歐 銳，南旭梅，呂旭英，李 琦，于 鵬

(西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州 730070)

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牛至油對小鼠灌胃給藥的急性毒性試驗

歐 銳，南旭梅，呂旭英，李 琦，于 鵬*

(西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州 730070)

牛至油作為一種新型動物保健藥物，具有促進生長、抗菌、殺菌、增強機體免疫力等作用，然而其毒性大小尚未見報道。采用Bliss法設計，對昆明小鼠單次灌胃牛至油，測定其對小鼠半數(shù)致死量(LD50)及其95%可信限，觀察7 d內小鼠的毒性反應和死亡情況，對小鼠進行剖檢和組織病理學檢查。結果顯示，牛至油單次灌胃小鼠出現(xiàn)不同程度的毒性反應，包括自發(fā)活動減少、閉眼、俯臥、震顫、毛發(fā)直立、強制性-陣攣性抽搐、角弓反張等，LD50為688.33 mg/kg，95%可信限為584.33 mg/kg～806.34 mg/kg。死亡小鼠均毛發(fā)直立、個體消瘦；剖檢均可見肝、腎腫大；組織病理學檢查可見高劑量組肝、腎組織受損明顯，肝細胞索排列紊亂，肝細胞疏松，肝血竇擴張；腎小球嚴重腫脹，腎小囊腔狹窄，腎小管上皮細胞有不同程度腫脹、壞死。綜上所述，牛至油對小鼠單次灌胃具有一定毒性，屬于低毒物質。

牛至油；急性毒性；小鼠

牛至油(oregano oil)是從天然植物牛至(Origanumvulgare)中提取的揮發(fā)油，淡黃色透明液體，由多種芳香味化合物組成，化學成分主要是百里香酚、香芹酚、γ-萜品烯和ρ-異丙甲苯等，其中百里香酚和香芹酚的抗菌活性最強[1]。牛至油作為一種新型動物保健藥物，具有促進生長、抗菌、殺菌、抗氧化、促進新陳代謝、提高生產性能、增強機體免疫力等作用[2-7]，對畜禽腸道細菌(如大腸埃希菌、沙門菌、豬痢短螺旋體)引起的腹瀉和痢疾有特效，且不易產生耐藥性[8-9]。同時牛至油的獨特香味能刺激消化道感受器，激活消化道酶的活性，促進消化，提高飼料轉化率，而且無藥物殘留[10-12]。然而牛至油的毒性大小尚未見報道。因此本研究通過牛至油對昆明種小鼠單次灌胃給藥，觀察小鼠所產生的急性毒性反應，測定其對小鼠的LD50及其95%的可信限，為牛至油的安全性評價及臨床研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物 2周齡SPF級昆明小鼠(18 g～22 g)80只，雌雄各半(雌性未產無孕)，購于甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號:SYXK(甘)2015-0005。雌雄鼠分籠飼養(yǎng)，實驗室適應性飼養(yǎng)7 d，觀察其健康狀況，所選小鼠為健康，狀態(tài)良好。室內通風良好，溫度保持在18℃～22℃，相對濕度在40%～70%左右，12 h自然采光，小鼠自由飲水和進食。

1.1.2 藥品 牛至油主要質控成分為香芹酚和百里香酚，且香芹酚含量不低于60%，百里香酚含量不低于8%。該提取物由北京中聯(lián)華康科技有限公司提供，并經高分子包被技術對植物精油進行包膜，避免牛至油在空氣中被氧化和揮發(fā)的損失，加強其穩(wěn)定性。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試品的配制 參照《化學藥物急性毒性試驗技術指導原則》[13]，經過包被的牛至油，用蒸餾水配制成系列濃度的牛至油溶液(30、23.1、17.78、13.7、10.54、8.12、6.26、4.66 mg/mL)。

1.2.2 預試驗 參照《化學藥物急性毒性試驗技術指導原則》[13]，小鼠20 只，按預編號及體質量隨機分為5 組，雌雄各半，每組4只，分別用牛至油1 200、900、700、500、300 mg/kg灌胃給藥，給藥體積為30 mg/kg。藥后連續(xù)觀察3 d。結果1 200 mg/kg劑量組4只小鼠全部死亡，死亡率為100%的最小劑量(Dm)為1 200 mg/kg，300 mg/kg劑量組4只小鼠全部存活，死亡率為0的最大劑量(Dn)為300 mg/kg。所以，確定1 200 mg/kg劑量為試驗的最高劑量，300 mg/kg劑量為試驗最低劑量。

1.2.3 正式試驗 參照《化學藥物急性毒性試驗技術指導原則》[13]，小鼠60 只，將小鼠按性別及體質量分層隨機分為6 組，雌雄各半，每組10 只。根據(jù)最高劑量及最低劑量的公比系數(shù)(q=0.77)設計中間劑量，劑量分別為300、546.20、710.06、923.08、1 200.00 mg/kg，分別為牛至油A～E組，另設溶媒對照組。按上述劑量灌胃給藥，給藥體積30 mg/kg。動物給藥后，每天觀察小鼠的采食、飲水、精神、死亡、被毛和自主活動等情況，連續(xù)觀察7 d并記錄觀察結果。給藥當天，至少每2 h觀察1 次，然后每天上午、下午各觀察小鼠1 次，詳細記錄小鼠出現(xiàn)毒性反應的時間、持續(xù)時間、恢復以及小鼠死亡時間、死亡情況、中毒癥狀等。對死亡小鼠及時解剖，記錄病變情況。統(tǒng)計各組小鼠死亡數(shù)，用Bliss法(SPSS軟件)計算半數(shù)致死量LD50和LD50的95%可信限[14]。在給藥后第7天對所有的試驗小鼠進行剖檢，肉眼觀察主要臟器的改變，當器官出現(xiàn)體積、顏色、質地等改變時，進行組織病理學檢查。1.2.4 體重稱量及主要臟器收集 試驗過程中每天記錄動物健康狀況和死亡情況，及時解剖死亡個體，觀察主要臟器變化；并于灌胃后1 d、4 d和7 d記錄雌雄個體體重。待正式試驗結束后，取對照組和最高劑量組雌雄個體，取新鮮臟器于預冷的生理鹽水中漂洗、濾紙吸干，放入150 mL/L的甲醛液中固定[15]。

1.2.5 組織病理學觀察 取上述固定保存的小鼠臟器，200 g/L蔗糖脫水24 h,冰凍切片(20 μm)，HE染色，光學顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理方法

2 結果

2.1 一般觀察

300 mg/kg和546.20 mg/kg劑量組給藥后當天僅見自發(fā)活動減少；710.06 mg/kg和923.08 mg/kg組給藥后當天可見自發(fā)活動減少、眼睛閉合、叫聲減少、毛發(fā)直立、腹部腫脹、呼吸減弱、死亡等癥狀；1 200.00 mg/kg劑量組小鼠給藥后當天可見毛發(fā)直立、腹部腫脹、呼吸減弱、震顫、強制性-陣攣性抽搐、死亡等癥狀。420.15 mg/kg和546.20 mg/kg劑量組存活小鼠在給藥后24 h即恢復至正常狀態(tài)。表明隨著牛至油劑量的增加，小鼠的毒性反應加劇且癥狀持續(xù)時間延長。大部分存活動物出現(xiàn)癥狀后可逐漸緩解，溶媒對照組小鼠未見異常。

2.2 動物死亡情況

300 mg/kg組給藥2 d后1只雌性死亡；546.20 mg/kg組給藥2 d后雌雄各死亡1只；710.06 mg/kg組給藥2 d后雌雄各死亡1只；給藥4 d后2雄2雌死亡；923.08 mg/kg組給藥2 d后雌雄分別死亡2只，4 d后1雄2雌死亡；1 200.00 mg/kg 劑量組給藥1 d后2雌3雄死亡，2 d后2雌2雄死亡，2 d后全部死亡；溶媒對照組小鼠未見異常，見表1。

表1 試驗小鼠的給藥情況及LD50測定結果

2.3 體質量變化

雌性小鼠給藥1 d后各劑量組小鼠體重差異不顯著(P>0.05)；給藥4 d后1 200.00 mg/kg小鼠全部死亡，給藥4 d和7 d后710.06和923.08 mg/kg組存活小鼠體重均顯著降低(P<0.01)(圖1)。雄性小鼠給藥1 d后各劑量組小鼠體重差異不顯著(P>0.05)；給藥4 d后1 200.00 mg/kg小鼠全部死亡，給藥后4 d和7 d后710.06 mg/kg組小鼠體重均顯著降低(P<0.01)(圖2)。

2.4 病理學檢查

試驗過程中死亡個體均毛發(fā)直立、個體消瘦；剖檢可見肝腎腫大，胃內表面有一定程度的充血。試驗結束后，小鼠全部處死，實質性器官未發(fā)現(xiàn)肉眼可見變化。對照組雌雄個體肝組織結構完整，肝小葉、肝細胞結構清晰，1 200.00 mg/kg劑量組雌雄小鼠與對照組相比，肝組織受損，肝細胞索排列紊亂，肝血竇擴張，內皮細胞脫落，肝細胞核固縮，肝細胞疏松，同時肝細胞腫脹、變性(圖3)。

不同的字母代表組間差異顯著(P<0.05)

不同的字母代表組間差異顯著(P<0.05) Different letters in each cluster mean significant difference (P<0.05)

1A.對照組雌性；2A.1 200.00 mg/kg劑量組雌性；3A.1 200.00 mg/kg劑量組雌性；1B.對照組雄性；2B.1 200.00 mg/kg劑量組雄性；3B. 1 200.00 mg/kg劑量組雄性

對照組雌雄小鼠腎組織結構完整，腎小囊腔明顯，腎小球結構清晰，腎小管排列整齊，1 200.00 mg/kg劑量組雌雄小鼠腎組織可見腎小球腫脹充血，腎小囊腔變狹窄,有少量核固縮，腎小管有不同程度擴張、上皮細胞變性、脫落，腎髓袢上皮細胞腫脹空泡化(圖4)。

2.5 LD50計算

牛至油的昆明小鼠灌胃LD5為394.04 mg/kg，LD50為688.33 mg/kg，LD95為1 202.4 mg/kg，LD50的95%可信限為584.33 mg/kg～806.34 mg/kg。

3 討論

試驗結果表明昆明小鼠毒性癥狀隨牛至油的劑量增加而逐漸加重，如高劑量組動物全部死亡，2個中劑量組死亡13只，2個低劑量組死亡3只，溶媒對照組小鼠正常。且牛至油的LD50為688.33 mg/kg，其95%可信限為584.33 mg/kg～806.34 mg/kg，根據(jù)農業(yè)部規(guī)定的化學物急性毒性(LD50)劑量分級標準，判定牛至油屬于低毒物質。有關牛至油毒性大小的直接研究尚未見報道，僅僅在李學民的博士論文涉及了相關內容。在論文中研究人員給昆明小鼠口服含牛至油的復合納米乳劑[16]，高劑量組小鼠在給藥2 h后,開始出現(xiàn)精神沉郁,反應遲鈍,畏寒扎堆,被毛豎立,閉眼俯臥,不食等癥狀；給藥3 h～4 h后出現(xiàn)不同程度的腹瀉，隨后在48 h內死亡，該研究判定含有牛至油的復合納米乳劑為低毒物質，與本研究結果一致。

Rc示腎小體，Pt示近端小管，Dt示遠端小管。1C.對照組雌性；2C.1 200.00 mg/kg劑量組雌性；3C.1 200.00 mg/kg劑量組雌性；1D.對照組雄性；2D.1 200.00 mg/kg劑量組雄性；3D.1 200.00 mg/kg劑量組雄性

在本試驗過程中，高劑量組小鼠給藥后當天可見呼吸減弱和腹式呼吸，吸氣時腹部明顯塌陷，推測與呼吸中樞障礙，肋間肌麻痹和膽堿能神經麻痹有關；同時發(fā)現(xiàn)腹部腫脹；還有毛發(fā)直立現(xiàn)象，說明毒性涉及自主神經系統(tǒng)；震顫、強制性-陣攣性抽搐、角弓反張等現(xiàn)象同樣表明毒性可能涉及自主神經系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)和神經肌肉。在李學明等的研究中，早期死亡的小鼠死前呼吸困難，抽搐劇烈，死后四肢末端發(fā)紫[16]，說明含牛至油的復合納米乳劑的毒性反應涉及神經系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，支持本試驗結果和推斷。

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Acute Toxicity Test of Oral Administration of Oregano Oil in KM Mice

OU Rui，NAN Xu-mei，LU Xu-ying，LI Qi，YU Peng

(CollegeofLifeScience，NorthwestNormalUniversity，Lanzhou,Gansu,730070，China)

Oregano oil,as a novel health care medicine for animals,plays an important role in promoting growth,antibiosis,disinfection and enhancing organism immunity.However,its toxicity degree is still unclear.By using the Bliss method in the experiment，the LD50and its 95% confidence of oregano oil in the mice were determined after single oral administration for evaluation of the toxicity within 7 days.The gross anatomy and histopathological examination for the dead mice were also carried out respectively.After single oral administration，the mice showed various degrees of toxic reaction，such as less spontaneous activities，closing eyes，face lying，tremor，bristle， forced paroxysmal spasm，and opisthotonus.The LD50of oregano oil in mice was 688.33 mg/kg and its 95% confidence was 584.33 mg/kg-806.34 mg/kg.All of the dead mice were bristled hair and thin; the liver and kidney damages were obvious,like hepatosplenomegaly.In all,this result indicated that the oregano oil has a certain toxicity after single oral administration in mice,and it was low toxic substance.

oregano oil; acute toxicity; mouse

2016-10-03

西北師范大學青年教師科研能力提升計劃項目(NWNU-LKQN-13-8)；國家自然科學基金項目(81660589)

歐 銳(1990-)，女，甘肅白銀人，碩士研究生，主要從事細胞生物學。 *通訊作者

S859.8

A

1007-5038(2017)05-0064-05