戚 帥，秦曉霞，胡桂秋，張 杰，于水星，陳 巍，韓文瑜，楊勇軍

(吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林長春 130062)

?

沙門菌sopB基因缺失誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞死亡的研究

戚 帥△，秦曉霞△，胡桂秋，張 杰，于水星，陳 巍，韓文瑜，楊勇軍*

(吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林長春 130062)

沙門菌是一種胞內(nèi)寄生菌，能夠引起人和多種動物疾病，是一種世界范圍內(nèi)的重要疾病。為了更好理解在沙門氏菌感染過程中效應(yīng)蛋白SopB對巨噬細胞存活的影響，利用鼠傷寒沙門菌SL1344和sopB基因缺失菌株分別感染小鼠骨髓來源的巨噬細胞，對2株菌在巨噬細胞內(nèi)存活情況進行統(tǒng)計。隨后用Western blot檢測DNA修復(fù)酶PARP的剪切情況，通過ELISA檢測培養(yǎng)上清中細胞因子和趨化因子的分泌情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)sopB基因缺失之后，沙門菌在巨噬細胞內(nèi)的存活顯著降低；培養(yǎng)上清中細胞因子和趨化因子分泌增強，巨噬細胞壞死增加。說明sopB基因缺失可促進巨噬細胞壞死。

沙門菌；SopB；巨噬細胞；細胞死亡；壞死

沙門菌是革蘭陰性胞內(nèi)寄生菌，無芽胞，周身具有鞭毛，有2 000多種血清型[1]。沙門菌感染主要通過攝入污染的食物和飲水引起，能夠?qū)е聥雰?、老年人及免疫低下人群嚴重并發(fā)癥甚至死亡，是一種世界范圍內(nèi)的重要疾病。經(jīng)過長期進化，沙門菌獲得多種編碼毒力因子的基因，幫助細菌成功建立感染。表達這些毒力因子的基因構(gòu)成沙門菌毒力島(Salmonellapathogenicity island,SPI)。SPI-1和SPI-2是沙門菌最重要的2個毒力島，決定了沙門菌的侵入以及在細胞內(nèi)的存活。沙門菌一旦被宿主細胞吞噬后，在細胞內(nèi)建立含沙門菌的囊泡(Salmonellacontaining vascular,SCV)，為沙門菌逃避模式識別受體的識別和胞內(nèi)存活提供有利的環(huán)境。SopB是由SPI-1編碼的效應(yīng)分子，具有肌醇磷酸酶活性[2]，在沙門菌感染過程中發(fā)揮重要作用。感染早期，SopB通過肌醇磷酸酶活性募集Rab5和Vps34 PI3-kinase至SCV膜，促進SCV的成熟[3]，隨后通過Rab7依賴的方式獲得溶酶體糖蛋白(只含有微量的組織蛋白酶D)[4]，阻止SCV與溶酶體的融合，有利于沙門菌的復(fù)制。研究表明，SopB通過肌醇磷酸酶活性改變初期SCV的膜電位，導(dǎo)致依賴于強陰離子才能募集的到SCV膜上的蛋白質(zhì)解離，而這些蛋白通常具有促進吞噬溶酶體形成的作用，sopB基因缺失株則引起相反的結(jié)局[5]。

先天性免疫反應(yīng)在抵抗多種病原感染和促進適應(yīng)性免疫反應(yīng)形成方面發(fā)揮著重要作用。巨噬細胞是先天性免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，能夠通過模式識別受體感知病原微生物入侵宿主的首要成分，從而啟動免疫應(yīng)答，形成了先天免疫與適應(yīng)性免疫之間的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于沙門菌能逃逸機體免疫識別，導(dǎo)致延遲的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[6-8]，因此先天性免疫反應(yīng)在抵御沙門菌入侵方面具有重要作用。沙門菌感染期間，病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式啟動先天免疫系統(tǒng)，激活巨噬細胞，產(chǎn)生促炎性細胞因子如白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和γ干擾素(IFN-γ)。巨噬細胞作為哺乳動物體內(nèi)主要的清除細菌的細胞類型[9]，能迅速控制沙門菌感染[10-11]，同時誘導(dǎo)的巨噬細胞死亡作為機體重要的防御機制[12]。一方面，細胞死亡誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)；另一方面，在沙門菌侵襲的過程中，宿主細胞(上皮細胞、巨噬細胞等)分泌大量的細胞因子和趨化因子，限制病原擴散[13]。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠傷寒沙門菌SL1344(Salmonellaentericasubsp.entericaserovar.typhimuriumSL1344)，sopB基因缺失株ΔsopB均由本實驗室保存。rTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA marker購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR引物由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成；ELISA試劑盒均購自R&D公司；aiti-β-tubulin購自北京銳抗生物科技有限公司，anti-rabbit-IgG-HRP、anti-mouse-IgG-HRP抗體購自Santa Cruz公司，anti-PARP抗體購自Cell Signaling technology公司；Triton X-100購自Sigma公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 鼠傷寒沙門菌sopB基因缺失株的鑒定 在沙門菌sopB基因CDS區(qū)兩側(cè)設(shè)計上、下游引物SopB-outer-F、SopB-outer-R，以及sopB基因CDS區(qū)內(nèi)設(shè)計引物SopB-inner-F、SopB-inner-R，引物序列如表1所示。通過以上2對引物鑒定SopB基因的缺失情況。

1.2.2 小鼠骨髓來源巨噬細胞的分離、培養(yǎng)和處理 分離C57BL/6小鼠后肢骨，并置于10 mL RPMI1640(含0.1%雙抗)培養(yǎng)基中。在無菌環(huán)境下，用RPMI1640培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，將沖洗液1 000 r/min 離心10 min，棄上清，用含30% LCCM、10% FBS、0.1% P/S的RPMI1640重懸細胞，隨后接種于90 mm皿中，37℃ 5% CO2培養(yǎng)6 d。第7天用10 g/L胰酶消化，細胞計數(shù)后接種于6孔板或24孔板，過夜培養(yǎng)貼壁。用RPMI1640培養(yǎng)基洗去未貼壁細胞，隨后用SL1344和ΔsopB分別感染細胞(MOI=20)，于感染后1 h棄去培養(yǎng)上清，添加含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于不同時間點收樣。

表1 PCR引物

1.2.3 Western blot檢測 用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液充分裂解細胞，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，取等質(zhì)量蛋白裂解液，加入等體積的甲醇和1/4體積的氯仿，4℃ 13 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL甲醇后離心，棄上清，待液體揮發(fā)完成之后加入15 μL 1×SDS，沸水浴5 min，置于-80℃保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳；75 V冰浴轉(zhuǎn)膜1 h，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h；4℃一抗結(jié)合過夜，1×TBST洗4次，每次15 min；二抗室溫結(jié)合1 h，1×TBST洗4次，每次15 min；ECL顯色，于暗室內(nèi)曝光顯影。

1.2.4 ELISA檢測 按照R&D公司的Duo Set ELISA試劑盒說明書，檢測鼠傷寒沙門菌感染后細胞上清中的細胞因子及趨化因子的分泌情況。

1.2.5 細菌胞內(nèi)存活的測定 鼠傷寒沙門菌感染細胞后，棄去培養(yǎng)上清，加入400 μL 10 g/L Trition X-100充分裂解細胞，將裂解后上清涂于含鏈霉素抗性的LB平板，培養(yǎng)過夜，通過CFU計算細菌的胞內(nèi)存活情況。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad prism 6進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組內(nèi)差異檢驗采用t檢驗,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2 結(jié)果

2.1ΔsopB菌株的鑒定

采用SopB-outer、SopB-inner兩對引物分別對SL1344和ΔsopB菌株進行鑒定。如圖所示，SL1344組分別被SopB-outer和SopB-inner引物擴增出218 bp和1906 bp目的條帶；ΔsopB組分別被SopB-outer和SopB-inner引物擴增出0 bp和290 bp目的條帶。鑒定結(jié)果表明，鼠傷寒沙門菌sopB基因缺失株構(gòu)建成功。

M．DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.SopB-inner引物擴增產(chǎn)物；2.SopB-outer引物擴增產(chǎn)物

2.2ΔsopB菌株在小鼠骨髓來源的巨噬細胞內(nèi)的存活顯著降低

鼠傷寒沙門菌和sopB基因缺失株感染小鼠骨髓來源的巨噬細胞2 h和24 h后，10 g/L Trition X-100充分裂解細胞，統(tǒng)計細胞內(nèi)的細菌數(shù)，以log10(CFU/ml)作為計量資料。結(jié)果如圖2所示，相比于SL1344組，ΔsopB組的細菌胞內(nèi)存活顯著降低。巨噬細胞能夠?qū)Σ≡⑸镞M行主動吞噬，以內(nèi)吞泡的形式包裹病原，隨后與溶酶體結(jié)合，對病原菌進行裂解。沙門菌被吞噬后，能夠形成SCV，而SopB具有促進沙門菌SCV成熟以及抑制吞噬泡與溶酶體融合的作用[14]，故sopB基因缺失后，沙門菌逃逸免疫系統(tǒng)清除的機制減弱，進而在細胞內(nèi)形成吞噬溶酶體，導(dǎo)致ΔsopB在巨噬細胞內(nèi)的存活和復(fù)制顯著降低。

2.3ΔsopB誘導(dǎo)小鼠骨髓來源巨噬細胞死亡增加

巨噬細胞作為機體主要清除病原菌的免疫細胞，在清除病原菌的同時，誘導(dǎo)自身細胞死亡作為機體的防御機制[12]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase，PARP]在細胞DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用。PARP能夠被多種半胱氨酸蛋白酶(caspase)切割，通常認為被切割成的89 ku和24 ku片段與凋亡相關(guān)，72 ku和50 ku片段與壞死相關(guān)。由圖3可知，與SL1344相比，ΔsopB感染巨噬細胞后，50 ku壞死帶表達增強，在沙門菌感染后3 h，差異更為顯著。

Y軸表示每毫升裂解液含有的細菌數(shù)，并以10的對數(shù)表示；X軸表示感染的時間點

圖3 ΔsopB促進細胞死亡

2.4ΔsopB誘導(dǎo)巨噬細胞的炎癥反應(yīng)增強

在沙門菌感染過程中，宿主細胞分泌大量的炎性因子和趨化因子，作為機體清除沙門菌感染的重要機制[13]。由于ΔsopB缺少逃逸機體免疫反應(yīng)的分子機制，能夠誘導(dǎo)機體更強的炎癥反應(yīng)，以利于沙門菌的清除。同時，ΔsopB能夠增強巨噬細胞壞死，不同于細胞凋亡，細胞壞死會產(chǎn)生大量的損傷相關(guān)分子模式，進一步刺激細胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。結(jié)果如圖4所示，ΔsopB感染組分泌產(chǎn)生IL-1β、TNF-α、IL-6、CCL2和CCL5均顯著高于SL1344感染組。即ΔsopB增強巨噬細胞的炎癥反應(yīng)。

3 討論

沙門菌是一種胞內(nèi)病原菌，能夠感染人和多種動物。經(jīng)過長期進化獲得毒力基因，幫助沙門菌成功建立感染，逃逸宿主免疫防御。SopB是由SPI-1編碼的一種重要的毒力基因，在沙門菌侵入和胞內(nèi)存活中發(fā)揮重要作用。有研究表明，SopB具有抑制SCV與溶酶體融合[5]和促進SCV成熟的作用，sopB基因缺失導(dǎo)致SCV成熟受阻，使吞噬泡與溶酶體融合，促進巨噬細胞清除病原；在本研究中有相似的發(fā)現(xiàn)，sopB基因缺失后，細菌在巨噬細胞內(nèi)的存活顯著降低，說明sopB基因缺失株被巨噬細胞吞噬后，由于缺少誘導(dǎo)SCV成熟和抑制溶酶體結(jié)合的機制，導(dǎo)致sopB基因缺失株在細胞內(nèi)的復(fù)制減少，被巨噬細胞裂解增加，因此，sopB基因缺失株的胞內(nèi)存活顯著降低。

Y軸表示每毫升培養(yǎng)上清中所含有的細胞因子或趨化因子的分泌量；X軸表示不同的感染時間點Y-axis represents the secretion of cytokine and chemokines per ml; X-axis represents different time points

鼠傷寒沙門菌可通過Ⅰ型干擾素信號誘導(dǎo)巨噬細胞發(fā)生壞死性凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)沙門菌能夠誘導(dǎo)巨噬細胞壞死，而sopB基因缺失之后，其50 ku壞死條帶表達量顯著增強，說明sopB基因缺失之后，巨噬細胞壞死增加。這種增加的非程序性細胞死亡釋放大量損傷相關(guān)分子模式，導(dǎo)致更加嚴重的不良結(jié)局，包括增強的炎癥反應(yīng)。盡管SopB可誘導(dǎo)AKT發(fā)生磷酸化，促進細胞存活，在沙門菌腸道感染過程中具有重要的保護作用[16-17]，但巨噬細胞作為一種宿主先天性免疫反應(yīng)中重要的免疫細胞，具有主動識別、吞噬和清除病原體的能力，本研究認為ΔsopB誘導(dǎo)巨噬細胞死亡增加，進而釋放大量的損傷相關(guān)分子模式，促進巨噬細胞對病原菌及危險信號進行免疫識別，進而對病原進行清除，SopB的這一作用顯得更為重要。

SopB在促進細胞存活，維持SCV穩(wěn)定，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)以及逃避宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。細胞死亡作為機體清除病原的主要分子機制，對維持機體健康具有非常重要的意義。如圖3所示，ΔsopB增強巨噬細胞壞死。與凋亡過程不同，細胞發(fā)生壞死時，細胞膜會迅速發(fā)生破裂，釋放胞內(nèi)的一系列的損傷相關(guān)分子模式。這些分子可被模式識別受體識別，誘發(fā)機體組織細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而對病原菌的進行清除。而ΔsopB通過何種信號增加細胞壞死還有待于進一步探究。

[1] 郭夢征,陳乃耀,阮海華.沙門菌SopB蛋白在侵襲宿主細胞中的作用機制 [J].環(huán)境與健康雜志,2013,30(6):557-60.

[2] Norris F A,Wilson M P,Wallis T S,et al.SopB,a protein required for virulence ofSalmonelladublin,is an inositol phosphate phosphatase [J].Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95(24):14057-14059.

[3] Mallo G V,Espina M,Smith A C,et al.SopB promotes phosphatidylinositol 3-phosphate formation onSalmonellavacuoles by recruiting Rab5 and Vps34 [J].J Cell Biol,2008,182(4):741-752.

[4] Meresse S,Steele-Mortimer O,Finlay B B,et al.The rab7 GTPase controls the maturation ofSalmonellatyphimurium-containing vacuoles in HeLa cells [J].EMBO J,1999,18(16):4394-4403.

[5] Bakowski M A,Braun V,Lam G Y,et al.The phosphoinositide phosphatase SopB manipulates membrane surface charge and trafficking of the Salmonella-containing vacuole [J].Cell Host Microbe,2010,7(6):453-462.

[6] Luu R A,Gurnani K,Dudani R,et al.Delayed expansion and contraction of CD8+ T cell response during infection with virulentSalmonellatyphimurium[J].J Immunol,2006,177(3):1516-1525.

[7] Albaghdadi H,Robinson N,Finlay B,et al.Selectively reduced intracellular proliferation ofSalmonellaentericaserovartyphimuriumwithin APCs limits antigen presentation and development of a rapid CD8 T cell response [J].J Immunol,2009,183(6):3778-3787.

[8] Vidric M,Bladt A T,Dianzani U,et al.Role for inducible costimulator in control ofSalmonellaentericaserovartyphimuriuminfection in mice [J].Infect Immun,2006,74(2):1050-1061.

[9] Spano S.Mechanisms ofSalmonellatyphihost restriction [J].Adv Exp Med Biol,2016,915:283-294.

[10] O'Brien A D,Scher I,Formal S B.Effect of silica on the innate resistance of inbred mice toSalmonellatyphimuriuminfection [J].Infect Immun,1979,25(2):513-520.

[11] Salcedo S P,Noursadeghi M,Cohen J,et al.Intracellular replication ofSalmonellatyphimuriumstrains in specific subsets of splenic macrophagesinvivo[J].Cell Microbiol,2001,3(9):587-597.

[12] Stockinger S,Decker T.Novel functions of type I interferons revealed by infection studies withListeriamonocytogenes[J].Immunobiology,2008,213(9-10):889-897.

[13] Srikanth C V,Cherayil B J.Intestinal innate immunity and the pathogenesis ofSalmonellaenteritis[J].Immunol Res,2007,37(1):61-78.

[14] Hernandez L D,Hueffer K,Wenk M R,et al.Salmonellamodulates vesicular traffic by altering phosphoinositide metabolism [J].Science,2004,304(5678):1805-1807.

[15] Robinson N,McComb S,Mulligan R,et al.Type I interferon induces necroptosis in macrophages during infection withSalmonellaentericaserovartyphimurium[J].Nat Immunol,2012,13(10):954-962.

[16] Kum W W,Lo B C,Yu H B,et al.Protective role of Akt2 inSalmonellaentericaserovartyphimurium-induced gastroenterocolitis [J].Infect Immun,2011,79(7):2554-2566.

[17] Knodler L A,Finlay B B,Steele-Mortimer O.TheSalmonellaeffector protein SopB protects epithelial cells from apoptosis by sustained activation of Akt [J].J Biol Chem,2005,280(10):9058-9064.

Study on Murine Macrophage Death Induced bySalmonellasopB Gene Delation

QI Shuai,QIN Xiao-xia,HU Gui-qiu,ZHANG Jie,YU Sui-xing,CHEN Wei,HAN Wen-yu,YANG Yong-jun

(CollegeofVeterinaryMedicine,JilinUnversity,Changchun,Jilin,130062,China)

Salmonellais an intracellular pathogen which infection can cause a range of diseases in human and animals worldwide.To investigate the effect of SopB inSalmonella-induced cell death,in this study,bone marrow derived macrophages (BMDMs) were infected with SL1344 andΔsopBrespectively,the interacellular survivals of these two bacteria in BMDMs were investigated.Subsequently,the expression of cleaved PARP was detected via Western blot and the secretion of cytokine and chemokine were examined via ELISA.We found thatΔsopBhas a significant lower intracellular survival; however,the expression of cleaved PARP and the secretion of inflammatory cytokine were increased.Collectively,these results indicated that the SopB deletion could significantly promote the necrosis of macrophage.

Salmonella; SopB; macrophage; cell death; necrosis

2016-11-07

國家自然科學(xué)基金資助項目 (3A411V246604)

戚 帥(1989-)，男，碩士研究生，主要從事天然免疫學(xué)研究?！魍蓉暙I作者。*通訊作者

S852.4

A

1007-5038(2017)05-0038-05