Using CRISPR/Cas9 System

SHEN Lan1,2,#,LI Jian3,#,FU Yaping2,WANG Junjie2,HUA Yufeng2,JIAO Xiaozhen2,YAN Changjie1,*, WANG Kejian2,*

(1Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology/Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops/Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education/College of Agronomy,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China;2State Key Laboratory of Rice Biology,China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China;3Lianyungang Academy of Agricultural Sciences;Lianyungang 222000,China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author,E-mail:cjyan@yzu.edu.cn,wangkejian@caas.cn)

【Objective】Gene orientation editing has become an important way for molecular breeding.We evaluated the improvement effects on the target traits following the construction of GS3 and Gn1a loss-of-function mutants so as to lay a solid foundation for high-yielding rice breeding.【Method】GS3 and Gn1a were selected as targets for gene editing, which control the grain size and grain number in rice,respectively.The pC1300-2×35S::Cas9-gGS3-gGn1aexpression vector was constructed for knocking out both GS3 and Gn1a by using CRISPR/Cas9 system,and transformed into four good quality rice varieties by the Agrobacterium-mediated method.And the properties of mutations and the target traits were analyzed in the transgenic lines.【Result】The sequencing results showed the GS3 and Gn1a in four rice varieties were successfully edited.In T0generation,we obtained mutants with frame shift mutations in GS3 and Gn1a in four rice varieties.In T1generation,the marker-free plants were screened for analyzing the agronomic traits in four genetic backgrounds.For the agronomic characters,the gs3 and gs3gn1a mutants had the longer grain length and the increased 1000-grain weight compared to the wild type,and the gs3gn1a mutants had more grains per panicle compared to the gs3 mutants.【Conclusion】CRISPR/Cas9-mediated gene editing can improve rice target traits,which has great potential in orientation improvement of rice varieties.

CRISPR/Cas9;gene editing;rice;GS3;Gn1a

Q755;S511.032

：A

：1001-7216(2017)03-0223-09

2017-03-09；修改稿收到日期：2017-03-20。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31371233)；高校自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目(14KJA210002)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程資助項(xiàng)目；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金資助項(xiàng)目[CX(13)5075]。