陳指龍，張曉春，薛立群，楊 青

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128)

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環(huán)磷酰胺致小鼠生精障礙作用研究

陳指龍，張曉春，薛立群，楊 青*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128)

為探討不同劑量環(huán)磷酰胺作用不同時間后誘導(dǎo)小鼠生精障礙的作用，將80只雄性ICR系小鼠隨機分成20、40、80 mg/kg體重環(huán)磷酰胺(CTX)處理組和生理鹽水對照組，腹腔注射5 d，每2 d稱重1次，2周和4周后分批檢測睪丸指數(shù)、附睪指數(shù)、精子數(shù)和精子畸形率，并結(jié)合HE染色檢測睪丸組織結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，作用2周時，高劑量的CTX顯著影響體重增長，而中低劑量組只有處理后短時間體重降低明顯；睪丸的生精指數(shù)變化均不顯著，但其組織結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的病理變化。作用4周時，只有高劑量組對體重產(chǎn)生顯著的作用；生精指數(shù)包括睪丸指數(shù)、精子數(shù)以及精子畸形率，3個組與對照相比均表現(xiàn)出明顯差異；睪丸發(fā)生病理學(xué)病變的程度隨劑量的增加而更加明顯。采用40 mg/kg CTX腹腔注射5 d，作用4周后能建立較為理想的小鼠生精障礙模型。

環(huán)磷酰胺；生精障礙；睪丸；小鼠

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)作為一種免疫抑制藥物，它對睪丸的形態(tài)和精子的生成有一定損害，近年來已被廣泛用于構(gòu)建小鼠生精障礙模型，但在使用劑量和作用時間方面還需更多地探究。環(huán)磷酰胺是一種細胞毒性藥物，在體外無生物活性，其毒性主要表現(xiàn)在對活化增殖細胞的影響。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺對人的生殖和動物繁殖均有影響，不僅對生育力有明顯損害，對生殖系統(tǒng)也有潛在致畸危險，它能殺死有絲分裂和進入循環(huán)周期的細胞；也具有較強的免疫抑制作用，主要體現(xiàn)在細胞免疫和體液免疫上[1-2]。有研究表明，無論是灌胃還是腹腔注射，環(huán)磷酰胺均引起小鼠較為嚴(yán)重的免疫抑制，并且在一定范圍內(nèi)，與時間和劑量成正相關(guān)[3-4]。本研究通過不同劑量的環(huán)磷酰胺對小鼠進行腹腔注射，觀察其在不同時間對小鼠生精障礙的影響，旨在為短期構(gòu)建小鼠生精障礙模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 環(huán)磷酰胺，Sigma公司產(chǎn)品；無水乙醚，國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；龍膽紫溶液，中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Bouin's液(苦味酸溶液∶甲醛∶冰醋酸按體積比15∶5∶1配制)；其他均為國產(chǎn)試劑。

1.1.2 實驗動物 4周齡ICR系雄性小鼠，體重20 g左右，SPF級，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。常規(guī)小鼠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境安靜，溫度25℃±2℃，自由攝食和飲水。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 80只小鼠隨機分為4組，分別為對照組、環(huán)磷酰胺低劑量組(CTX-L,20 mg/kg)、環(huán)磷酰胺中劑量組(CTX-M,40 mg/kg)以及環(huán)磷酰胺高劑量組(CTX-H,80 mg/kg)， 每組20只。小鼠適應(yīng)性飼喂3 d后，試驗組分別腹腔注射不同劑量的環(huán)磷酰胺，每天1次，連續(xù)5 d；對照組注射等體積生理鹽水。

1.2.2 體重、睪丸和附睪指數(shù) 試驗過程中每天記錄小鼠飲食，活動以及被毛情況，每2天稱重1次。環(huán)磷酰胺處理結(jié)束后繼續(xù)飼喂2周或4周，用乙醚麻醉后脫頸處死。打開腹腔取出睪丸和附睪稱重，按與體重的比值計算臟器指數(shù)。

1.2.3 精子密度及精子畸形率 將左側(cè)附睪置于1 mL PBS中，用眼科剪成分剪碎，用移液槍輕輕吹打，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，使精子成分游出。將精子懸液按適當(dāng)比例稀釋，取10 μL于細胞計數(shù)板計數(shù)獲得精子密度。另外，取20 μL精子懸液于載波片上進行抹片，自然晾干后用蘇木精染液染色3 min，流水沖洗1 min，空氣中干燥。在光學(xué)顯微鏡下觀察精子形態(tài)，每個抹片觀察5個視野，每個視野確保精子總數(shù)超過100個計算，根據(jù)畸形精子的數(shù)量計算精子畸形率。

1.2.4 睪丸組織形態(tài)學(xué)變化 睪丸稱重后將右側(cè)睪丸置于Bouin's液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片后脫蠟進行HE染色，顯微鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用Spasssatistics軟件進行ONE-WAY ANOVA分析，數(shù)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)磷酰胺對小鼠體重、睪丸和附睪指數(shù)的影響

環(huán)磷酰胺處理后，活動和飲食減少，被毛無光澤，試驗過程中無死亡。體重記錄顯示，環(huán)磷酰胺處理4 d后，高劑量組(80 mg/kg)體重顯著低于對照組(P<0.01)；在第6天時，3個劑量環(huán)磷酰胺處理的小鼠體重均顯著低于對照組，隨后至處理第12 d時，只有高劑量組小鼠體重明顯低于對照組(圖1)。而當(dāng)環(huán)磷酰胺處理4周后，也只有高劑量組小鼠體重比對照組顯著降低(P<0.01)，其余各組間無顯著差異。

** 表示與對照組比較差異極顯著，P<0.01

環(huán)磷酰胺對睪丸和附睪指數(shù)的影響見表1。結(jié)果顯示：當(dāng)環(huán)磷酰胺處理2周時，其睪丸和附睪指數(shù)與對照組相比均無顯著差異；而至4周時，環(huán)磷酰胺各處理組與對照組相比，睪丸指數(shù)顯示降低，且呈劑量依賴性；附睪指數(shù)沒有差異。

表1 環(huán)磷酰胺對小鼠睪丸和附睪指數(shù)的影響

注：數(shù)據(jù)顯示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=10；*表示P<0.05，**P<0.01。

Note:Data display as mean±SD,n=10; * meansP<0.05,and **P<0.01.

2.2 環(huán)磷酰胺處理對精子及其畸形率的影響

環(huán)磷酰胺處理2周后，雖然精子數(shù)相對于對照有下降趨勢，但無顯著性差異(結(jié)果未顯示)。當(dāng)處理4周后，與對照組相比，3個試驗組的精子數(shù)均顯著降低，其中低劑量組P<0.05，高劑量和中劑量組P<0.01。高劑量組精子畸形率顯著高于對照組，而低劑量和中劑量組與對照差異不顯著(P>0.05)(表2)。

2.3 環(huán)磷酰胺處理對睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響

正常對照組睪丸組織中其生精小管連接緊密，基膜完整，管腔飽滿，界膜清晰，睪丸間質(zhì)細胞排列有序，結(jié)締組織血管豐富，生精細胞厚度適中，精子細胞豐富，管腔液較多(圖2 A和E)。當(dāng)CTX處理2周后，低劑量和中劑量處理使睪丸組織形態(tài)學(xué)發(fā)生一定的變化，主要表現(xiàn)為生精細胞間的連接不緊密(圖2 B和C)；而高濃度的環(huán)磷酰胺導(dǎo)致明顯病變，主要表現(xiàn)為生精上皮較薄，基膜破裂，生精細胞松散、連接疏松，腔內(nèi)空腔較大，無管腔液(圖2 C)。當(dāng)用CTX處理4周時，各劑量處理組對睪丸的組織結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)出不同程度的損傷。低劑量組表現(xiàn)為生精上皮變薄，生精細胞連接不緊密，生精細胞層數(shù)適中，可見排列整齊的精子細胞，管腔內(nèi)有一定數(shù)量精子(圖2 F)；中劑量組睪丸中上皮變薄，生精細胞層數(shù)減少，細胞連接不緊密，成熟精子細胞數(shù)量較少，管腔內(nèi)可見少量精子(圖2 G)；而高劑量的環(huán)磷酰胺導(dǎo)致生精小管變形，有些甚至塌陷，生精上皮明顯變薄，基膜破裂，生精細胞脫落，生精細胞層數(shù)明顯減少，無精子細胞，管腔內(nèi)無精子，睪丸間質(zhì)細胞變少，連接不緊密(圖2 H)。

表2 環(huán)磷酰胺對小鼠精子數(shù)和精子畸形率的影響

注：數(shù)據(jù)顯示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=10；*P<0.05，**P<0.01。

Note:Data display as mean±SD,n=10; *P<0.05, **P<0.01.

A和E：對照組；B和F：20 mg/kg CTX；C和G：40 mg/kg CTX；D和H：80 mg/kg CTX。BV：血管；LC：間質(zhì)細胞；LP：基膜；SC：精母細胞；SG：精原細胞；SP：精細胞

3 討論

環(huán)磷酰胺作為一種應(yīng)用較為廣泛的烷化劑類抗腫瘤藥，常用于治療多種腫瘤、狼瘡性腎炎等疾病，但由于它可與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)而抑制DNA的合成，產(chǎn)生較大的毒副作用。在雌性生殖系統(tǒng)中，一定劑量的環(huán)磷酰胺對卵泡發(fā)育產(chǎn)生一定毒副作用而影響動物的妊娠[1,5]；而在雄性動物中，一定劑量的環(huán)磷酰胺可抑制精原干細胞的增殖和分化，使生精細胞減少、生精細胞凋亡、睪丸氧化應(yīng)激損傷、睪酮合成障礙，損傷生殖細胞遺傳物質(zhì)，損害支持細胞功能等[6-9]。因此，在一些生殖毒性相關(guān)的毒理學(xué)安全試驗評價中，常以環(huán)磷酰胺作陽性參照物[2,5]。

研究環(huán)磷酰胺致小鼠睪丸染色體畸變的試驗中，阮海星等[10]用常規(guī)推薦的環(huán)磷酰胺劑量40 mg/kg體重處理小鼠發(fā)現(xiàn)有動物發(fā)生死亡，對初級精母細胞染色體畸變試驗不理想，而且對骨髓造血系統(tǒng)有一定損傷。本研究中，使用該劑量或更大劑量的環(huán)磷酰胺連續(xù)處理5 d后，繼續(xù)觀察2周或4周均未導(dǎo)致實驗動物的死亡，但對體重增長有明顯的影響，這可能是由于動物品系不同導(dǎo)致一定的偏差。

據(jù)Elangovan N等[11]研究用50 mg/kg體重至200 mg/kg體重等不同劑量的環(huán)磷酰胺每周處理小鼠一次并連續(xù)處理5周，最后一次處理后的第1周或5周分別對其體重增長和生精指數(shù)進行檢測，發(fā)現(xiàn)處理結(jié)束后只有高劑量200 mg/kg體重導(dǎo)致體重低于對照組；小鼠睪丸指數(shù)在處理結(jié)束的短時間內(nèi)顯著降低，且呈劑量依賴；另外精子活力、精子數(shù)、完整頂體率以及受精能力也出現(xiàn)不同程度的影響，而處理結(jié)束后5周檢測時，除了高劑量組(200 mg/kg體重)外，其余各劑量處理組的以上所述的生精指數(shù)均能得以修復(fù)。Lu W P等[12-13]在研究相關(guān)藥物抗氧化作用時，分別用100 mg/kg體重和15 mg/kg體重的環(huán)磷酰胺構(gòu)建小鼠氧化損傷模型，同樣腹腔注射連續(xù)5周，每周1次，處理結(jié)束時取得了較理想的致生精障礙效果。以上研究中環(huán)磷酰胺處理時間較長，且造成的氧化損傷能在一定的時間內(nèi)得以修復(fù)，為在短時間內(nèi)構(gòu)建小鼠生精障礙模型，一些研究通過腹腔注射環(huán)磷酰胺5 d左右以達到損傷效果[14-15]。

環(huán)磷酰胺作為一種致突變劑，常用于雄性小鼠的顯性致死性試驗和精子畸變研究，早期研究表明用40 mg/kg體重劑量的環(huán)磷酰胺連續(xù)處理小鼠5 d時，能導(dǎo)致染色體畸形，并對機體組織和生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性[16-17]。本研究摸索了連續(xù)5 d腹腔注射三種不同劑量的環(huán)磷酰胺對小鼠生精障礙的影響，從體重來看，處理結(jié)束后即第6天小鼠體重均明顯降低，而隨著時間的延長，只有高劑量組對體重產(chǎn)生顯著的毒副作用，這與Elangovan N等[11]研究中所用高劑量所導(dǎo)致的結(jié)果一致。從相關(guān)生精指數(shù)來看，環(huán)磷酰胺處理結(jié)束后短時間對生精指數(shù)產(chǎn)生的作用不明顯，但其睪丸組織結(jié)構(gòu)已發(fā)生一些病變，特別是高濃度的環(huán)磷酰胺使得生精上皮變薄，生精細胞松散嚴(yán)重，基膜發(fā)生破裂以及出現(xiàn)較大空腔，無管腔液等。隨著作用時間延長至4周時，3種劑量導(dǎo)致的病理變化均顯著，其他生精指數(shù)包括睪丸指數(shù)和精子數(shù)都顯著下降，高劑量組精子畸形率增加顯著，且劑量40 mg/kg體重效果較理想。從以上結(jié)果來看，環(huán)磷酰胺短時間連續(xù)處理所致的生精障礙并沒有隨時間的延長而得以修復(fù)。

本研究結(jié)果表明，用環(huán)磷酰胺建立一個較理想的小鼠生精障礙模型，從體重增長、相關(guān)生精指數(shù)的變化等方面評估，用40 mg/kg體重的劑量，連續(xù)腹腔注射5 d，每天1次，處理結(jié)束后4周能產(chǎn)生較顯著的作用，但對于其受精能力以后受精后對應(yīng)母鼠的繁殖情況還需做進一步研究。該模型的建立對于抗氧化損傷藥物的研發(fā)、生殖毒性以及致畸致突變等相關(guān)研究提供較理想的工具。

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Effect of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogenic Obstacles

CHEN Zhi-long，ZHANG Xiao-chun，XUE Li-qun，YANG Qing

(CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan，410128,China)

This study aimed to explore the effects of different doses of cyclophosphamide (CTX) on mouse spermatogenic obstacles.Eighty male ICR mice were randomly divided into three CTX-treated groups (20,40 and 80 mg/kg body weight (BW)) and normal saline control group with intraperitoneal injection for 5 days,weighed every 2 days.Spermatogenic indexes including testis and epididymis indexes,sperm counts and abnormality rate were recorded,and histopathological changes were checked using HE staining.The results showed that high dose of CTX significantly affected mouse body weight when treated for 2 weeks,and the medium and low doses only caused effects shortly after treatment.There is no significant difference in testicular spermatogenic indexes,but testis exhibited different degrees of pathological lesions.After treated for 4 weeks,only body weight from the high dose group significantly decreased when compared to the control.Testis index and sperm number were decreased in mice treated with CTX; testicular pathological lesions were obvious with a dose-dependent manner.Conclusion:intraperitoneal injection of CTX with a dose of 40 mg/kg BW could establish an ideal model for mouse spermatogenesis obstacles after 4 weeks.

cyclophosphamide; spermatogenic obstacle; testis; mouse

2016-08-31

國家自然科學(xué)基金項目 (31572591;31272630)；作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點實驗室(省部共建國家重點實驗室培育基地)科學(xué)基金開放項目(12KFXM02)

陳指龍(1993-)，男，江西贛州人，碩士研究生，主要從事動物繁殖研究。*通訊作者

S857.22

A

1007-5038(2017)05-0034-05