仇保豐，宋鴻雁，董蓉蓮，高雪梅，蔣熒梅，顧炳泉，胡順林

(1.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；2.南通出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇南通 226004；3.南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇南通 226001；4.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210009)

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冷凍原腸浸泡解凍池水細(xì)菌多樣性分析

仇保豐1,2，宋鴻雁1,3，董蓉蓮4，高雪梅2，蔣熒梅3，顧炳泉2，胡順林1*

(1.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009；2.南通出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇南通 226004；3.南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇南通 226001；4.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210009)

為了研究冷凍原腸浸泡解凍池水的細(xì)菌多樣性，采集3份水樣直接提取細(xì)菌基因組總DNA，再分別用PCR技術(shù)擴(kuò)增出細(xì)菌16S rDNA并構(gòu)建基因文庫，經(jīng)PCR鑒定后從3個(gè)文庫中分別隨機(jī)挑取50個(gè)陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定。分別對3個(gè)文庫的測序結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，除去24.00%～32.00%為無法鑒定的未培養(yǎng)細(xì)菌和未分類細(xì)菌以外，其余細(xì)菌來自于芽胞桿菌綱、γ-變形菌綱、放線菌綱和黃桿菌綱，分別占各文庫克隆總數(shù)的38.00%～42.00%、20.00%～26.00%、4.00%～8.00%和0～2.00%。除去44株無法鑒定的細(xì)菌，進(jìn)一步對其他106株細(xì)菌進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其中2株放線菌目細(xì)菌和5株腸桿菌科細(xì)菌無法進(jìn)一步鑒定，其余99個(gè)菌株包含了來自19個(gè)屬的至少30種細(xì)菌，且腸球菌屬、變形桿菌屬和芽胞桿菌屬為其中的優(yōu)勢菌屬。本研究顯示冷凍原腸浸泡解凍池水中細(xì)菌多樣性較高，其中部分細(xì)菌為致病菌和條件致病菌。

冷凍原腸；解凍池；細(xì)菌多樣性；16S rDNA文庫

我國是世界上最大的天然腸衣(natural casings)生產(chǎn)國，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的三分之一[1]。由于我國生產(chǎn)的天然腸衣具有加工細(xì)致、腸壁韌性適宜、口徑分路準(zhǔn)確和可用于加工不同類型的灌腸類食品等優(yōu)點(diǎn)而廣受國內(nèi)外客戶的喜愛，目前僅鹽漬豬腸衣就已遠(yuǎn)銷至40多個(gè)國家和地區(qū)。但是，隨著近年來人們對食品安全問題的愈加重視，天然腸衣攜帶微生物的問題已逐漸成為繼獸藥殘留之后的又一個(gè)制約腸衣行業(yè)大發(fā)展的新難題。例如，早在1996年歐洲天然腸衣協(xié)會(ENSCA)就為天然腸衣設(shè)立了微生物推薦值，且這些限量指標(biāo)正不斷趨于更加嚴(yán)苛[2-3]。不僅如此，ENSCA還將沙門菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌等7種細(xì)菌列為天然腸衣中有生物危害的細(xì)菌，認(rèn)為可對食品安全形成威脅。

天然腸衣的主要原料是動(dòng)物原腸(intestine)，它是豬、羊等健康牲畜屠宰后去糞、清洗且未經(jīng)刮制的小腸。因此，天然腸衣攜帶腸內(nèi)或外源微生物是無法避免的；不僅如此，清洗、凍藏、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)的溫度和衛(wèi)生條件的控制情況等也是影響微生物污染水平的重要因素[4-5]。但是截至目前，國內(nèi)外對原腸攜帶細(xì)菌的多樣性研究仍嚴(yán)重偏少，且相關(guān)報(bào)道主要采用細(xì)菌人工培養(yǎng)、鑒定的傳統(tǒng)方法，研究結(jié)論也相差甚遠(yuǎn)[6-7]；在腸衣加工和污水處理等環(huán)節(jié)有關(guān)微生物的監(jiān)控資料更是嚴(yán)重匱乏，這都不能滿足腸衣生產(chǎn)加工中降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)和促進(jìn)腸衣行業(yè)健康發(fā)展的現(xiàn)實(shí)需求。本研究采用非培養(yǎng)法直接從冷凍原腸的浸泡解凍池水中提取細(xì)菌基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增構(gòu)建16S rDNA克隆文庫，再根據(jù)隨機(jī)測序結(jié)果分析浸泡解凍池水中的細(xì)菌多樣性，不但可以為研究冷凍原腸攜帶細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)等提供思路，也可為掌握腸衣加工環(huán)節(jié)污染情況和提高腸衣污水處理成效等提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水樣 3份水樣分別采集自南通地區(qū)3家腸衣生產(chǎn)、加工企業(yè)的冷凍原腸浸泡解凍池。

1.1.2 主要試劑 酵母浸提物和胰蛋白胨為OXOID公司產(chǎn)品；瓊脂粉為中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；pGEM-T easy vector為Promega公司產(chǎn)品；dNTPs(10 mmol/L each)、rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、DNA Marker DL 2 000、DNA膠回收試劑盒和16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 水樣的采集和處理 水樣的采集方法簡述如下：企業(yè)冷凍原腸浸泡解凍池經(jīng)過排水、清洗和消毒后，密封排水口。從塑料桶內(nèi)拿出尼龍編織袋包裝的冷凍原腸放入浸泡解凍池，同時(shí)重新注入自來水至完全浸沒腸衣，每間隔30 min用清潔的帶鉤長桿充分翻轉(zhuǎn)腸衣包裝袋3 min，待所有的原腸基本解凍時(shí)，再用長桿翻轉(zhuǎn)腸衣包裝袋10 min，接著用滅菌處理過的玻璃器皿，從解凍池的四角和中間分別取水樣500 mL，將5個(gè)點(diǎn)的水樣共同注入一個(gè)潔凈的采樣袋內(nèi)，充分混勻后取500 mL注入滅菌處理過的玻璃瓶內(nèi)，密封后放入裝有冰袋的保溫箱內(nèi)立即送往實(shí)驗(yàn)室，將水樣品搖勻后分裝入無菌離心管內(nèi)，4℃、10 000 r/min離心10 min，集中菌體加入1 mL無菌TE緩沖液，置-40℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取 將3份水樣收集細(xì)菌分別用商品化的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒直接提取細(xì)菌基因組總DNA，具體操作方法參照試劑盒的說明書。

1.2.3 細(xì)菌16S rDNA文庫的構(gòu)建 將1.2.2提取的3份細(xì)菌基因組總DNA分別作為模板，用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit擴(kuò)增腸衣攜帶細(xì)菌的16S rDNA，瓊脂糖凝膠電泳后，分別切膠、回收目的條帶并克隆入pGEM-T easy vector，轉(zhuǎn)化DH5α后依次涂布AIX選擇性瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)12 h～16 h，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

1.2.4 細(xì)菌16S rDNA序列的測定及分析 用滅菌處理過的牙簽隨機(jī)從3份水樣的AIX平板上挑取白色菌落，分別接種含氨芐(終濃度100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h～16 h，提取質(zhì)粒用PCR鑒定出陽性克隆，每份水樣隨機(jī)挑取50個(gè)陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA序列測定，并將所測序列用PDRⅡ中的Chimera Check程序進(jìn)行檢查，以剔除嵌合體。最后將DNA測序結(jié)果輸入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/進(jìn)行網(wǎng)上比對，根據(jù)比對結(jié)果分析細(xì)菌的多樣性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

對冷凍原腸解凍水池的水樣收集細(xì)菌，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒直接提取基因組總DNA，接著用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit對細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出了約為1 700 bp的條帶，與預(yù)期的條帶大小一致(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1～3.細(xì)菌16S rDNA的PCR產(chǎn)物

2.2 細(xì)菌16S rDNA文庫的構(gòu)建

根據(jù)3份原腸細(xì)菌16S rDNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，分別切膠、回收目的條帶并克隆入pGEM-T easy vector，轉(zhuǎn)化DH5α后依次涂布AIX選擇性瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)12 h～16 h，發(fā)現(xiàn)AIX選擇性瓊脂平板上白色菌落較多，藍(lán)色菌落很少(圖2)，初步判斷冷凍原腸細(xì)菌16S rDNA文庫的構(gòu)建比較成功。

圖2 AIX平板上的重組細(xì)菌菌落

2.3 細(xì)菌16S rDNA文庫的鑒定

從3份水樣的AIX平板上分別隨機(jī)挑取白色菌落，接種含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h～16 h，提取質(zhì)粒用PCR鑒定出陽性克隆，絕大多數(shù)菌落均能擴(kuò)增出約為1 700 bp條帶，與預(yù)期大小一致(圖3)。從3份水樣的陽性克隆中分別選擇50個(gè)PCR鑒定目的條帶較亮的菌落，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA序列測定。測序結(jié)果經(jīng)嵌合體檢驗(yàn)，均不是嵌合序列，最后將測序結(jié)果輸入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/進(jìn)行網(wǎng)上比對，克隆文庫中的序列與NCBI已登錄的任一序列同源性最高，且同源性大于或等于97%的歸結(jié)為同一種細(xì)菌；序列同源性小于97%的定義為“未分類細(xì)菌(Unclassified bacteria)”，比對結(jié)果見表1。

表1 16S rDNA克隆文庫分析

注:“-”表示“未確定”；“N”表示菌株名稱未見中文翻譯。

Note:“-” indicates “unidentified”; “N” indicates the Chinese name of this bacterium is not found.

2.4 細(xì)菌16S rDNA文庫的分析

本研究測定的150個(gè)克隆中，將28株未培養(yǎng)細(xì)菌和16株未分類細(xì)菌共同定義為“未確定(unidentified)”細(xì)菌，剩余106株細(xì)菌分別來自4個(gè)綱，即放線菌綱(Actinobacteria)8株，γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)37株，芽胞桿菌綱(Bacilli)59株和黃桿菌綱(Flavobacteria)2株。其中芽胞桿菌綱的細(xì)菌占克隆總數(shù)的比例最高，約為39.33% (59/150)，γ-變形菌綱細(xì)菌所占比例約為24.67% (37/150)，放線菌綱和黃桿菌綱的細(xì)菌所占比例較低，而“未確定(unidentified)”細(xì)菌所占比例為29.33% (44/150)。再分別對3份水樣的克隆文庫進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，芽胞桿菌綱細(xì)菌在各文庫中所占的比例為38.00%～42.00%；γ-變形菌綱細(xì)菌所占的比例20.00%～26.00%，放線菌綱和黃桿菌綱的細(xì)菌所占比例分別為4.00%～8.00%和0～2.00%，另外，“未確定”細(xì)菌所占的比例為24.00%～32.00%(圖4)。由此可見，在冷凍原腸浸泡解凍池水中，芽胞桿菌綱和γ-變形菌綱的細(xì)菌為優(yōu)勢菌群。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1～12.重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物

圖4 3個(gè)16S rDNA克隆文庫的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，除去44株“未確定”細(xì)菌，其余106株細(xì)菌中，2株放線菌目細(xì)菌和5株腸桿菌科細(xì)菌未能鑒定到屬(Genus)，其余99個(gè)菌株分別為來自于19個(gè)屬的至少30種細(xì)菌(94株細(xì)菌鑒定到種)，其中腸球菌屬(Enterococcus)、變形桿菌屬(Proteus)和芽胞桿菌屬(Bacillus)為優(yōu)勢菌屬(表1)。另外，研究中還檢出了沙門菌、葡萄球菌、腸球菌和變形桿菌等致病菌或條件致病菌。

3 討論

研究表明，冷凍原腸攜帶的細(xì)菌量可達(dá)到104CFU/g～107CFU/g[4-5,8]，有時(shí)甚至可能攜帶包括沙門菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7、摩根氏菌、腸球菌、變形桿菌、志賀菌、鏈球菌和亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌等在內(nèi)的多種致病菌或條件性致病菌[6-10]。但由于我國出口的腸衣主要是經(jīng)過鹽漬(腌制)的成品腸衣，且絕大多數(shù)細(xì)菌在鹽漬的高滲環(huán)境下經(jīng)過一段時(shí)間就會被殺滅[2,8]；再加之出口的腸衣主要是用作灌腸類食品的衣膜并經(jīng)過再次加工、蒸煮后才供食用，因此，出口成品腸衣攜帶細(xì)菌的生物安全風(fēng)險(xiǎn)相對較低。也正因如此，近年來國外的相關(guān)報(bào)道主要集中在采用人工添加特定細(xì)菌的方法，研究氯化鈉[2,5,8]、臭氧[11]和輻射[4,12]等手段對腸衣攜帶細(xì)菌的殺滅效果上，但是對冷凍原腸攜帶細(xì)菌的多樣性研究非常少。我國由于腸衣原料需求量大、勞動(dòng)力成本低廉和加工工藝優(yōu)良等原因，不但是腸衣出口大國，還是世界上重要的腸衣來料和進(jìn)料加工大國，每年有大量的來自不同國家和地區(qū)的腸衣原料輸入我國進(jìn)行生產(chǎn)加工，其中有相當(dāng)一部分腸衣原料為冷凍原腸，這給我國畜牧業(yè)健康和公共衛(wèi)生安全帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。但截至目前，國內(nèi)對原腸攜帶細(xì)菌的多樣性研究仍嚴(yán)重偏少，且僅有的少量報(bào)道也主要采用傳統(tǒng)的細(xì)菌人工培法，研究結(jié)論更是無法相互印證[6-7]。分析其原因：首先，傳統(tǒng)的細(xì)菌人工培養(yǎng)法研究細(xì)菌多樣性具有工作量大、耗時(shí)長等不足，從而導(dǎo)致各研究小組鑒定細(xì)菌的總數(shù)差異較大且總體偏少；其次，即便是同一批冷凍原腸其來源動(dòng)物的數(shù)量也非常龐大，而冷凍原腸攜帶的腸內(nèi)或外源微生物的數(shù)量和種類，不但易受動(dòng)物個(gè)體屠宰前的健康、飲食和用藥等多種因素的影響，而且容易受到動(dòng)物屠宰后小腸去糞、清洗、保存和運(yùn)輸過程中衛(wèi)生及溫度控制情況的影響，因此小批量采集的原腸樣品難以保證其代表性和科學(xué)性。再次，由于腸道細(xì)菌有60%～80%是無法人工培養(yǎng)的[13]，故而采用非培養(yǎng)法研究腸道細(xì)菌多樣性已被廣泛認(rèn)同和采用，但因?yàn)閯?dòng)物原腸是經(jīng)過去糞、清洗過的小腸，因此既無法通過腸道內(nèi)容物(糞便)來研究原腸攜帶細(xì)菌的多樣性，也由于原腸細(xì)菌數(shù)量比正常動(dòng)物腸道大為減少和動(dòng)物組織細(xì)胞等干擾物質(zhì)過多等原因，從原腸中直接提取細(xì)菌基因組總DNA的難度非常大，目前國內(nèi)尚無報(bào)道。

腸衣生產(chǎn)在整個(gè)加工鏈中用水量極大，并且產(chǎn)生大量的有機(jī)廢水[14]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國腸衣加工廢水的年排放量約為270萬噸，并且發(fā)展了生物降解、化學(xué)水解、物理混凝和綜合利用等技術(shù)用于處理高COD、高鹽、高氨氮和易腐臭的腸衣污水[14-15]。盡管早在1987年尹振聲[16]就報(bào)道了腸衣廢水的細(xì)菌總數(shù)可達(dá)5.0×104個(gè)/mL～3.0×105個(gè)/mL。但多年以來，研究人員對腸衣浸泡解凍等加工廢水中的細(xì)菌多樣性問題仍然缺乏關(guān)注，對腸衣廢水處理的效果評價(jià)中也鮮有微生物指標(biāo)。造成這一局面的原因，可能是目前有關(guān)腸衣加工廢水中微生物多樣性的研究不足，公開的相關(guān)數(shù)據(jù)和報(bào)道極度匱乏，未能引起腸衣廢水處理研究人員的重視，同時(shí)由于腸衣加工后續(xù)環(huán)節(jié)中氯化鈉(NaCl)的使用量比較大，人們想當(dāng)然地認(rèn)為腸衣廢水收集池中的高鹽環(huán)境會對細(xì)菌起到有效的抑制生長和殺滅作用。事實(shí)上由于耐鹽菌、嗜鹽菌和對高鹽環(huán)境耐受力極強(qiáng)的細(xì)菌芽胞的存在，即便是用過飽和的鹽鹵或干鹽充分鹽漬的成品腸衣，其菌落總數(shù)有時(shí)也會超過103CFU/g[3]。由此就不難理解，為何對于富含有機(jī)物的腸衣加工廢水來說，即便含鹽量較高，其細(xì)菌總數(shù)也非常驚人了。另外，目前國內(nèi)尚無對腸衣加工廢水進(jìn)行細(xì)菌多樣性、溯源性和生物安全性的研究報(bào)道，這可能會為進(jìn)一步優(yōu)化腸衣廢水處理工藝和科學(xué)設(shè)立評價(jià)指標(biāo)等埋下隱患，尤其是當(dāng)前多種腸衣污水處理工藝因成本、效率和干擾等問題遇到阻礙后，提出將發(fā)展方向轉(zhuǎn)為先對各股廢水分別進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，后混合進(jìn)行生化處理的聯(lián)合治理工藝的形勢下[14-15]，這一隱患很有可能會變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

本研究采用非培養(yǎng)法直接從冷凍原腸的浸泡解凍池水中提取細(xì)菌基因組總DNA，通過PCR擴(kuò)增構(gòu)建16S rDNA克隆文庫，再根據(jù)隨機(jī)測序結(jié)果分析浸泡解凍池水中的細(xì)菌多樣性，不但可以規(guī)避非培養(yǎng)法研究原腸細(xì)菌多樣性中遇到的很多難題，為研究冷凍原腸攜帶細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)等提供思路。同時(shí)，冷凍原腸冷水浸泡解凍過程也是腸衣加工中發(fā)生交叉污染最為嚴(yán)重的環(huán)節(jié)，對原腸浸泡解凍池水的細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，還可為掌握腸衣加工環(huán)節(jié)污染情況、探索腸衣原料衛(wèi)生控制途徑及腸衣加工污水無害化處理等提供資料。通過研究發(fā)現(xiàn)，芽胞桿菌綱細(xì)菌在3份水樣的細(xì)菌16S rDNA克隆文庫中所占的比例為38.00%～42.00%，γ-變形菌綱細(xì)菌所占的比例為20.00%～26.00%，放線菌綱和黃桿菌綱的細(xì)菌所占比例分別為4.00%～8.00%和0～2.00%。除此之外，3個(gè)克隆文庫中尚有24.00%～32.00%的細(xì)菌無法確定種群(圖4)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，除去44個(gè)無法確定種群的克隆，其余106個(gè)克隆中有2株放線菌目細(xì)菌和5株腸桿菌科細(xì)菌未能鑒定到屬，其余99個(gè)菌株包含了來自19個(gè)屬的至少30種細(xì)菌，冷凍原腸浸泡解凍池水中腸球菌屬(Enterococcus)、變形桿菌屬(Proteus)和芽胞桿菌屬(Bacillus)為優(yōu)勢菌屬。研究中還檢出了沙門菌、葡萄球菌、腸球菌和變形桿菌等致病菌或條件致病菌。目前，國內(nèi)外的成品腸衣主要采用鹽漬(腌制)的方法進(jìn)行保存，但腸衣的鹽漬過程對細(xì)菌芽胞的殺滅效果非常有限[3,17]。國外已有研究發(fā)現(xiàn)，鹽漬腸衣攜帶的細(xì)菌60%以上來自芽胞桿菌屬(Bacillus)[11]?？紤]到國外曾對包括我國在內(nèi)的多個(gè)國家出口的鹽漬腸衣進(jìn)行過監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)僅有來自中國的鹽漬腸衣攜帶還原亞硫酸鹽梭狀芽胞桿菌(sulphite-reducingClostridium)的芽胞水平超過了ENSCA推薦的可接受指標(biāo)，部分樣品甚至超過了最大限量指標(biāo)[17]。因此，對于本研究發(fā)現(xiàn)原腸浸泡解凍池水中芽胞桿菌屬細(xì)菌所占比例偏高的問題要給予關(guān)注。另外，本課題小組曾用人工培養(yǎng)法對冷凍原腸分離的65株細(xì)菌進(jìn)行過研究，發(fā)現(xiàn)腸球菌屬和變形桿菌屬的細(xì)菌所占的比例非常高，這與本研究的結(jié)果比較一致[6]。劉芳等[7]用人工培養(yǎng)法從腌制前的腸衣原料中分離到10株細(xì)菌，鑒定發(fā)現(xiàn)其中4株為腸球菌屬細(xì)菌。這一方面，說明本課題采用研究冷凍原腸的浸泡解凍池水的細(xì)菌多樣性用以反映冷凍原腸的細(xì)菌多樣的思路，在當(dāng)下的確有一定的參考價(jià)值；另一方面，由于近年來腸球菌和變形桿菌導(dǎo)致人和動(dòng)物發(fā)病的報(bào)道越來越多，并且它們的耐藥性問題也越來越突出，這需要引起腸衣加工企業(yè)、腸衣行業(yè)和污水處理的行政主管部門的關(guān)注。

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Analysis of Bacterial Diversity in Thawing Pool Water of Frozen Intestines

QIU Bao-feng1,2,SONG Hong-yan1,3,DONG Rong-lian4,GAO Xue-mei2,JIANG Ying-mei3, GU Bing-quan2,HU Shun-lin1

(1.KeyLaboratoryofJiangsuPreventiveVeterinaryMedicine,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu,225009,China; 2.NantongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Nantong,Jiangsu,226004,China; 3.LaboratoryAnimalCenterofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu,226001,China; 4.JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing,Jiangsu,210009,China)

The aim of this study was to study the bacterial diversity in water of thawing pool for frozen intestines,three water samples were collected and total bacterial genomic DNA was extracted directly.After the 16S rDNA genes were amplified from the total bacterial genomic DNA by PCR,three clone libraries were constructed separately.Positive clones were identified by PCR and then 50 of them in each library were randomly selected for DNA sequencing.Based on the analyses of DNA sequences,it showed that,except 24.00 to 32.00 percent (%) of the unidentified bacteria which including uncultured and unclassified bacteria,the rest bacteria were affiliated with the classes Bacilli,γ-Proteobacteria,Actinobacteria and Flavobacteria,which accounting for 38.00%-42.00%,20.00%-26.00%,4.00%-8.00% and 0-2.00% of the clones in each library,respectively.Further analysis was conducted on the 106 stains of identified bacteria and no consideration was given to 44 unidentified bacteria,the results showed that,except 2 bacteria belonging to Actinomycetales and 5 bacteria belonging to Enterobacteriaceae which could not be further identified,the remaining 99 bacteria belonged to 19 genera and more than 30 species,and the dominant genera wereEnterococcus,ProteusandBacillus.This study revealed that the bacterial diversity in water of thawing pool for frozen intestines is high,and part of them are pathogenic and opportunistic pathogenic strains.

frozen intestine; thawing pool; bacterial diversity; 16S rDNA library

2016-09-15

江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目(K13044)；南通市科技項(xiàng)目(BK2012091和MS12016014)；江蘇檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目(2010KJ35)

仇保豐(1978-)，男，安徽長豐人，獸醫(yī)師，博士，主要從事動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品微生物檢測及研究。*通訊作者

S852.6

A

1007-5038(2017)05-0043-06